《CR原理及应用》PPT课件.ppt

聚 合 酶 链 反 应(Polymerase Chain Reaction,PCR)，是一项在短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，它可将极微量的靶DNA在数小时内特异地扩增上百万倍。70年代初，Kleppe等人就提出了PCR的工作原理。Saiki（1985）和Mullis（1986）两家研究室分别用改进的Kleppe法获得了大量染色体DNA单拷贝基因。当时的PCR技术须在每次变性和退火后，扩增反应前重新加入DNA聚合酶。1988年，由于在PCR系统引入了热稳定的Taq DNA聚合酶，这是从水生栖热菌（Thermus aquaticus）中提取的耐热DNA聚合酶。多次循环后的Taq DNA聚合酶仍然具有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶链式反应。PCRPCR基本原理基本原理 PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤:(1)变性(Denaturation):目的双链DNA片段在94下解链;(2)退火(Annealing):两种寡核苷酸引物在适当温度(50左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3)延伸(Extension):DNA模板引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的链。PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用C CC C0 0(1+P)(1+P)n n计算。C代表DNA片段扩增后的拷贝数，C C0 0表示扩增开始时DNA模板数，P表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。PCRPCR的反应动力学的反应动力学 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”这种效应称平台期，平台期受PCR 扩增效率、DNA聚合酶的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素的影响。PCRPCR扩增产物扩增产物可分为长产物片段和短产物片段可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链引物链55端之间，是需要扩增的特定片段。短端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的第一个反应周期中，以两条互补的DNADNA为模板，为模板，引物是从引物是从33端开始延伸，端开始延伸，其其55端是固定的，端是固定的，3 3 端则没有固定的止点，长短不一，这就是端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长长产物片段产物片段”。PCRPCR扩增产物扩增产物进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链新合成的链(即即“长产物片段长产物片段”)结合。引物在与新链结时，结合。引物在与新链结时，由于新链模板的由于新链模板的5端序列是固定的，端序列是固定的，这就等于这次延伸的这就等于这次延伸的片段片段3端被固定了止点，端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段短产物片段”。不难看出不难看出“短产物片段短产物片段”是按指数倍数增加，是按指数倍数增加，而而“长产物长产物片段片段”则以算术倍数增加，则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，几乎可以忽略不计，这使得这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段片段供分析与检测用。供分析与检测用。PCR反应的特点n引物与模板引物与模板DNA特异正确的结合特异正确的结合n碱基配对原则碱基配对原则nTaqDNA聚合酶合成反应的忠实性聚合酶合成反应的忠实性n靶基因的特异性与保守性。靶基因的特异性与保守性。灵敏度高灵敏度高PCRPCR反应特点反应特点PCRPCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10(pg=10-12-12)量级的起始待测模板扩增到微克量级的起始待测模板扩增到微克(g=10g=10-6-6)水平。能从水平。能从100100万个细胞中检出一个靶细胞；在病万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，毒的检测中，PCRPCR的灵敏度可达的灵敏度可达3 3个个PFU(PFU(空斑形成空斑形成单位单位)；在细菌学中最小检出率为；在细菌学中最小检出率为3 3个细菌。个细菌。