SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳.ppt

A外源基因在毕赤酵母中表达水平的预测外源基因在毕赤酵母中表达水平的预测A表达产物的表达产物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析鉴定聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析鉴定 A分析其他目的基因在毕赤酵母中高效表达的概率分析其他目的基因在毕赤酵母中高效表达的概率综合性设计性实验综合性设计性实验-2-21.1.第一部分：外源基因在毕赤酵母中高效表达的预测第一部分：外源基因在毕赤酵母中高效表达的预测2.2.第二部分：毕赤酵母蛋白表达产物的第二部分：毕赤酵母蛋白表达产物的SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析鉴定凝胶电泳分离分析鉴定3.3.第三部分：分析其他目的基因在毕赤酵母中高效表第三部分：分析其他目的基因在毕赤酵母中高效表达的概率达的概率此实验共包括如下三个部分此实验共包括如下三个部分在科研和临床中需要大量的蛋白质，这些蛋白不可能由人体组织或体外细胞培养而大在科研和临床中需要大量的蛋白质，这些蛋白不可能由人体组织或体外细胞培养而大规模的获得，人们利用一些低等生物的特点，来生成和获得这些人属蛋白质。规模的获得，人们利用一些低等生物的特点，来生成和获得这些人属蛋白质。酵母菌是单细胞真核生物，具有生长快、易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加酵母菌是单细胞真核生物，具有生长快、易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒产物等特点，被认为是表达外源蛋白的合适宿主。工和修饰、不产生有毒产物等特点，被认为是表达外源蛋白的合适宿主。几种工业酵母尤其是巴氏毕赤酵母几种工业酵母尤其是巴氏毕赤酵母(pichia pastoris,Pp)，因具有旺盛的生长力以及其因具有旺盛的生长力以及其它一些独特的性质，已发展成为较成熟的蛋白生产的表达系统。毕赤酵母以甲醇为营它一些独特的性质，已发展成为较成熟的蛋白生产的表达系统。毕赤酵母以甲醇为营养来源。养来源。由毕赤酵母表达应用于临床的蛋白目前有胰岛素，乙型肝炎表面抗原由毕赤酵母表达应用于临床的蛋白目前有胰岛素，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肿瘤肿瘤坏死因子坏死因子(TNF)、表皮生长因子表皮生长因子(EGF)、人血清白蛋白，以及多种抗体等。人血清白蛋白，以及多种抗体等。第一部分：外源基因在毕赤酵母中高效表达的预测第一部分：外源基因在毕赤酵母中高效表达的预测微观的酵母细胞微观的酵母细胞5AOX1 启动子片段含有启动子片段含有AOX1启动子，在甲醇的诱启动子，在甲醇的诱导下可启动外源蛋白的表达；导下可启动外源蛋白的表达；-因子信号肽序列为约因子信号肽序列为约89个氨基酸的信号肽序列，个氨基酸的信号肽序列，能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于外源蛋白能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于外源蛋白的纯化；的纯化；多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插入提多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插入提供位点；供位点；TT序列提供有效的转录终止和序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号；修饰信号；HIS4为营养缺陷型筛选标志；为营养缺陷型筛选标志；3 AOX1 基因片段能够与基因组基因片段能够与基因组AOX1基因属同源基因属同源重组；重组；抗抗Amp 基因和基因和pBR322能使空载体和构建的表达载能使空载体和构建的表达载体在体在中筛选和复制。中筛选和复制。毕赤酵母表达系统中常用载体的基本结构毕赤酵母表达系统中常用载体的基本结构pPIC9载体的信号肽序列和多克隆位点载体的信号肽序列和多克隆位点1.载体的载体的3 AOX1区与基因组的区与基因组的AOX1基因的末端发生整合重组基因的末端发生整合重组表达载体与毕赤酵母基因表达载体与毕赤酵母基因组发生重组的两种方式：组发生重组的两种方式：2.