《核酸的物化性质》PPT课件.ppt

核酸的一般物理性质核酸的一般物理性质nDNADNA为白色纤维状固体，为白色纤维状固体，RNARNA为白色粉末状固体，都微溶于水，其为白色粉末状固体，都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有钠盐在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂机溶剂。（用乙醇从溶液中沉淀核酸）（用乙醇从溶液中沉淀核酸）nDNADNA和和RNARNA在细胞中常以核蛋白形式存在，两种核蛋白在盐溶液中在细胞中常以核蛋白形式存在，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同。的溶解度不同。DNADNA核蛋白核蛋白 RNARNA核蛋白核蛋白mol/LNaCl -+mol/LNaCl -+1-2mol/LNaCl +-1-2mol/LNaCl +-DNADNA溶液的粘度很大，而溶液的粘度很大，而RNARNA溶液的粘度小得多。核酸发生变性或溶液的粘度小得多。核酸发生变性或降解后其粘度降低。降解后其粘度降低。核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关。度与核酸的大小和密度有关。第第1414章章 核酸的理化性质核酸的理化性质一、核酸的水解一、核酸的水解核酸分子中的核酸分子中的N-N-糖苷键糖苷键和和磷酸酯键磷酸酯键都可被水解。都可被水解。（一）（一）核酸的酸解核酸的酸解n 糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解，糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解，n水解的难易顺序为：磷酸酯键水解的难易顺序为：磷酸酯键 糖苷键糖苷键 嘧啶碱的糖苷键嘧啶碱的糖苷键 嘌呤碱的糖苷键嘌呤碱的糖苷键 嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键最易水解。嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键最易水解。n如，如，DNADNA在于在于3737对水透析即可完全除去嘌呤碱，。对水透析即可完全除去嘌呤碱，。n嘧啶糖苷键的水解常需要较高的温度。用甲酸（嘧啶糖苷键的水解常需要较高的温度。用甲酸（9898-100%100%）密封加热至）密封加热至 175 175 2h 2h，无论无论 RNARNA或或DNADNA都可以完都可以完全水解，产生嘌呤和嘧啶碱。全水解，产生嘌呤和嘧啶碱。（二）（二）核酸的碱解核酸的碱解n常用的碱有常用的碱有NaOHNaOH、KOHKOH等，主要水解磷酸酯键。等，主要水解磷酸酯键。以以KOHKOH效果最好。效果最好。nRNARNA较易被碱水解。较易被碱水解。n例如，在例如，在0.3-1 0.3-1 mol/L mol/L NaOHNaOH溶液中，在室温至溶液中，在室温至37370 0C C条件下条件下RNARNA几乎可以完全水解，生成几乎可以完全水解，生成2-2-或或3-3-核苷酸核苷酸，还可能有少量的核苷、，还可能有少量的核苷、2,5-2,5-或或3,5-3,5-核苷二磷酸核苷二磷酸 。nDNADNA在较难被碱水解。在较难被碱水解。nDNADNA在在1 1 mol/L mol/L NaOHNaOH溶液中，加温至溶液中，加温至1001000 0C C，4 4个个小时也可得到小分子的小时也可得到小分子的寡聚脱氧核苷酸寡聚脱氧核苷酸。n这种水解性能上的差别，与这种水解性能上的差别，与RNARNA核糖基上核糖基上2-2-OHOH参与作用有很大的关系。在参与作用有很大的关系。在RNARNA水解时，水解时，2-2-OHOH首首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。（三）核酸的酶解（三）核酸的酶解 核糖核酸酶核糖核酸酶T T2 2（RNase TRNase T2 2 ）。）。这个酶的来源同这个酶的来源同RNase TRNase T1 1，主要作用主要作用 点为点为ApAp残基，可以将残基，可以将tRNAtRNA完全降解成完全降解成3-3-腺苷酸结尾的寡核苷酸。腺苷酸结尾的寡核苷酸。牛脾核糖核酸酶的作用位点牛脾核糖核酸酶的作用位点核糖核酸酶核糖核酸酶T1的作用位点的作用位点 链球菌脱氧核糖核酸酶，是一个内切酶，作用于链球菌脱氧核糖核酸酶，是一个内切酶，作用于 DNADNA产产 物为物为5-5-磷酸为末端的碎片，其长度不一。