PCR反应用耐高温的反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在好后，即在DNA扩增仪上进行变性扩增仪上进行变性-退火退火-延伸反应，一般在延伸反应，一般在24小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析。小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析。PCRPCR反应特点反应特点简单、快速简单、快速不需要分离病毒或细菌及培养细胞，不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA DNA 粗制粗制品及总品及总RNARNA均可作为扩增模板。可直接用临床均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的活组织等粗制的DNADNA扩增检测。扩增检测。PCRPCR反应特点反应特点对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低PCRPCR反应体系优化反应体系优化PCR反应体系反应体系引物引物dNTPdNTPMgMg2+2+TaqTaq聚合酶聚合酶模板模板反应缓冲液反应缓冲液 引物设计的引物设计的3 3条基本原则：条基本原则：引物与模板的序列要紧密互补引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物不能在模板的非目的位点引发引物不能在模板的非目的位点引发DNADNA聚合反应聚合反应(即即错配错配)。PCRPCR反应体系反应体系引物引物 引物的长度一般为引物的长度一般为15-30bp，常用的是常用的是18-27bp，但不应大于但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于，不适于TaqDNA聚合聚合酶进行反应。酶进行反应。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物序列，否则容易导致错配。引物3端出现端出现3个以上的连续碱基，如个以上的连续碱基，如GGG或或CCC，也会使错误引发机率增加。也会使错误引发机率增加。引物引物3端的末位碱基对端的末位碱基对Taq酶的酶的DNA合成效率有较大的影响。不同合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配的错配效率明显高于其他效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基端使用碱基A。另外，两条引物另外，两条引物33端若互补，或者单条引物自身形成发夹结构也可端若互补，或者单条引物自身形成发夹结构也可能导致能导致PCR反应失败。反应失败。PCRPCR反应体系反应体系引物设计注意事项引物设计注意事项5端序列对端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应通常应在在55端限制酶位点外再加端限制酶位点外再加1-21-2个保护碱基。个保护碱基。简并引物应选用简并程度低的密码子简并引物应选用简并程度低的密码子,例如选用只有一种密码子的例如选用只有一种密码子的Met,3Met,3端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。物。两引物间最好不存在两引物间最好不存在4 4个连续碱基的同源性或互补性个连续碱基的同源性或互补性引物序列的引物序列的GC含量一般为含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应，过高或过低都不利于引发反应，因为因为GCGC含量决定了含量决定了DNADNA双链的解链温度（双链的解链温度（TmTm）。）。另外，上下游引物的另外，上下游引物的GC含量不能相差太大。含量不能相差太大。PCRPCR反应体系反应体系引物设计注意事项引物设计注意事项引物所对应模板位置序列的引物所对应模板位置序列的Tm值在值在72左右可使复性条件最佳。左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式值的计算有多种方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在，在Oligo软件软件中使用的是最邻近法中使用的是最邻近法(thenearestneighbormethod)。G值是指值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用基对的相对稳定性。应当选用3端端G值较低（绝对值不超过值较低（绝对值不超过9），而），而5端和中间端和中间G值相对较高的引物。引物的值相对较高的引物。引物的3端的端的G值过高，容易在错配值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。聚合反应。