载体的载体的HIS4区与基因组的区与基因组的HIS4基因的末端发生整合重组基因的末端发生整合重组甲醇酵母系统高效表达影响因素甲醇酵母系统高效表达影响因素载体稳定性：是整合还是粘附到酵母染色体上载体稳定性：是整合还是粘附到酵母染色体上基因剂量：单基因剂量：单/多拷贝多拷贝甲醇利用表型：甲醇利用表型：Muts(利用甲醇慢型利用甲醇慢型)，Mut+(利用甲醇快型利用甲醇快型)mRNA5端：应尽量避免在端：应尽量避免在UTR区出现区出现AUG和次级结构和次级结构AT含量：含量：AT含量越高、越容易出现类似于终止子的结构含量越高、越容易出现类似于终止子的结构表达产物稳定性：分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素表达产物稳定性：分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素外源基因的外源基因的3末端的最低自由能稳定性对于实现目的基因在毕赤酵母中成功高效表达是比末端的最低自由能稳定性对于实现目的基因在毕赤酵母中成功高效表达是比较重要的因素，汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教授课题组联合北京较重要的因素，汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教授课题组联合北京军事医学科学院李伍举教授课题组建立了一个针对军事医学科学院李伍举教授课题组建立了一个针对pPIC9表达载体在毕赤酵母中高效表达表达载体在毕赤酵母中高效表达的数学模型。的数学模型。模型构建原理模型构建原理收集收集40例应用例应用pPIC9载体在毕赤酵母载体在毕赤酵母GS115株中表达目的基因的数据。拟定以表达量株中表达目的基因的数据。拟定以表达量100 mg/L为界限，将为界限，将40例目的基因表达水平分为高例目的基因表达水平分为高/低两组。低两组。确认表达载体的翻译终止密码子前后各确认表达载体的翻译终止密码子前后各100bp的序列，据此对每个数据构建的序列，据此对每个数据构建200bp的片段。的片段。从上述每个基因的从上述每个基因的200bp片段，截取片段，截取9,000个区间，截取方式为个区间，截取方式为X,Y,X和和Y在在200bp片段的片段的范围为范围为1X100,和和111Y200。使用使用RNAfold软件对每个区间计算最低自由能，构建最低自由能矩阵。软件对每个区间计算最低自由能，构建最低自由能矩阵。使用使用Tclass程序对最低自由能矩阵进行程序对最低自由能矩阵进行t检验及判别分析，得到理论上可以判别表达水平高检验及判别分析，得到理论上可以判别表达水平高低的低的6个区间组合。个区间组合。我们将我们将40例数据按例数据按75的比例随机分成两组，多数组应用上述的比例随机分成两组，多数组应用上述6个区间来建立判别函数，个区间来建立判别函数，如此重复如此重复1,000次，这样我们得到了次，这样我们得到了1,000个判别函数，如第一个判别函数为：个判别函数，如第一个判别函数为：HEG1=1.53908X6 (1)LEG1=0.15215X5 0.74495X6 (2)这里的这里的X1,X2,X3,X4,X5 和和X6分别代表区间分别代表区间18,123，31,140，35,150，90,118，90,151和和95,135的用的用RNAfold软件计算的最低自由能（计算温度参数设为软件计算的最低自由能（计算温度参数设为30）。）。对于每个新数据，为了预测该基因是否能在酵母中高效表达（表达水平大于对于每个新数据，为了预测该基因是否能在酵母中高效表达（表达水平大于100 mg/L），可先计算这），可先计算这6个区间的最低自由能，然后运算上述的个区间的最低自由能，然后运算上述的1,000个判别函数，来评个判别函数，来评估该基因高效表达的概率。如果在这估该基因高效表达的概率。如果在这1,000次的判别分析中，有次的判别分析中，有500次或以上的次或以上的HEG1大大于于LEG1，那么这个外源基因为一个表达水平大于，那么这个外源基因为一个表达水平大于100 mg/L的基因，否则就是个表达水的基因，否则就是个表达水平低于平低于100 mg/L的基因。的基因。外源基因在毕赤酵母表达系统中高效表达预测的网页服务器外源基因在毕赤酵母表达系统中高效表达预测的网页服务器 分析流程：分析流程：1.在在“sequence”方框中输入由目的基因末端方框中输入由目的基因末端100bp及其后面的载体及其后面的载体100bp组成的组成的200bp序列片段；序列片段；2.点击底下的点击底下的“Evaluation”按钮，在按钮，在“Evaluation”方框中显示预测的结果；方框中显示预测的结果；3.如果结果显示低于如果结果显示低于，则可点击，则可点击“Design”这个按钮，则显示根据密码子使用改造后的序列。这个按钮，则显示根据密码子使用改造后的序列。用该软件来预测用该软件来预测NGAL在毕赤酵母高效表达的概率在毕赤酵母高效表达的概率截取截取NGAL cDNA 3末端最后末端最后100bp碱基（包括终止密码子碱基（包括终止密码子TGA），与），与pPIC9载载体体EcoR I位点后位点后100bp碱基（包括碱基（包括EcoR I位点）组成位点）组成200bp的序列片段，的序列片段，用用RNAfold软件计算软件计算18,123,31,140,35,150,90,118,90,151和和95,135 六个区间的最低自由能（六个区间的最低自由能（RNAfold的温度参数设为的温度参数设为30）。）