磷酸为末端的碎片，其长度不一。限制性内切酶，在细菌中发现有这类酶，主要是降解外限制性内切酶，在细菌中发现有这类酶，主要是降解外 源的源的DNADNA。具有很严格的碱基序列专一性，是基因工程最具有很严格的碱基序列专一性，是基因工程最 重要的工具酶。重要的工具酶。三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收n在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在系，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240-290240-290nmnm之间有之间有强吸收峰，在强吸收峰，在260260nmnm左右有最大吸收峰。可以作为核酸左右有最大吸收峰。可以作为核酸及其组分定性和定量测定的依据。及其组分定性和定量测定的依据。n对于纯的对于纯的DNADNA或或RNARNA，可测定可测定A A260260 双螺旋双螺旋DNADNA含量（含量（g/mLg/mL）=A=A260260 5050 单链单链DNADNA含量（含量（g/mLg/mL）=A=A260260 4040 寡核苷酸含量（寡核苷酸含量（g/mLg/mL）=A=A260260 2020 纯度的判断：测定纯度的判断：测定A A260260/A/A280280的比值，纯的比值，纯DNADNA 纯纯RNARNA有时核酸溶液的紫外吸收以摩尔磷的吸光度来表示，摩尔有时核酸溶液的紫外吸收以摩尔磷的吸光度来表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。据此先测定核酸溶液中的磷含量磷即相当于摩尔核苷酸。据此先测定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出及紫外吸收值，然后求出摩尔磷吸光系数摩尔磷吸光系数（P P）。增色效应增色效应当双链核酸变性转变为单链核当双链核酸变性转变为单链核酸时，其在酸时，其在260260nmnm的紫外吸收值增加，的紫外吸收值增加，（P P）值也升高，这种现象称为增色效应。值也升高，这种现象称为增色效应。减色效应减色效应当单链核酸复性转变为双链核当单链核酸复性转变为双链核酸时，其在酸时，其在260260nmnm的紫外吸收值减少，的紫外吸收值减少，（P P）值也降低，这种现象称为减色效应。值也降低，这种现象称为减色效应。四核酸的变性、复性与杂交四核酸的变性、复性与杂交（一）（一）核酸的变性（核酸的变性（denaturationdenaturation）核酸的变性核酸的变性指核酸双螺旋区的碱基之间的氢键断裂，指核酸双螺旋区的碱基之间的氢键断裂，变成单链的过程。变成单链的过程。n能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性。性。nRNARNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有引起的性质变化没有DNADNA那样明显。那样明显。n利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。因为天然状态的因为天然状态的DNADNA在完全变性后，紫外吸收在完全变性后，紫外吸收(260(260 nm)nm)值增加值增加252540%.40%.而而RNARNA变性后，约增加变性后，约增加1.1%1.1%。nA260值增加n粘度下降n浮力密度增大n分子量不变DNADNA变性后的表现变性后的表现DNADNA的热的热变性和解链温度（变性和解链温度（TmTm）n用加热的方法使核酸变性叫做用加热的方法使核酸变性叫做热变性。热变性。nDNADNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，成。因此，通常把加热变性使通常把加热变性使DNADNA的双螺旋结构失去一的双螺旋结构失去一半时的温度称为半时的温度称为DNADNA熔解温度或熔点，用熔解温度或熔点，用T Tm m 表示。表示。一一般般DNADNA的的T Tm m值在值在82-9582-95 C C之间。之间。RNA的T m值tRNA的T m值DNADNAT Tm m的影响因素：的影响因素：（1 1）DNADNA的均一性。的均一性。均质均质DNADNA，如一些病毒如一些病毒DNADNA，人工合人工合成的成的poly(A-T)poly(A-T)、poly(G-C)poly(G-C)的熔解过程发生在一个较的熔解过程发生在一个较小的温度范围内；异质小的温度范围内；异质DNADNA的熔解过程发生在一个较宽的熔解过程发生在一个较宽的温度范围内。