引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过）易导致产生引物二聚体带，易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。反应不能正常进行。对引物的修饰一般是在对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入入PCR产物的载体的相应序列而确定。产物的载体的相应序列而确定。PCRPCR反应体系反应体系引物设计注意事项引物设计注意事项一般一般PCR反应中的引物终浓度为反应中的引物终浓度为。引物过多会产生错误引导或引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体产生引物二聚体,过低则降低产量。利用紫外分光光度计过低则降低产量。利用紫外分光光度计,可可精确计算引物浓度精确计算引物浓度,在在1cm光程比色杯中光程比色杯中,260nm下下,引物浓度可引物浓度可按下式计算：按下式计算：Xmol/LOD260/A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)X:引物摩尔浓度引物摩尔浓度,A、C、G、T:引物中引物中4种不同碱基个数。种不同碱基个数。引物浓度计算引物浓度计算PCRPCR反应体系反应体系dNTPdNTP原液可配成原液可配成5-10mmol/L5-10mmol/L并分装并分装,-20,-20贮存。一般贮存。一般反应中每种反应中每种dNTPdNTP的终浓度为的终浓度为20-200mol/L20-200mol/L。理论上。理论上4 4 种种 dNTPdNTP各各20mol/L,20mol/L,足以在足以在100l100l反应中合成的反应中合成的DNADNA。当。当dNTPdNTP终浓度大于终浓度大于50mmol/L50mmol/L时可抑制时可抑制TaqTaq DNA DNA聚合酶的聚合酶的活性；活性；4 4种种dNTPdNTP的浓度应该相等的浓度应该相等,以减少合成中由于某种以减少合成中由于某种dNTPdNTP的不足出现的错误掺入。的不足出现的错误掺入。PCRPCR反应体系反应体系44种三磷酸脱氧核苷酸种三磷酸脱氧核苷酸种三磷酸脱氧核苷酸种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)(dNTP)MgMg2+2+浓度对浓度对Taq DNATaq DNA聚合酶影响很大聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和它可影响酶的活性和真实性真实性,影响引物退火和解链温度影响引物退火和解链温度,影响产物的特异性以及引影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常物二聚体的形成等。通常MgMg2+2+浓度范围为。对于一种新的浓度范围为。对于一种新的PCRPCR反应反应,可以用的递增浓度的可以用的递增浓度的MgMg2+2+进行预备实验进行预备实验,选出最选出最适的适的MgMg2+2+浓度。在浓度。在PCRPCR反应混合物中反应混合物中,应尽量减少有高浓度应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团的带负电荷的基团,例如磷酸基团或例如磷酸基团或EDTAEDTA等可能影响等可能影响MgMg2+2+离子浓度的物质离子浓度的物质,以保证最适以保证最适MgMg2+2+浓度。浓度。PCRPCR反应体系反应体系 Mg Mg2+2+就模板就模板DNADNA而言而言,影响影响PCRPCR的主要因素是模板的数量的主要因素是模板的数量和纯度和纯度.一般反应中的模板数量为一般反应中的模板数量为10102 2-10-105 5 个拷贝个拷贝,对于对于单拷贝基因单拷贝基因,这需要的人基因组这需要的人基因组DNA,10ngDNA,10ng的酵母的酵母DNA,1ngDNA,1ng的大肠杆菌的大肠杆菌DNADNA；扩增多拷贝序列时；扩增多拷贝序列时,用量更用量更少；灵敏的少；灵敏的PCRPCR可从一个细胞可从一个细胞,一根头发一根头发,一个孢子或一一个孢子或一个精子提取的个精子提取的DNADNA中分析目的序列；模板量过多则可能中分析目的序列；模板量过多则可能增加非特异性产物增加非特异性产物.DNA.DNA中的杂质也会影响中的杂质也会影响PCRPCR的效率。的效率。PCRPCR反应体系反应体系模板模板模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。PCRPCR反应体系反应体系模板的提取方法模板的提取方法Taq DNATaq DNA聚合酶活性半衰期为聚合酶活性半衰期为92.592.5 130min,95 130min,95 40min,40min,9797 5min.5min.