。其数值运算于其数值运算于1,000个判别函数，结果表明个判别函数，结果表明NGAL在毕赤酵母中高效表达的概率为在毕赤酵母中高效表达的概率为，虽然虽然仅略高于仅略高于，但我们仍想通过表达这个基因来验证酵母高效表达的数学模型。，但我们仍想通过表达这个基因来验证酵母高效表达的数学模型。学习学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理测定蛋白质分子量的原理掌握垂直板电泳的操作方法掌握垂直板电泳的操作方法 了解蛋白印迹技术原理和方法了解蛋白印迹技术原理和方法实验目的实验目的第二部分，毕赤酵母蛋白表达产物的第二部分，毕赤酵母蛋白表达产物的SDS-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析鉴定凝胶电泳分离分析鉴定 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。和琼脂糖凝胶。电泳的概念和分类电泳的概念和分类聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶是是由由单单体体丙丙烯烯酰酰胺胺(acrylamide，简简称称Acr)和和交交联联剂剂N,N-甲甲叉叉双双丙丙烯烯酰酰胺胺(N,N-methylene-bisacylamide，简简称称Bis)在在加加速速剂剂N,N,N,N-四四甲甲基基乙乙二二胺胺(N,N,N,N-tetramethyl ethylenedia mine，简简称称TEMED)和和催催化化剂剂过过硫硫酸酸铵铵(ammonium persulfate(NH4)2S2O8，简简称称AP)或或核核黄黄素素(ribofavin即即vita min B2，C17H20O6N4)的的作作用用下下聚聚合合交交联联成成 三三 维维 网网 状状 结结 构构 的的 凝凝 胶胶，以以 此此 凝凝 胶胶 为为 支支 持持 物物 的的 电电 泳泳 称称 为为 聚聚 丙丙 烯烯 酰酰 胺胺 凝凝 胶胶 电电 泳泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称，简称PAGE)。单体丙烯酰胺和单体丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺的聚合甲叉双丙烯酰胺的聚合催化剂催化剂AcrBis聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种因素：蛋白大小，形状和电荷。聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种因素：蛋白大小，形状和电荷。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）。十二烷基硫酸钠）。1967年，年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的十二烷等人首先发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠（基硫酸钠（SDS），），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小。则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小。SDS-PAGE的原理的原理SDS的分子式的分子式SDS是一种阴离子去垢剂，是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。因此蛋白质在含有强还原剂的带负电荷。因此蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中溶液中与与SDS分子结合时，可形成分子结合时，可形成SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量带负电荷的蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的好比蛋白质穿上带负电的“外衣外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，使蛋白复合物分解成多个亚基。氨酸之间的二硫键断裂，使蛋白复合物分解成多个亚基。因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质（亚基）分子大小。因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质（亚基）分子大小。使聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应。使聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应。SDS的作用的作用当分子量在当分子量在15KD到到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX式中：式中：MW为分子量，为分子量，X为迁移率，为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。移率即可在标准曲线上求得分子量。有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，它们有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在在SDS和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质，测定时只是它们的和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质，测定时只是它们的亚基或单条肽链的分子量。亚基或单条肽链的分子量。分分子子量量相对迁移率相对迁移率被分离物质分子量与凝胶浓度的选择被分离物质分子量与凝胶浓度的选择分子量范围分子量范围 适用的凝胶浓度适用的凝胶浓度(%)蛋蛋 白白 质质 104 20-301-410415-201-5104-110510-1511055-10 51052-5核核 酸酸(DNA/RNA)104 15-201041055-10 105-21062-2.6按照缓冲液的按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连续系统和不连续系统两大类：值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连续系统和不连续系统两大类：连续系统电泳体系中缓冲液连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应分离。和分子筛效应分离。不连续系统中由于缓冲液离子成分、不连续系统中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度以及电位梯度的不连续性，带电颗粒、凝胶浓度以及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。分辨率均较前者佳。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分类：聚丙烯酰胺凝胶电泳分类：不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为的的Tris-HC1。分离胶是由分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、种孔径的凝胶、2种缓冲体系、种缓冲体系、3种种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。不连续系统的特点不连续系统的特点浓缩胶的作用浓缩胶的作用浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选当样品液和浓缩胶选Tris/HCL缓冲液，电级液选缓冲液，电级液选Tris/甘氨酸。电泳开始后，甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。A.为电泳前为电泳前2层凝胶排列顺序，层凝胶排列顺序，2层胶中均有快离子，慢离子层胶中均有快离子，慢离子B.显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C.显示蛋白质样品分离成数个区带。显示蛋白质样品分离成数个区带。电泳中离子运动示意图电泳中离子运动示意图蛋白质印迹法又称为免疫印迹法，这是一种用抗原抗体的特异性结合来检测固定在固相蛋白质印迹法又称为免疫印迹法，这是一种用抗原抗体的特异性结合来检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法。载体上蛋白质的免疫化学技术方法。蛋白质印迹（蛋白质印迹（western blotting）的概念）的概念将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素/PVDF膜上，然后与能特异膜上，然后与能特异性识别待检测蛋白的一抗（针对待测分子的单克隆抗体或多克隆抗体）进行反应；性识别待检测蛋白的一抗（针对待测分子的单克隆抗体或多克隆抗体）进行反应；洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入二抗（针对一抗的抗体，标记有放射性同位洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入二抗（针对一抗的抗体，标记有放射性同位素或生物素）；素或生物素）；反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。