最新微生物的培养与应用PPT课件.ppt

微生物的培养与应用微生物的类群微生物的类群原生生物原生生物原核生物原核生物真菌真菌病毒病毒如酵母菌如酵母菌单细胞的动植物单细胞的动植物如草履虫、单细胞藻类等如草履虫、单细胞藻类等微生物包含了除微生物包含了除植物界植物界和和动物界动物界以外的所有生物以外的所有生物无细胞结构无细胞结构真核细胞真核细胞细菌、蓝藻细菌、蓝藻 原核细胞原核细胞（2）天然培养基和合成培养基天然培养基和合成培养基天然培养基：（工业生产降低成本）天然培养基：（工业生产降低成本）主要取自动物体液或从动物组织分离提取。主要取自动物体液或从动物组织分离提取。其优点其优点是营养成分丰富，培养效果良好，缺点是成分复是营养成分丰富，培养效果良好，缺点是成分复杂，来源受限。天然培养基杂，来源受限。天然培养基/液的种类很多，包液的种类很多，包括生物性液体（如血清）；组织浸液（如胚胎浸括生物性液体（如血清）；组织浸液（如胚胎浸液）；凝固剂（如血浆）等。液）；凝固剂（如血浆）等。合成培养基：（菌种的分类，鉴定，营养、代谢合成培养基：（菌种的分类，鉴定，营养、代谢 ，遗传、鉴定和生物测定等定量要求较高的研究），遗传、鉴定和生物测定等定量要求较高的研究）是通过顺序加入准确称量的高纯度化学试剂与蒸是通过顺序加入准确称量的高纯度化学试剂与蒸馏水配制而成的。馏水配制而成的。其所含的成分（包括微量元素其所含的成分（包括微量元素在内）以及他们的量都是确切可知的。在内）以及他们的量都是确切可知的。（三）选择培养基和鉴别培养基：选择培养基：配制特点：添加或减少某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需微生物的生长。从而使后者从含有杂菌的标本中分离从而使后者从含有杂菌的标本中分离出。（即出。（即筛选你所需要培养的微生物，令其生长，其余筛选你所需要培养的微生物，令其生长，其余微生物不生长微生物不生长）例如：(1)(1)基本的培养基通过加青霉素，实现分离纯化酵母菌、基本的培养基通过加青霉素，实现分离纯化酵母菌、霉菌；霉菌；（2 2）加高浓度的食盐分离纯化金黄色葡萄球菌（有高度加高浓度的食盐分离纯化金黄色葡萄球菌（有高度的耐盐性，可在的耐盐性，可在1015%NaCl1015%NaCl肉汤中生长肉汤中生长）（3 3）无氮培养基可分离纯化固氮菌（固氮细菌无氮培养基可分离纯化固氮菌（固氮细菌）。（4 4）不含有机碳的培养基可分离纯化自养型细菌如硝化不含有机碳的培养基可分离纯化自养型细菌如硝化细菌。细菌。鉴别培养基：配制特点：在培养基中加入某种指示剂或化学药品，以鉴别不同种类的微生物。（即只能鉴别出你此种微生物是不是你所需要的微生只能鉴别出你此种微生物是不是你所需要的微生物，而不能抑制其余种类的微生物生长物，而不能抑制其余种类的微生物生长 ）例如：伊红美蓝培养基（1）用途：伊红美篮培养基一般用于检测）用途：伊红美篮培养基一般用于检测饮用水饮用水和乳制品中是否存在和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌。大肠杆菌等细菌。（2 2）原理）原理：伊红为酸性染料，美篮为碱性染料。：伊红为酸性染料，美篮为碱性染料。当大肠杆菌分解当大肠杆菌分解乳糖产酸乳糖产酸时细菌带正电荷被染成时细菌带正电荷被染成红色红色，再与，再与美篮美篮结合形成结合形成紫黑色紫黑色菌落，并带有菌落，并带有金金属光泽。属光泽。例例1 1、下列物质可作为培养硝化细菌碳源、氮源和、下列物质可作为培养硝化细菌碳源、氮源和能源的依次是能源的依次是 （）A A含碳无机物、氨、氨含碳无机物、氨、氨B B含碳无机物、氮、硝酸盐含碳无机物、氮、硝酸盐C C含碳有机物、氨、光含碳有机物、氨、光D D含碳有机物、硝酸盐、氨含碳有机物、硝酸盐、氨例例2 2、要将土壤中的自生固氮菌（如原褐固氮菌）、要将土壤中的自生固氮菌（如原褐固氮菌）与其它细菌分离出来，应将它们接种到（与其它细菌分离出来，应将它们接种到（）A A加入指示剂的鉴别培养基加入指示剂的鉴别培养基 B B含有蛋白胨含有蛋白胨的固体培养基的固体培养基C C没有有机氮的选择培养基没有有机氮的选择培养基 D D营养要素全营养要素全面的液体培养基面的液体培养基练一练练一练例例3 3、某同学在做微生物实验时，不小心把原褐固、某同学在做微生物实验时，不小心把原褐固氮菌和酵母菌混在一起，为了得到纯度较高的酵氮菌和酵母菌混在一起，为了得到纯度较高的酵母菌，配制好的培养基中应再加入母菌，配制好的培养基中应再加入（）A A高浓度的食盐高浓度的食盐 B B硝酸盐硝酸盐 C C伊红美蓝溶液伊红美蓝溶液 D D青霉素青霉素例例4 4、在培养金黄色葡萄球菌时污染了青霉菌，青、在培养金黄色葡萄球菌时污染了青霉菌，青霉菌菌落周围区域内金黄色葡萄球菌不能生存。霉菌菌落周围区域内金黄色葡萄球菌不能生存。