现在人们又发现许多新的耐热的现在人们又发现许多新的耐热的DNADNA聚合酶聚合酶,这这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间些酶的活性在高温下活性可维持更长时间.Taq DNA.Taq DNA聚合酶聚合酶的酶活性单位定义为的酶活性单位定义为7474下下,30min,30min,掺入掺入10nmol/L dNTP10nmol/L dNTP到到核酸中所需的酶量核酸中所需的酶量.PCRPCR反应体系反应体系Taq DNA聚合酶n nTaq DNATaq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率聚合酶的一个致命弱点是它的出错率,一般一般PCRPCR中出错率为中出错率为210210-4-4 核苷酸核苷酸/每轮循环每轮循环,在利用在利用PCRPCR克隆和进行序列分析时尤应注意克隆和进行序列分析时尤应注意.在在100l PCR100l PCR反应中单位的反应中单位的TaqTaq DNA DNA聚合酶就足以聚合酶就足以进行进行3030轮循环轮循环.所用的酶量可根据所用的酶量可根据DNADNA、引物、引物及其它因素的变化进行适当的增减及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多酶量过多会使产物非特异性增加会使产物非特异性增加,过少则使产量降低过少则使产量降低.反反应结束后应结束后,如果需要利用这些产物进行下一步如果需要利用这些产物进行下一步实验实验,需要预先灭活需要预先灭活TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶,灭活灭活TaqTaq DNADNA聚合酶的方法有：聚合酶的方法有：(1)PCR(1)PCR产物经酚产物经酚:氯仿抽提氯仿抽提,乙醇沉淀。乙醇沉淀。(2)(2)加入加入10mmol/L10mmol/L的的EDTAEDTA螯合螯合Mg2+Mg2+。(3)99-100(3)99-100加热加热10min.10min.目前已有直接纯化目前已有直接纯化PCRPCR产物的产物的KitKit可用。可用。PCR反应体系 Taq DNA Taq DNA聚合酶灭活方法聚合酶灭活方法缓冲液一般含缓冲液一般含10-50mmol/L TrisCl(2010-50mmol/L TrisCl(20下下pH8.3-8.8),pH8.3-8.8),50mmol/L KCl50mmol/L KCl和适当浓度的和适当浓度的MgMg2+2+.TrisCl.TrisCl在在2020时时pHpH为为8.3-8.8,8.3-8.8,但在实际但在实际PCRPCR反应中反应中,pH,pH为为6.8-7.8.50mmol/L6.8-7.8.50mmol/L的的KClKCl有利于引物的退火有利于引物的退火.另外另外,反应液可加入反应液可加入5mmol/L5mmol/L的二的二硫苏糖醇硫苏糖醇(DDT)(DDT)或或100g/ml100g/ml的牛血清白蛋白的牛血清白蛋白(BSA),(BSA),它们可它们可稳定酶活性稳定酶活性,另外加入另外加入T4T4噬菌体的基因噬菌体的基因3232蛋白则对扩增较蛋白则对扩增较长的长的DNADNA片段有利片段有利.各种各种Taq DNATaq DNA聚合酶商品都有自己特聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。定的一些缓冲液。PCRPCR反应体系反应体系 PCR PCR反应缓冲液反应缓冲液PCR反应参数反应参数 在第一轮循环前在第一轮循环前,在在9494下变性下变性5-10min5-10min非常重要非常重要,它可它可使模板使模板DNADNA完全解链完全解链,然后加入然后加入TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶(hot(hot start),start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全完全,往往使往往使PCRPCR失败失败,因为未变性完全的因为未变性完全的 DNADNA双链会双链会很快复性很快复性,减少减少DNADNA产量。产量。对于富含对于富含GCGC的序列的序列,可适当提高变性温度可适当提高变性温度.但变性温度但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。过高或时间过长都会导致酶活性的损失。变变性性引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度.实际使实际使用的退火温度比扩增引物的用的退火温度比扩增引物的TmTm值约低值约低5 5。一般当引物中。一般当引物中GCGC含量高含量高,长度长并与模板完全配对时长度长并与模板完全配对时,应提高退火温度。退火应提高退火温度。退火温度越高温度越高,所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并延伸两步合并,只用两种温度只用两种温度(例如用例如用6060和和9494)完成整个扩完成整个扩增循环增循环,既省时间又提高了特异性。既省时间又提高了特异性。退退火火 延伸反应通常为延伸反应通常为7272,接近于接近于TaqTaq DNA DNA聚合酶的最适反应温聚合酶的最适反应温度度7575.