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体外放射分析体外放射分析分类：分类：1、竞争性：竞争性：放射免疫分析放射免疫分析RIA竞争性蛋白结合分析竞争性蛋白结合分析CPBA放射受体分析放射受体分析RRA放射酶分析放射酶分析放射微生物分析放射微生物分析2、非竞争性：、非竞争性：免疫放射分析免疫放射分析IRMA一、一、放射免疫分析放射免疫分析RIA原理：P62竞争机制：Ag(不定量)+Ab（有限量）固定量*Ag免疫结合反应形成免疫复合物定量分析的数学基础：免疫结合反应服从质量作用定律P+Q=PQPQK=-PQK值大表示亲和力大由质量作用定律推导的数学模型Q01Q0B2B（1+-+-）+-=0P0KP0P0PQB=-100%P0=Ag+*AgPQ=*AgAbP0Q0=Ab的初始含量当*Ag为固定量时，P0为自变量（实际为Ag）P0与复合物B呈一定的函数关系放免反应的定量依据：剂量反应曲线或叫标准曲线剂量反应曲线的含义以已知的标准品为横坐标，以放射性复合物测定值的某种表达式做纵坐标，绘制剂量-反应曲线P64图41P74图413曲曲线线的的斜斜率率是是关关键键因因素素，斜斜率率不不同同精精密密度不同（度不同（P64图图41）斜率=tg（代表曲线或直线的倾斜度）影响斜率的常见因素有以下几点：1、Ab亲和力：K大，斜率也大2、Ag用量：Ag少，斜率大3、Ag的免疫活性：活性强，斜率大4、*Ag的比活度和放化纯度：5、Ab用量：B=3350%斜率最大。6、反应条件和温度（见后）免疫反应条件要求：1、PH：大多：大多2、M3、反应温度：实验确定、反应温度：实验确定RIA方法学1、操作步骤：P1942、RIA的基本试剂标准抗原基本要求：标准抗原与待测物免疫性必须一致必须高纯度：不纯不能制备抗体，不纯标记物放化纯度达不到要求标准抗原的量必须准确：（用于标准曲线）具有良好的稳定性（能保证较长时间不改变性能）标准抗原的用途：制备抗体制备*Ag标准曲线抗血清抗血清检查抗血清的指标：检查抗血清的指标：1、亲和常数、亲和常数KP1922、交叉反应率、交叉反应率P1933、滴度、滴度标记抗原标记抗原Ag*基本要求：基本要求：免疫活性与待测物及标准品一致免疫活性与待测物及标准品一致适适度度的的比比活活度度：太太高高、化化学学量量少少、不不具具竞竞争争性性，太太低统计误差大。低统计误差大。足够高的放化纯度（足够高的放化纯度（95%）免疫活性检验免疫活性检验：复合物放射性最大结合百分率（B%）=-100%参与反应标记抗原放射性分离方法分离方法非特异分离法：吸附法（活性炭）层析电泳法过滤法磁性分离法沉淀法（聚乙二醇，硫酸胺等）特异分离法特异分离法：双抗法双抗法固相分离法固相分离法葡萄球菌葡萄球菌A蛋白（蛋白（SPA）补充：对分离方法的基本要求1、使结合部分与游离部分尽可能完全分开、使结合部分与游离部分尽可能完全分开2、分离的成份便于放射性测量、分离的成份便于放射性测量3、分离效果不受外界干扰因素的影响、分离效果不受外界干扰因素的影响4、操作简便、分离迅速、重复性好、操作简便、分离迅速、重复性好5、与游离标记物的非特异结合尽可能小、与游离标记物的非特异结合尽可能小6、试剂来源广泛，经济价廉、试剂来源广泛，经济价廉RIA加样方法加样方法1、平衡法：三种反应物同时加样优：简便易掌握重现性好竞争反应较典型缺：灵敏度不高2、顺序加样法：Ag+Ab温育后再加*Ag优：标准曲线起始段斜率高、灵敏度高缺：曲线工作波度范围窄、重现性差3、一天法：（特殊情况下使用）样品采集与保存应注意的几个样品采集与保存应注意的几个问题问题用原样品、新鲜样品、减少存放、最好不纯化、浓缩萃取、减少变异尽快做实验，避免反复冻融尽可能少用添加剂等，抗凝剂也少用。RIA数据处理的数学模型（补充概念）后页放射免疫法的数学模型及处理常用符号及英文缩写的含意：NSB：非特异结合B0%：B0管的放射性测量值与加入总放之比。BQC：质控探样品测量值CPMBN：NSB管的样品测量值CPMF：游离物质样品测量值CPMB：结合的沉淀物样品测量值CPMED50：指B/B0为50%时对应剂量值。ED25、ED70指B/B0为25%、70%所对应的剂量。曲线模型分类曲线模型分类1、针对剂量反应的实际曲线模型：如多项式函数，光滑样条函数，线性内插模型2、直线化模型：（logitlog模型）常用：将标准曲线横坐标各点取对数lgX而纵坐标用logitBx/B0,logitBx/B0=lgBx/B0Bx该直线法标准曲线的零点丢失（零无对数）造成灵敏度降低3、logistic模型：只能用于平衡反应两点改进a：横坐标不取对数而用：横坐标不取对数而用Db：不做：不做NSB，靠计算机计算拟合扣除，靠计算机计算拟合扣除NSB。ad模型：Y=-+dx1+(-)bc有四个参数：a=B0（也称四参数logistic模型）c=ED50b=logitlog直线斜率d=NSB4、五参logistic数模型：abY=-+dx1+(-)bEc引入了一个不对称因子引入了一个不对称因子E。