行特异性蛋白的半定量。蛋白印迹基本步骤蛋白印迹基本步骤1.固体相上的蛋白质固体相上的蛋白质2.针对蛋白质的特异性抗体，称为一抗针对蛋白质的特异性抗体，称为一抗3.带上辣根过氧化物酶针对一抗的抗体，称为二抗带上辣根过氧化物酶针对一抗的抗体，称为二抗4.加入底物，在酶的作用下，分解产生荧光加入底物，在酶的作用下，分解产生荧光垂直电泳系统垂直电泳系统蛋白转膜系统蛋白转膜系统阳极阳极阴极阴极滤纸滤纸凝胶凝胶膜膜多孔垫片多孔垫片转膜系统各组件及其位置转膜系统各组件及其位置NGAL（neutrophil gelatinase-associated lipocalin）即中性粒细胞明胶酶相关脂质运即中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，是脂质运载蛋白（载蛋白，是脂质运载蛋白（lipocalin)家族的一个成员。家族的一个成员。NGAL基因的蛋白产物具有保护调节基质金属蛋白酶基因的蛋白产物具有保护调节基质金属蛋白酶-9的活性，作为小分子铁配合的活性，作为小分子铁配合物结合蛋白参与机体铁代谢和天然免疫反应等功能。另外，物结合蛋白参与机体铁代谢和天然免疫反应等功能。另外，NGAL作为一种早期标作为一种早期标志物还可以帮助判定缺血性肾损伤程度。志物还可以帮助判定缺血性肾损伤程度。NGAL的的mRNA信息在信息在NCBI核酸数据库中有来自不同实验室登记的多个版本，包含核酸数据库中有来自不同实验室登记的多个版本，包含完整编码区的有完整编码区的有BC033089和和NM_005564等，编码区长为等，编码区长为597 bp，编码编码198个氨基酸，个氨基酸，包含了包含了N端前部长为端前部长为20个氨基酸的信号肽序列（为核酸序列的个氨基酸的信号肽序列（为核酸序列的1-60 bp）。）。NGAL基因的简介基因的简介NGAL核酸编码区序列及其相应的蛋白序列：核酸编码区序列及其相应的蛋白序列：由由N 端的端的310螺旋、螺旋、C 端的端的螺旋和中间的八段反平行式螺旋和中间的八段反平行式折叠构成了一个折叠构成了一个折叠桶折叠桶结构；结构；在在折叠桶底部内侧排列着疏水的芳香族和脂肪族氨基酸残基，形成了一个疏水核折叠桶底部内侧排列着疏水的芳香族和脂肪族氨基酸残基，形成了一个疏水核或疏水内部，为结合亲脂性配体提供了位点；或疏水内部，为结合亲脂性配体提供了位点；NGAL 在其在其折叠桶封闭端的折叠桶封闭端的4-5 环上有游离的巯基环上有游离的巯基(C87)，这可使这可使NGAL 与一与一些蛋白质分子，如些蛋白质分子，如MMP-9，形成分子间二硫键，并以此来调节这些蛋白的功能或形成分子间二硫键，并以此来调节这些蛋白的功能或活性。活性。NGAL的蛋白三级结构（图为的蛋白三级结构（图为NGAL蛋白的同源二聚体）：蛋白的同源二聚体）：以往，汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教授课题组利用大肠杆菌原以往，汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教授课题组利用大肠杆菌原核表达系统获得了核表达系统获得了NGAL蛋白，但是由原核表达系统对外源蛋白没有类似真核细胞中的蛋白，但是由原核表达系统对外源蛋白没有类似真核细胞中的蛋白修饰，如磷酸化和糖基化，有可能影响这些蛋白在功能研究实验中的效果，为此，蛋白修饰，如磷酸化和糖基化，有可能影响这些蛋白在功能研究实验中的效果，为此，我们选择了毕赤酵母这种真核表达系统来表达我们选择了毕赤酵母这种真核表达系统来表达NGAL蛋白。蛋白。由大肠杆菌表达获得的由大肠杆菌表达获得的NGAL蛋白蛋白实验步骤实验步骤 获得含目的蛋白的酵母上清获得含目的蛋白的酵母上清 SDS-PAGE电泳电泳 蛋白质印迹蛋白质印迹利用毕赤酵母表达系统进行利用毕赤酵母表达系统进行NGAL蛋白外源表达进行验证的蛋白外源表达进行验证的实验技术路线：实验技术路线：构建表达载体构建表达载体转化至酵母菌中转化至酵母菌中筛选阳性转化单克隆筛选阳性转化单克隆筛选高筛选高表达单克隆表达单克隆挑单克隆挑单克隆于培养液于培养液振荡培养振荡培养3 35 5天，加甲醇天，加甲醇诱导目的蛋白的表达诱导目的蛋白的表达离心离心酵母上清酵母上清1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备准备2个干净的小烧杯；个干净的小烧杯；2.把玻璃板在灌胶支架上固定好，放好密封条和隔离板把玻璃板在灌胶支架上固定好，放好密封条和隔离板,固定玻璃板时，两边用力一固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板定要均匀，防止夹坏玻璃板;3.