实际上实际上,引物延伸在退火时即已开始引物延伸在退火时即已开始,因为因为TaqTaq DNA DNA聚合酶的作用温度范围可从聚合酶的作用温度范围可从2020-85-85.延伸反应时间的长短延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中在一般反应体系中,TaqTaq DNA DNA聚合酶每分钟约可合成聚合酶每分钟约可合成2kb2kb长的长的DNADNA。延伸时间过长会导致延伸时间过长会导致产物非特异性增加产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列但对很低浓度的目的序列,则可适当增则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较都需要一步较长时间长时间(10-30min)(10-30min)的延伸反应的延伸反应,以获得尽可能完整的产物以获得尽可能完整的产物,这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。延延伸伸当其它参数确定之后当其它参数确定之后当其它参数确定之后当其它参数确定之后,循环次数主要取决于循环次数主要取决于循环次数主要取决于循环次数主要取决于DNADNA浓度。一浓度。一浓度。一浓度。一般而言般而言般而言般而言25-3025-30轮循环已经足够。循环次数过多轮循环已经足够。循环次数过多轮循环已经足够。循环次数过多轮循环已经足够。循环次数过多,会使会使会使会使PCRPCR产物中非特异性产物大量增加。通常经产物中非特异性产物大量增加。通常经产物中非特异性产物大量增加。通常经产物中非特异性产物大量增加。通常经25-3025-30轮循环扩增轮循环扩增轮循环扩增轮循环扩增后后后后,反应中反应中反应中反应中TaqDNATaqDNA聚合酶已经不足聚合酶已经不足聚合酶已经不足聚合酶已经不足,如果此时产物量仍如果此时产物量仍如果此时产物量仍如果此时产物量仍不够不够不够不够,需要进一步扩增需要进一步扩增需要进一步扩增需要进一步扩增,可将扩增的可将扩增的可将扩增的可将扩增的DNADNA样品稀释样品稀释样品稀释样品稀释10103 3-10105 5倍作为模板倍作为模板倍作为模板倍作为模板,重新加入各种反应底物进行扩增重新加入各种反应底物进行扩增重新加入各种反应底物进行扩增重新加入各种反应底物进行扩增,这样经这样经这样经这样经6060轮循环后轮循环后轮循环后轮循环后,扩增水平可达扩增水平可达扩增水平可达扩增水平可达10109 9-10-101010。循环次数循环次数 扩增产物的量可用下列公式表示扩增产物的量可用下列公式表示:C:CC0(1+P)C0(1+P)n n 。其中：其中：C C为为扩增产物量扩增产物量,C0,C0 为起始为起始DNADNA量量,P,P为扩增效率为扩增效率,n,n为循环次数。为循环次数。在扩增后期在扩增后期,由于产物积累由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，期前结束反应，减少非特异性产物。减少非特异性产物。扩增效率扩增效率PCR扩增产物的分析扩增产物的分析n凝胶电泳分析凝胶电泳分析(1)琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：通常应用通常应用12%的琼脂糖的琼脂糖凝凝胶，胶，供检测用。供检测用。(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：）：610%聚聚丙烯酰胺凝胶丙烯酰胺凝胶电泳分离效果较琼脂糖好电泳分离效果较琼脂糖好n酶切分析酶切分析n分子杂交分子杂交n测序测序功能 引物设计引物设计限制性内切酶位点分析限制性内切酶位点分析DNADNA基序基序(motif)(motif)查找查找同源性分析同源性分析常规常规PCR技术及几类技术及几类PCR新技术新技术q热启动热启动PCRqTouch-downPCRqRT-PCRq简并引物简并引物PCRq巢氏巢氏PCRq反向反向PCRq不对称不对称PCRq原位原位PCRq连接酶链反应连接酶链反应qRACE-PCRqAFLPq免疫免疫PCR(immunoPCR(immuno-PCR)-PCR)热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。热启动热启动PCR热启动通过抑制一种基本成分延迟热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到合成，直到PCR仪达到变性温度。仪达到变性温度。包括延缓加入包括延缓加入TaqDNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。PlatinumDNA聚合酶对于自动热启动聚合酶对于自动热启动PCR来说方便高效。来说方便高效。PlatinumTaqDNA聚合酶的成分为复合有抗聚合酶的成分为复合有抗TaqDNA聚合酶单克隆抗体的重组聚合酶单克隆抗体的重组TaqDNA聚聚合酶。此酶在常温下活性被封闭，要在合酶。