下列相关叙述错误的是下列相关叙述错误的是 （）A A青霉菌和金黄色葡萄球菌之间的关系为竞争青霉菌和金黄色葡萄球菌之间的关系为竞争B B要保留金黄色葡萄球菌，可用含高浓度食盐的要保留金黄色葡萄球菌，可用含高浓度食盐的培养基进行选择培养基进行选择C C若金黄色葡萄球菌仍然生存，可能发生了抗青若金黄色葡萄球菌仍然生存，可能发生了抗青霉素的基因突变霉素的基因突变D D补充适合金黄色葡萄球菌的营养能保存该菌补充适合金黄色葡萄球菌的营养能保存该菌（二）培养基配制原则（二）培养基配制原则：（1 1）目的要明确目的要明确：根据微生物的种类、培养目的等确定：根据微生物的种类、培养目的等确定配制培养基的种类，因为不同的微生物对培养物质的配制培养基的种类，因为不同的微生物对培养物质的需求不同。需求不同。（2 2）营养要协调营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。：注意各种营养物质的浓度和比例。（3 3）pHpH要适宜要适宜：各种微生物适宜生长的：各种微生物适宜生长的pHpH范围不同。范围不同。细菌细菌pHpH为：为：6.5-7.56.5-7.5（偏碱）；（偏碱）；放线菌放线菌pHpH为：为：7.5-8.57.5-8.5；真菌真菌pHpH为：为：5.0-6.05.0-6.0（偏酸）。（偏酸）。微生物需要的四大类营养要素物质是：微生物需要的四大类营养要素物质是：（三）培养基的构成（三）培养基的构成1.1.碳源碳源 2.2.氮源氮源 3.3.无机盐无机盐 4.4.水水凡是能为微生物提供所需碳元素的营凡是能为微生物提供所需碳元素的营养物质。养物质。无机碳源：无机碳源：COCO2 2；NaHCO3NaHCO3；碳酸盐等；碳酸盐等有机碳源：有机碳源：糖类、脂肪酸、蛋白糖类、脂肪酸、蛋白质、花生粉饼、石油等质、花生粉饼、石油等概念概念来源：来源：不同微生物所利用的碳源不同：不同微生物所利用的碳源不同：1.1.微生物的碳源微生物的碳源a.异养型微生物的碳源为：异养型微生物的碳源为：含碳有机物（有机碳）含碳有机物（有机碳）b.自养型微生物的碳源为：自养型微生物的碳源为：含碳无机物（无机碳）含碳无机物（无机碳）无机氮源：无机氮源：无机氮源：无机氮源：N N N N2 2 2 2、NHNHNHNH4 4 4 4+氨盐氨盐、NONONONO3 3 3 3-硝酸盐硝酸盐、NHNHNHNH3 3 3 3。有机氮源：有机氮源：有机氮源：有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等基酸等基酸等基酸等凡是能够为微生物提供凡是能够为微生物提供凡是能够为微生物提供凡是能够为微生物提供N N N N元素的营养物质。元素的营养物质。元素的营养物质。元素的营养物质。2.2.微生物的氮源微生物的氮源概念：概念：概念：概念：来源：来源：来源：来源：固氮微生物所利用的氮源是：固氮微生物所利用的氮源是：固氮微生物所利用的氮源是：固氮微生物所利用的氮源是：3.3.特殊要求特殊要求培养基还需要满足微生物生长对培养基还需要满足微生物生长对培养基还需要满足微生物生长对培养基还需要满足微生物生长对pHpHpHpH、特殊营养物质特殊营养物质特殊营养物质特殊营养物质,例如例如例如例如:生长因子生长因子生长因子生长因子(微生物生长不可缺少的微生物生长不可缺少的微生物生长不可缺少的微生物生长不可缺少的微量微量微量微量有机物）有机物）有机物）有机物）如维生素、某些氨基酸、碱基如维生素、某些氨基酸、碱基如维生素、某些氨基酸、碱基如维生素、某些氨基酸、碱基)以及以及以及以及氧气氧气氧气氧气、二氧化碳二氧化碳二氧化碳二氧化碳、渗透压渗透压渗透压渗透压等等等等的要求。的要求。的要求。的要求。氮气氮气碳源、氮源、生长因子的比较碳源、氮源、生长因子的比较来来 源源常用原料常用原料功功 能能碳源CO2、NaHCO3、糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等糖类构成细胞物质构成细胞物质和一些代谢产和一些代谢产物，有些还是物，有些还是异养生物的主异养生物的主要能源物质要能源物质氮源N2、NH3、铵盐、硝酸盐、尿素、牛肉膏和蛋白胨等铵盐、硝酸盐等合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物生长因子维生素、氨基酸、碱基酶、核酸等的组成成分牛肉膏当中含有牛肉膏当中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类。有机酸类、矿物质类及维生素类。的水溶性物质。的水溶性物质。牛肉膏为微生物提供碳牛肉膏为微生物提供碳源源、氮源、氮源、能源、磷酸盐和维生素，能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供蛋白胨主要提供氮源氮源和和维生素维生素。1.1.