的温度范围内。TmTm大小可反映出大小可反映出DNADNA的均一性。的均一性。（2 2）G G-C C的含量。的含量。G G-C C的含量高，的含量高，T Tm m值高值高。因而测定。因而测定TmTm值，值，可反映可反映DNADNA分子中分子中G G、C C含量，可通过经验公式计算：含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)G+C)%=(Tm-69.3)（3 3）介质中的离子强度。介质中的离子强度。TmTm与介质中离子强度与介质中离子强度有关，一般来说，在离子强度低的介质中，有关，一般来说，在离子强度低的介质中，DNADNA的的T Tm m值较低，值较低，熔解的范围较宽。在离子强度高的介熔解的范围较宽。在离子强度高的介质中，质中，DNADNA的的T Tm m值较高，值较高，熔解的范围较窄。熔解的范围较窄。DNADNA的的保存应在含盐的缓冲液中保存应在含盐的缓冲液中RNARNA的变性的变性（二）核酸的复性（二）核酸的复性n变性变性DNADNA在适当的条件下在适当的条件下，两条彼此分开的单链，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复复性性。DNADNA复性后，一系列物理、化学性质将得到复性后，一系列物理、化学性质将得到恢复。恢复。DNADNA复性的程度、速率与复性过程的条件复性的程度、速率与复性过程的条件有关。有关。n将将热热变变性性的的DNADNA骤骤然然冷冷却却至至低低温温时时，DNADNA不不可可能能复复性性。但但是是将将变变性性的的DNADNA缓缓慢慢冷冷却却时时，可可以以复复性性，这这一一过过程程也也叫叫退退火火（annealing)annealing)。分分子子量量越越大大复复性性越越难难。浓浓度度越越大大，复复性性越越容容易易。此此外外，DNADNA的的复性也与它本身的组成和结构有关。复性也与它本身的组成和结构有关。n复复性性反反应应的的速速度度用用CotCot1/21/2表表示示。CoCo为为变变性性DNADNA复复性性时的浓度，时的浓度，t t为时间，以秒表示。为时间，以秒表示。DNADNA复性复性（三）核酸的杂交（三）核酸的杂交（hybridizationhybridization）n热变性的热变性的DNADNA单链，在复性时并不一定与同源单链，在复性时并不一定与同源DNADNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源有互补序列的异源DNADNA单链形成双螺旋结构。单链形成双螺旋结构。n这样形成的新分子称为杂交这样形成的新分子称为杂交DNADNA分子。分子。DNADNA单链与单链与互补的互补的RNARNA链之间也可以发生杂交。链之间也可以发生杂交。n核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。重要意义。nSouthern blotting(Southern Southern blotting(Southern 印迹印迹)nNorthern blotting(Northern Northern blotting(Northern 印迹印迹)nWestern blotting(Western Western blotting(Western 印迹印迹)第第1515章章 核酸的研究方法核酸的研究方法一、核酸的分离、提纯和定量一、核酸的分离、提纯和定量（一（一）DNADNA的分离的分离1、染色体染色体DNADNA与碱性蛋白（组蛋白）结合成的核蛋白（与碱性蛋白（组蛋白）结合成的核蛋白（DNPDNP）沉淀沉淀真核细胞真核细胞破碎破碎1mol/L氯化钠提取氯化钠提取mol/L加水饱和的苯酚，振荡加水饱和的苯酚，振荡冷冻离心冷冻离心水相（含水相（含DNA）酚相（含蛋白质）酚相（含蛋白质）加加2倍体积冷乙醇倍体积冷乙醇纯纯DNA2 2、用氯仿、用氯仿-辛醇（或异戊醇）代替苯酚，方法同辛醇（或异戊醇）代替苯酚，方法同1 16565保温保温4 4h h真核细胞悬液真核细胞悬液加入加入2倍体积含倍体积含1%SDS的缓冲液和广谱蛋白酶的缓冲液和广谱蛋白酶加苯酚抽提加苯酚抽提分离分离水相（含水相（含DNA和少量和少量RNA）酚相（含蛋白质和酶）酚相（含蛋白质和酶）加加RNA酶酶纯纯DNA3、4 4、氯化铯密度梯度离心、氯化铯密度梯度离心（二）（二）（三）（三）