此酶在常温下活性被封闭，要在9495下加热数分钟才能够恢复下加热数分钟才能够恢复酶活性。酶活性。同经化学修饰用于热启动的同经化学修饰用于热启动的TaqDNA聚合酶相比，聚合酶相比，Platinum酶不需酶不需要在要在94延时保温（延时保温（10到到15分钟）以激活聚合酶。使用分钟）以激活聚合酶。使用PlatinumTaqDNA聚聚合酶，在合酶，在94进行进行2分钟就可以恢复分钟就可以恢复90的的TaqDNA聚合酶活性。聚合酶活性。热启动热启动PCRTouch-downPCR又称降落又称降落PCR。即。即选定一个温度范定一个温度范围，如如5035，每，每降降1-2进行行1-2个个循循环，然后在，然后在50度度下进行下进行15个个循循环。Touch-down的的原理原理：随着退火温度的降低，特异性逐随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条步降低，但特异性条带在温度在温度较高高时已已经扩增出来，其增出来，其浓度度远远超超过非特异性条非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性，随着退火温度的降低，特异性条条带优先被先被扩增。增。选择初始复性温度的原则：起始复性温度应该比引物的选择初始复性温度的原则：起始复性温度应该比引物的Tm值高出值高出5-10度，然后每个循环递减度，然后每个循环递减1-2度度Touch-downPCRlow copy of targeted DNA;high degree degeneracy(or less specific)of the first set of primers;RT-PCR using oligo-dT.Touch-downPCR的应用范围的应用范围 RT-PCRRNA的多聚酶反应（的多聚酶反应（RT-PCR）是以）是以RNA为模板，联合逆为模板，联合逆转录反应转录反应（reversetranscription，RT）与）与PCR，可用于检测单个细，可用于检测单个细胞或少数胞或少数细胞中少于细胞中少于10个拷贝的个拷贝的RNA模板。模板。RNA扩增包括两个步骤：扩增包括两个步骤：在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补的互补cDNA加热后加热后cDNA与与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚聚合酶催化引物延伸生成双链靶合酶催化引物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶最后扩增靶DNADouble strand cDNAAAAAATTTTTRTAAAAATTTTTRTRTAAAAATTTTTOligo dT primer is bound to mRNAReverse transcriptase(RT)copies first cDNA strandReverse transcriptase digests and displaces mRNA and copies second strand of cDNART-PCRA.Double strand DNAB.Denature9650C.Anneal primers50D.Polymerase binds72TaqTaqRT-PCRcDNAcDNA第二链的合成方法有以下几种第二链的合成方法有以下几种:(1)(1)自身引导法自身引导法 合成的单链合成的单链cDNA 3 cDNA 3 端能够形成一短的端能够形成一短的发夹结构发夹结构,这就为第二链的合成提供了现成的引物这就为第二链的合成提供了现成的引物,当第一链合当第一链合成反应产物的成反应产物的DNA:RNADNA:RNA杂交链变性后利用大肠杆菌杂交链变性后利用大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 KlenowKlenow片段或反转录酶合成片段或反转录酶合成cDNAcDNA第二链第二链,最后用对单链特异性最后用对单链特异性的的S1S1核酸酶消化该环核酸酶消化该环,即可进一步克隆。但自身引导合成法较即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应，而且用难控制反应，而且用S1S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于致对应于mRNA 5mRNA 5端序列出现缺失和重排端序列出现缺失和重排,因而该方法目前很因而该方法目前很少使用。少使用。(2)(2)置换合成法置换合成法 该方法利用第一链在反转录酶作用下产该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的生的cDNA:mRNAcDNA:mRNA杂交链不用碱变性杂交链不用碱变性,而是在而是在dNTPdNTP存在下存在下,利用利用RNARNA酶酶H H在杂交链的在杂交链的mRNAmRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNARNA引物引物,使之成为合成第二链的引物使之成为合成第二链的引物,在大肠杆菌在大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶的的作用下合成第二链。