无菌范围：无菌范围：实验操作空间实验操作空间,操作者的手、衣着操作者的手、衣着消毒消毒.将用于微生物培养的将用于微生物培养的器皿、接种器皿、接种用具和培养基用具和培养基等器具进行灭菌。等器具进行灭菌。为避免周围环境中微生物的污染，为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在实验操作应在酒精灯火焰附近酒精灯火焰附近进行进行.实验操作时应避免已经实验操作时应避免已经灭菌处理灭菌处理的材料用具的材料用具与周围的物品相接触与周围的物品相接触.超净工作台超净工作台二二.无菌技术：无菌技术：防止外来杂菌的污染防止外来杂菌的污染耐高温需保持干燥的耐高温需保持干燥的 物品，物品，160170 12小时小时接种环、接种针等接种环、接种针等 金属用具金属用具7075、30min 80、15min100、56min消毒消毒灭菌灭菌定义定义方法方法较为较为温和温和理化方法，理化方法，杀死杀死部分有害菌体部分有害菌体（不不包括芽孢、孢子）包括芽孢、孢子）强烈强烈的理化方法，的理化方法，杀死杀死所有微生物所有微生物（包括（包括芽孢、孢子芽孢、孢子）煮沸消毒法煮沸消毒法巴氏消毒法巴氏消毒法化学药剂化学药剂紫外线紫外线灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌干热灭菌酒精、氯气、石炭酸等酒精、氯气、石炭酸等高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌培养基，培养基，100KPa、121、1530min2.2.消毒与灭菌：消毒与灭菌：灼烧灼烧灭菌灭菌干热灭菌箱干热灭菌箱高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅1.1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。菌。如果需要，请选择合适的方法。（1 1）培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2）玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3）实验操作者的双手实验操作者的双手 答：无菌技术还能有效避免操作者自答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。身被微生物感染。答：（答：（1）、（）、（2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3）需要消毒）需要消毒。1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O 定容至定容至1000mlNacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g琼脂琼脂20.0g三三.大肠杆菌的大肠杆菌的纯化纯化培养：培养：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.1.计算：计算：培养基用量培养基用量依配方计算各成分的用量依配方计算各成分的用量2.2.称量：称量：3.3.溶化：溶化：牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解、少量水加热溶解 取纸取纸蛋白胨、蛋白胨、NaClNaCl琼脂琼脂 补水定容补水定容4.4.调调pHpH、分装、封口：、分装、封口：1mol1mollNaoH调制微碱调制微碱5.5.灭菌：灭菌：6.6.倒平板：倒平板：培养基、培养皿培养基、培养皿由由一个细胞一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，就是菌落繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，就是菌落倒平板倒平板约约50防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染灼烧灭菌，灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基防止瓶口的微生物污染培养基1.1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50 50 左右时，左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？的温度？答：答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。行倒平板了。2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。