《基因引物设计》PPT课件.ppt

常用实验技术简介黄雪娜2011-8-4目目 录录n全长cDNA克隆n引物设计n染色体步移技术全长全长cDNA克隆克隆n是许多后续更深入实验的基础；n真核生物mRNA的特征及转录过程的了解；n全长cDNA克隆方法：灵活掌握；同源克隆技术RACE-PCR技术基因克隆前的准备工作基因克隆前的准备工作n看有没有被别人克隆出来；n查看文献了解基因的功能及表达特征；n了解该基因可能涉及的工作（如激酶活性的测定及DNA-蛋白相互作用等），制定计划；n了解相近物种该基因的信息，以利于扩增过程中预测PCR的延伸时间；同源片段的克隆同源片段的克隆n本实验室的EST数据库；nNCBI数据库；nRT-PCR用兼并引物扩增同源片段；设计兼并引物是重点！注意事项：注意事项：n高质量的mRNA和高效率的逆转录；n加大引物浓度；n选择mRNA表达量高的组织做模板；n梯度PCR或者降落PCR；n巢氏PCR;n序列分析；3RACE:n原理：5RACEn原理：注意事项：注意事项：nRNA的完整性；的完整性；n高效的逆转录酶；高效的逆转录酶；n多次多次5RACE相结合；相结合；n应用丰度高的组织做模板；应用丰度高的组织做模板；n长片段扩增应用长片段扩增应用LA-Taq酶；酶；n同源克隆方法；同源克隆方法；n用随机引物或者用随机引物或者OligoT引导逆转录；引导逆转录；序列分析序列分析n引物设计：；n一般的序列处理：DNAStar中的Editseq；n序列拼接：DNAStar中的Seqman、BL2；n序列在线比对：NCBI-BLAST()；n序列多重比对：Bioedit、ClustalW2()；n寻找ORF:Editseq、ORFFinder()；n序列作图：Bioedit、EMBOSS()；n构建进化树；n蛋白结构域分析：SMART()；n蛋白理化性质分析及二、三级结构分析：EXPASY()、Psipred()；n信号肽分析：SignalP()；n磷酸化位点分析：NetPhos2.0Server()；n糖基化位点：NetNGlyc1.0Server()；引物设计引物设计n兼并引物nRACE引物n荧光定量引物n染色体步移引物n原核表达用引物nPCR-SSCP引物总原则总原则n引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。n产物不能形成二级结构。n引物长度一般在1530碱基之间。nG+C含量在40%60%之间。n碱基要随机分布。n引物自身不能有连续4个碱基的互补。n引物之间不能有连续4个碱基的互补。n引物5端可以修饰。n引物3端不可修饰。n引物3端要避开密码子的第3位。兼并引物兼并引物n兼并碱基：M=A/CR=A/GW=A/TS=G/CY=C/TK=G/TV=A/G/CH=A/G/TD=A/G/TB=G/C/TN=A/G/C/Tn简并度：兼并引物设计步骤兼并引物设计步骤n利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列n对所找到的序列进行多序列比对n确定合适的保守区域n设计兼并引物（软件或者人工）n选择合适的序列进行多重比对；n选择高度保守的序列作为引物；n人工设计时要注意引物序列是和原序列相同还是反向互补的；n简并度不能太高，可用次黄嘌呤代替N；n引物的3端残基尽可能使用确定残基；n降落PCR;n巢氏PCR;RACE引物引物n各3条重叠的引物，引物之间最好距离100-200bp；n若同源片段长度太短，可先做3RACE，再做5RACE；n尽量靠近cDNA末端（3RACE-3末端；5RACE-5末端）；荧光定量引物荧光定量引物n纯化方式：PAGE；n产物长度：80-150bp；nTM值:58-62;n在编码区内靠近3末端处设计；n高的特异性：测序及熔解曲线分析；染色体步移引物染色体步移引物n以DNA为模板设计引物；n3条重叠引物；n高的退火温度：高于60度；原核表达用引物原核表达用引物n会读表达载体图谱；n去除信号肽序列；n根据目的表达序列直接取相应序列作为引物，注意要不要加终止密码子；n在引物的5末端加酶切位点和相应的保护碱基，注意方向；n选酶切位点：选择常用的内切酶，并看这两种酶是否可以在统一体系中进行双酶切；PCR-SSCP引物引物nPCR产物长度：150-400bp；n高的特异性；染色体步移克隆启动子染色体步移克隆启动子Tail-PCR荧光素光素酶活性活性检测 试剂盒盒谢谢！