该反应有作用下合成第二链。该反应有3 3个主要优点个主要优点:(1):(1)非常有效非常有效;(2)(2)直接利用第一链反应产物直接利用第一链反应产物,无须进一步处理和纯化无须进一步处理和纯化;(3);(3)不必使用不必使用S1S1核酸酶来切割双链核酸酶来切割双链cDNAcDNA中的单链发夹环。中的单链发夹环。RT-PCRRT-PCR优化条件优化条件模板模板：作为模板的：作为模板的RNA分子必须是完整的，并且不含分子必须是完整的，并且不含DNA、蛋白和其、蛋白和其他杂质。他杂质。RNA中即使含有最微量的中即使含有最微量的DNA，经扩增后也会出现非特异性，经扩增后也会出现非特异性扩增；蛋白若未除干净，与扩增；蛋白若未除干净，与RNA结合后会影响逆转录和结合后会影响逆转录和PCR；残留的；残留的RNase极易将模板极易将模板RNA降解掉。降解掉。逆转录酶：逆转录酶：1)1)目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒禽类成髓细胞病毒(AMV)(AMV)逆转录酶和从表达克隆化的逆转录酶和从表达克隆化的MoloneyMoloney鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒鼠白血病病毒(MLV)(MLV)反转录酶。反转录酶。AMVAMV反转录酶包括两个具有反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基若干种酶活性的多肽亚基,这些活性包括依赖于这些活性包括依赖于RNARNA的的DNADNA合合成成,依赖于依赖于DNADNA的的 DNA DNA合成以及对合成以及对DNA:RNADNA:RNA杂交体的杂交体的RNARNA部分部分进行内切降解进行内切降解(RNA(RNA酶酶H H活性活性)。MLVMLV反转录酶只有单个多肽亚反转录酶只有单个多肽亚基基,兼备依赖于兼备依赖于RNARNA和依赖于和依赖于DNADNA的的DNADNA合成活性合成活性,但降解但降解RNADNARNADNA杂交体中的杂交体中的RNARNA的能力较弱的能力较弱,且对热的稳定性较且对热的稳定性较AMVAMV反反转录酶差。转录酶差。2)普通逆转录酶反应温度为普通逆转录酶反应温度为37-42度，然而一些有丰富二级结构的度，然而一些有丰富二级结构的复杂模板或者高复杂模板或者高GC含量的模板在常温下扩增困难，需要将逆转录含量的模板在常温下扩增困难，需要将逆转录反应置于较高温度下进行改善扩增。对于较高的反应温度，建议使反应置于较高温度下进行改善扩增。对于较高的反应温度，建议使用用cMASTER-RT酶，该酶在酶，该酶在37-60度的温度范围内都能保持良好的度的温度范围内都能保持良好的活性，使用活性，使用cMASTER-RT酶，可以增加反应产量，还可以增加逆酶，可以增加反应产量，还可以增加逆转录反应的特异性。因为，对于使用基因特异性引物（转录反应的特异性。因为，对于使用基因特异性引物（GSP）进行）进行cDNA合成时，较高的反应温度允许使用合成时，较高的反应温度允许使用Tm值较高的基因特异性引值较高的基因特异性引物。物。Taq酶酶普通的普通的Taq酶扩增能力很强但是错配率高，虽然高产但是最酶扩增能力很强但是错配率高，虽然高产但是最大只能大只能扩增扩增3-5kb的片段；而本身带有校读功能的高保真酶有很高的的片段；而本身带有校读功能的高保真酶有很高的保真度，不易出错，可扩增较长的片段，但是产量偏低。保真度，不易出错，可扩增较长的片段，但是产量偏低。TripleMaster酶则是一个高保真的混合酶酶则是一个高保真的混合酶在保留在保留Taq酶的高聚合能酶的高聚合能力，保证高产的同时，还有效降低了力，保证高产的同时，还有效降低了Taq的错配率，大大提高了保真的错配率，大大提高了保真性。性。RT-PCRbuffer引物：引物：(1)(1)上下游引物设计在跨内含子的两个外显子的上下游引物设计在跨内含子的两个外显子的33端和下一端和下一个外显子的个外显子的55端，这样不会在基因组上扩出来。端，这样不会在基因组上扩出来。(2)(2)设计在两个离得设计在两个离得远的外显子上，这样从基因组和远的外显子上，这样从基因组和cDNAcDNA上得到的片段长度不一样，可上得到的片段长度不一样，可以一引两用以一引两用。Random 9mers适用于长的及具有Hairpin构造的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的反转录反应(用Random 9mers合成cDNA后，任何特异性的Primer pair都可用于PCR反应)。Oligo dT-Adaptor Primer适用于具有Poly(A)+tail的RNA。注:原核生物的RNA、真核生物的rRNA及tRNA(某些种类真核生物的mRNA)不具有Poly(A)tail。本Pr