《实验二酵母蔗糖酶》PPT课件.ppt

实验二、酵母蔗糖酶的提取和实验二、酵母蔗糖酶的提取和酶活测定酶活测定实验目的实验目的n学习提取酵母蔗糖酶和测定酶活力的方法；n学习提取生物活性大分子的方法。实验材料实验材料n材料：活性干酵母粉、石英砂；n试剂：95冰乙醇、DNS液、PBS（）、5蔗糖溶液、1N NaOH溶液；n仪器：水浴锅、高速冷冻离心机、722型分光 光度计。实验原理实验原理n蔗糖酶的提取过程和酶活的测定方法；n蛋白质等生物活性大分子的提取方法。（自学）提取工艺和酶活测定n蔗糖酶蔗糖酶1.蔗糖酶的耐热温度为50度，45度以下可保持酶活不变；在范围内均可保持较高的酶活；2.蔗糖酶的活性中心有巯基，因此在提取时应防止其被氧化，或者加入还原剂（如Vc）保持酶活力；3.酵母细胞存在两种蔗糖酶，一种在细胞壁中，一种在细胞质内，前者活力较高，分子量较大（约270KDa），后者活力较低，分子量约为135KDa，两种酶的底物专一性和动力学性质十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶。n提取工艺提取工艺1.破碎酵母细胞的方法：破碎酵母细胞的方法：蔗糖酶分子量较大，一般采用研磨法彻底破碎细胞使其释放出来，但应注意研磨过程中保持低温防止酶失活；或者采用自溶法（适当的酸度和温度下利用酵母菌自身的酶系破坏细胞壁），此方法较为温和，但是时间较长，需加入少量防腐剂，防止过程中外界细菌污染；化学渗透法等较温和的非机械法。原则：原则：低温，处理时间短，防止酶失活。2.选择性热变性：选择性热变性：根据蔗糖酶的耐热性质，将热不稳定性杂蛋白变性除去，而蔗糖酶保持活性仍在上清液中；该法简便易行。原则：原则：1、选择合适的温度和加热时间，防止目的物变性，2、溶液的蛋白质浓度要合适，防止蔗糖酶与杂蛋白共沉淀。3.有机溶剂沉淀法：有机溶剂沉淀法：根据蔗糖酶的分子量和亲水性，在溶液中加入一定量的无水乙醇溶 液，利用其脱水作用，破坏了蛋白质分子表面的水化膜，使蔗糖酶 聚集沉淀下来，而与其它杂质分开。一般采用分级沉淀法摸索目的 物沉淀的条件。原则：原则：1、注意在低温下操作，故无水乙醇要预冷；2、边加乙醇边搅拌溶液，防止局部乙醇过浓，导致酶变性失活；3、离心后应迅速将上清倒出，沉淀物用缓冲液溶解，避免酶与有 机溶剂长时间接触，防止其变性。n测定酶活的原理测定酶活的原理1.蔗糖酶可作用于1，2糖苷键，将蔗糖水解为D葡萄糖和D果糖；Cu2+、Zn2+、Fe2+是其激活剂，Mn2+是其抑制剂。2.葡萄糖和果糖具有还原性，在偏碱性条件下，可与3，5二硝基水杨酸共热后生成棕红色物质，在一定浓度范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度成正比例关系。3.蔗糖酶的活力通过其水解生成的还原糖量来反映。n提取酶注意事项提取酶注意事项1.了解目的物的分子量、酸碱稳定性、热稳定性，选择合适的提取条件；2.提取过程中采用缓冲液系统溶解酶，并可添加一些保护剂（如还原剂、金属螯合剂等）；3.提取过程一般保持低温、避免剧烈搅拌、强酸、强碱等变性的因素；4.一般先选择分辨率低处理量大的方法（如萃取、沉淀、吸附）浓缩酶，再采用分辨率高的方法（如离子交换层析、亲和层析、超滤）精制；5.通过酶活测定，调节提取条件。生物活性大分子的提取方法自学书P3641实验步骤实验步骤n反复冻融法破碎酵母细胞反复冻融法破碎酵母细胞 称取1g活性干酵母泥，石英砂，置于预冷的研钵中，研磨至粉状，加入5mLPBS（），混合均匀，研磨5min,20度冷冻，再研磨5min；n离心获得粗酶液离心获得粗酶液 吸取约4mL酵母细胞破碎液于离心管中，8000rpm 5min，保留上清液；粗酶液粗酶液n分离纯化获得纯酶液分离纯化获得纯酶液1.吸取剩余的约2mL酵母细胞破碎液于离心管中，45度水浴10min，缓慢搅拌，迅速冰浴冷却，12000rpm 5min，保留上清液；选择性热变性除去杂蛋白选择性热变性除去杂蛋白2.将上清液置于离心管中，加入等体积预冷的无水乙醇（乙醇终浓度约50），20度静置1520min，12000rpm 5min，保留沉淀物；有机溶剂沉淀法获得蔗糖酶有机溶剂沉淀法获得蔗糖酶3.每管加入1mLPBS（）于沉淀物中，轻轻搅拌促溶；纯酶纯酶液液n酶活测定酶活测定1.蔗糖酶将底物水解为还原糖蔗糖酶将底物水解为还原糖试剂（均（均35度预度预热）热）粗酶液组粗酶液组纯酶液组纯酶液组测定组1对照组1测定组2对照组2酶液（mL）1.01.01.01.01N NaOH液（mL）0.50.55%蔗糖液（mL）2.02.02.02.035度水浴10min，自来水冷却1N NaOH液（mL）0.50.52、DNS法测定还原糖量法测定还原糖量试剂粗酶液组纯酶液组测定组1对照组1测定组2对照组2水解液（mL）1111蒸馏水（mL）0.50.50.50.5DNS液（mL）1.01.01.01.0沸水浴5min，自来水冷却，稀释至10mL，以对照组调零以对照组调零，记录测定组OD540nm。实验结果实验结果n计算酶活力计算酶活力 将吸光值代入实验一葡萄糖标准曲线，得到水解液中还原糖的毫克数 酶活力（酶活力（U/mL）还原糖毫克数（水解液体积）还原糖毫克数（水解液体积）蔗糖酶活力定义：蔗糖酶活力定义：在一定实验条件下，在规定时间内释放1mg还原糖的酶量为一活力单位。n计算蔗糖酶得率计算蔗糖酶得率 得率纯酶液活力得率纯酶液活力/粗酶液活力粗酶液活力思考题思考题n简述影响蔗糖酶得率的因素。n根据蛋白质理化性质，列出蛋白质分离纯化的主要方法。