按照下表配制按照下表配制12分离胶与分离胶与4浓缩胶；浓缩胶；4.样品的制备：样品和标准蛋白分别与样品的制备：样品和标准蛋白分别与5倍上样缓冲液按倍上样缓冲液按5：1的比例混匀，并在的比例混匀，并在100度度沸水浴中煮沸水浴中煮5min，取出待用；取出待用；SDS-PAGE凝胶的制作凝胶的制作分离胶分离胶(12%)浓缩胶浓缩胶(4%)超纯水超纯水3.3 ml3 ml30%Acr/Bis4 ml0.66mlBuffer1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 2.5ml0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 1.25ml10%SDS100 l50 l10%Ap50 l25 lTEMED5 l5 l 凝胶的成分凝胶的成分聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套5.按比例配好分离胶按比例配好分离胶,用移液管快速加入，大约用移液管快速加入，大约5厘米左右厘米左右,之后加少许蒸馏水（或异丙醇之后加少许蒸馏水（或异丙醇除泡），静置至胶凝固；除泡），静置至胶凝固；凝胶配制过程要迅速凝胶配制过程要迅速,催化剂催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注胶过要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注胶过程程 最好一次性完成，避免产生气泡；最好一次性完成，避免产生气泡；水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡；水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡；胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面；胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面；6.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶，连续平稳加入缩胶至离边缘倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶，连续平稳加入缩胶至离边缘5mm处，迅速插入梳子，静置到胶凝固。处，迅速插入梳子，静置到胶凝固。梳子需一次平稳插入，梳口处不得有气泡梳子需一次平稳插入，梳口处不得有气泡,梳梳底需水平。底需水平。7.拔出样梳后拔出样梳后,拆掉密封条，在内槽中加入缓冲液；拆掉密封条，在内槽中加入缓冲液；8.上样：上样：marker 5 l 样品样品20 l+5上样上样buffer 5l 共共25l 上样时要记清上样的顺序上样时要记清上样的顺序 微量注射器不可过低微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高以防刺破胶体；也不可过高,样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔10.接通电源，接通电源，100V恒压电泳，至溴酚蓝距凝胶边缘约恒压电泳，至溴酚蓝距凝胶边缘约1cm时，约时，约，停止电泳停止电泳；11.凝胶的处理：凝胶的处理：剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，剥胶时要小心剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，剥胶时要小心,保持分离胶完好无损保持分离胶完好无损,将分离胶做将分离胶做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染色液，染色约好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染色液，染色约4h；染色后的凝胶板用脱染色后的凝胶板用脱色液脱色色液脱色，直到蛋白质区带清晰。直到蛋白质区带清晰。