污染培养基。3.3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。微生物。纯化大肠杆菌：纯化大肠杆菌：1.1.纯化的方法：纯化的方法：（1 1）平板划线法：）平板划线法：通过接种环在琼脂通过接种环在琼脂固体培养基固体培养基表面表面连续画线操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表连续画线操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，在数次画线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来面，在数次画线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的子细胞群体，这就是菌落。的子细胞群体，这就是菌落。（2 2）稀释涂布平板法：）稀释涂布平板法：将菌液进行将菌液进行一系列的梯度稀释，一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基固体培养基的表的表面进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微面进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而在培养基表面形成单个菌生物将被分散成单个细胞，从而在培养基表面形成单个菌落。落。将接种环放在火将接种环放在火焰上灼烧，直到焰上灼烧，直到接种环接种环_在在_旁冷旁冷却接种环，并却接种环，并打开棉塞打开棉塞 将试管口通过火焰将试管口通过火焰 .将已将已_的接种环伸的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液入菌液中蘸取一环菌液 左手将皿盖打开一条缝隙，右手左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，板内，划划_条平行线，条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。盖上皿盖。注意不要划破培养基。.将试管通过火将试管通过火焰，并塞上棉塞焰，并塞上棉塞 火焰火焰冷却冷却三至五三至五灼烧接种环，待其冷却后，从灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的第一区域划线的_开始开始往第二区域内划线。重复以上往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划操作，在三、四、五区域内划线。线。注意不要将最后一区的划注意不要将最后一区的划线与第一区相连。线与第一区相连。末端末端烧红烧红将平板将平板_放放入培养箱中培养。入培养箱中培养。倒置倒置划划3 3个平板个平板1 1个不划线个不划线（空白对照）（空白对照）1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的答：操作的第一步第一步灼烧接种环是为了避免接种环灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前每次划线前灼灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。便得到菌落。划线结束后灼烧接种环划线结束后灼烧接种环，能及时杀，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。染操作者。2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。落。6 6支试管，分别加入支试管，分别加入9ml9ml无菌水无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：a.a.梯度稀释菌液：梯度稀释菌液：菌液菌液微量微量 移移液器液器b.b.涂布平板：涂布平板：不超过不超过0.1ml0.1ml各梯度分别涂布各梯度分别涂布3个平板个平板1 1个不涂布作空白对照个不涂布作空白对照滴滴灼灼试试涂涂稀稀释释10103 3倍倍稀稀释释10104 4倍倍稀稀释释10105 5倍倍2.2.菌种培养菌种培养：3.3.实验结果观察实验结果观察将将接种后接种后的培养基和一个的培养基和一个未接种未接种的培养基的培养基放入放入3737恒温箱中培养恒温箱中培养12h12h24h24h后，后，观察并记录观察并记录四四.菌种的保藏：菌种的保藏：1.1.临时保藏：临时保藏：试管固体斜面培养基上试管固体斜面培养基上442.2.长期保存：长期保存：菌种易被污染、变异菌种易被污染、变异甘油管藏甘油管藏1ml1ml甘油甘油1ml1ml菌液菌液2020