蛋白质印迹操作蛋白质印迹操作将将PVDF膜先置于膜先置于100%甲醇中浸湿甲醇中浸湿15s，然后移至超纯水中浸泡然后移至超纯水中浸泡2min，最后转最后转至转移液中至少平衡至转移液中至少平衡5min；电泳完毕的凝胶，剥落到转移液中平衡电泳完毕的凝胶，剥落到转移液中平衡30min，将转印用的滤纸和海绵垫均用将转印用的滤纸和海绵垫均用转移液浸湿；转移液浸湿；将夹子打开使黑的一面保持水平，在上面垫一张海绵垫，用玻棒擀走里面的气将夹子打开使黑的一面保持水平，在上面垫一张海绵垫，用玻棒擀走里面的气泡，在垫子上垫泡，在垫子上垫2张张1010 cm的滤纸，用玻棒擀去其中的气泡；的滤纸，用玻棒擀去其中的气泡；从转移液中取出平衡好的分离胶盖于滤纸上，用玻棒擀去气泡，将平衡好的从转移液中取出平衡好的分离胶盖于滤纸上，用玻棒擀去气泡，将平衡好的PVDF膜盖于胶上，并去除气泡；膜盖于胶上，并去除气泡；在膜上盖在膜上盖2张张7.08.0 cm的滤纸并除去气泡，最后盖上另一个海绵垫，擀几下的滤纸并除去气泡，最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子；就可合起夹子；将夹子放入转移槽槽中，将夹子放入转移槽槽中，60V转移转移2h，将膜用超纯水漂洗一下，室温晾干将膜用超纯水漂洗一下，室温晾干；蛋白质印迹操作步骤蛋白质印迹操作步骤蛋白印迹系统蛋白印迹系统免疫检测的操作免疫检测的操作将膜用将膜用100甲醇浸湿甲醇浸湿5min，再用超纯水漂洗一下，移至含有再用超纯水漂洗一下，移至含有50ml封闭液的平皿中，室封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭温下脱色摇床上摇动封闭1h；将一抗（大鼠抗人将一抗（大鼠抗人NGAL单克隆抗体）用封闭液单克隆抗体）用封闭液1：200稀释；铺保鲜膜于实验台面，将稀释；铺保鲜膜于实验台面，将抗体溶液（每张膜抗体溶液（每张膜500l液体）加到保鲜膜上；液体）加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，室温下孵从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，室温下孵育育2h；用用PBST在室温下脱色摇床上漂洗两次，每次在室温下脱色摇床上漂洗两次，每次5min，再用再用PBS漂洗一次，漂洗一次，5min；二抗（山羊抗大鼠二抗（山羊抗大鼠IgG HRP）用封闭液用封闭液1：2000稀释并与膜蛋白面接触（每张膜稀释并与膜蛋白面接触（每张膜500l液液体），室温下孵育体），室温下孵育2h；用用PBST在室温下脱色摇床上漂洗两次，每次在室温下脱色摇床上漂洗两次，每次5min，再用再用PBS漂洗一次，漂洗一次，5min，进行化进行化学发光反应。学发光反应。预期预期SDS-PAGE结果：结果：经考马斯亮蓝染色后脱色经考马斯亮蓝染色后脱色Marker样品样品预期蛋白印迹结果预期蛋白印迹结果由毕赤酵母表达的由毕赤酵母表达的NGAL蛋白蛋白分子量分子量25K Da由由大大肠肠杆杆菌菌表表达达的的NGAL蛋蛋白白分分 子子 量量21KDa第三部分：分析其他目的基因在毕赤酵母中高效表达的概率第三部分：分析其他目的基因在毕赤酵母中高效表达的概率实验设计实验设计1.实验目的：用毕赤酵母表达以下目的基因，如实验目的：用毕赤酵母表达以下目的基因，如Fascin，Ezrin，锌指蛋白（见锌指蛋白（见下页）；下页）；2.预测这些基因在毕赤酵母中高效表达的概率；预测这些基因在毕赤酵母中高效表达的概率；3.如果这些基因被预测为低表达，该如何处理；如果这些基因被预测为低表达，该如何处理；4.由于生成的重组蛋白要求切除信号肽，在选择多克隆位点和设计由于生成的重组蛋白要求切除信号肽，在选择多克隆位点和设计PCR引物时应引物时应注意什么问题；注意什么问题；5.检验载体与酵母染色体的不同重组对外源蛋白表达量的影响；检验载体与酵母染色体的不同重组对外源蛋白表达量的影响；6.检验不同培养条件对外源蛋白表达量的影响检验不同培养条件对外源蛋白表达量的影响;7.请结合实验一请结合实验一“蛋白质各种定量方法优缺点的比较蛋白质各种定量方法优缺点的比较”，选择适当的方法检测外，选择适当的方法检测外源基因在酵母中的表达量，并说明理由。源基因在酵母中的表达量，并说明理由。汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教授课题组运用汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教授课题组运用RNAi技术分别技术分别下调下调Fascin和和Ezrin基因在食管癌细胞中的表达基因在食管癌细胞中的表达，可显著降低食管癌细胞的分裂增殖，可显著降低食管癌细胞的分裂增殖与侵袭移动与侵袭移动，说明这两个基因是新的食管癌相关基因，在食管癌的发生发展中可能扮，说明这两个基因是新的食管癌相关基因，在食管癌的发生发展中可能扮演着十分重要的角色。我们还用基因表达芯片分析了这两个基因下调后其他基因的表演着十分重要的角色。我们还用基因表达芯片分析了这两个基因下调后其他基因的表达情况，发现有多个锌指蛋白发生了明显的变化。达情况，发现有多个锌指蛋白发生了明显的变化。PRDM1JMJD2BZC3HAV1EDDKLF9ZCHC7FBXL11ZDHHC18ZNF513MARH6ZNF92 ZNF555NR1D2ZNF277ZNF638FUSZNF292ZNF740SHPRHZNF312ZNF597S2A4RZNF395ZNF610TNAP3ZNF505ZNF642WHSC1ZNF553ZNF652NU153NR4A2Centaurin-gamma-2