E计算机能求出。计算机能求出。可用于非平衡反应系统可用于非平衡反应系统5、四参数单位点质量作用定律模式：按质量作用定律导出的模式优点：质量作用定律，稳健回归拟合；适于平衡和非平衡系统；个别坏点对曲线影响小。模型的选择（拟合优度法来选）模型的选择（拟合优度法来选）问题：一组数据可用多种模型去处理，如何选用？线性拟合用最小二乘法，选残差平方和最小的模型。非线性拟合用百分比偏差DEV%DEV%=（XX）/X100%DEV%10%即可使用。放射免疫的质量控制放射免疫的质量控制RIA的误差来源：试剂（变性，核素脱落、贮存不当免疫活性等）样品（放置不当，存放条件不同，制备、采集的差异等）操作（加样不准，反应条件改变、分离不统一等）仪器与设备（不统一，差异等）测量（统计涨落）数据处理：拟合不当、方法不一致等。误差分类误差分类系系统统误误差差：原原因因是是确确定定因因素素如如试试剂剂变变性性，称称量量不不准准，批号不同。批号不同。随随机机误误差差：原原因因属属偶偶然然，难难以以确确定定，测测量量结结果果忽忽高高忽低呈双向围某数值波动。忽低呈双向围某数值波动。过过失失误误差差：过过失失造造成成的的误误差差，结结果果失失真真无无规规律律性性可可查。查。质质控控目目的的：找找出出误误差差原原因因、采采取取必必要要措措施施，保保证证实实验结果的可信性。验结果的可信性。质控分类质控分类实验室内质控实验室间质控常常常常用用用用的的的的质质质质控控控控指指指指标标标标：灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度、特特特特异异异异性性性性、精精精精密密密密度度度度、偏偏偏偏差差差差、准准准准确度、稳定性、临床有效性。确度、稳定性、临床有效性。确度、稳定性、临床有效性。确度、稳定性、临床有效性。1、灵敏度：10个B0管均值减去2SD后在标准曲线上查得的剂量值。2、特异性：用交叉反应率来表示3、精密度：同一样品多份测量结果变异的大小。SD可用SD或CV=-100%X4、偏差：偏离真值的程度测定值真值偏差b=-100%真值5、准确度：测量值与真值的符合程度，也叫回收率回收管测量值对照管测量值回收率=-100%回收管内加入的已知量反应准确度评价指标在空白样品中加入已知剂量的待测物得测定值空白值样品回收率=-100%已知值回收率应在90110%之间测定值真值偏差=-100%真值偏差允许在10%之内。注意：测定值应取高、中、低三个剂量区的样品分别求出高、中低三个剂量的回收率和偏差。6、稳定性：指批间重复性。对曲线稳定性考核的常用指标有：ED25、ED50、ED75、B0%、NSB%等。不同批实验中这些值应大体接近。7、临床有效性：阳性率与临床诊断的符合率。与正常值的确定有关。上述几种指标间的关系；靶图。若某点的CV%大于10%应做为坏点剔除。反应精密度的几个指标（反应精密度的几个指标（1、2、3）：）：1、平均批变异系数（ABCV）：指一批实验数据的CV平均值：SDABCV%=-100%X2、反应误差关系（RER）：指一批实验各复管的SD与其X之间的函数关系。SD为CPM的误差。它是反应实验复管平行性好坏的综合指标，不是剂量的误差。RER的计算公式见P85，423RER0.04优秀0.120.040.12差3、精精密密度度图图（P、P图图）：以以剂剂量量lgD为为横横坐坐标标，以各剂量复管的以各剂量复管的SD为纵坐标做的图。为纵坐标做的图。P、P图步骤：图步骤：1）建立剂量反应曲线建立剂量反应曲线2）计算各样品的放射性测量值计算各样品的放射性测量值X和误差和误差SDR3）将将放放射射性性的的X和和SDR通通过过剂剂量量反反应应曲曲线线查查得得剂剂量量D并计算并计算D的的SD即即SD0，或换为，或换为SD0/D=CV%4）以以LgD为横坐标：以为横坐标：以CVD或或SDD为纵坐标做图。为纵坐标做图。PP图的用途图的用途1）确定方法的灵敏度确定方法的灵敏度2）确定剂量反应曲线的有效工作范围确定剂量反应曲线的有效工作范围3）评价评价RIA的最佳工作条件的最佳工作条件4）RIA的质控评价的质控评价5）判断剔除坏点判断剔除坏点3、健健全全性性试试验验：指指用用标标准准品品绘绘制制的的标标准准曲曲线线与用不同释稀度病人样品绘制的曲线应平行。与用不同释稀度病人样品绘制的曲线应平行。影响健全性的因素：影响健全性的因素：a.标准品与待测物性质不同标准品与待测物性质不同b.反应系统有干扰反应反应系统有干扰反应c.待测物在标准品确定的环境中不适宜待测物在标准品确定的环境中不适宜。4、youden图图：在在多多批批实实验验中中每每一一实实验验测测量量的的首首部部和和尾尾部部放放置置二二个个相相同同浓浓度度的的质质控控样样品品，将将其其测测量量值值求求XSD。在直角坐标中，做图如下：。在直角坐标中，做图如下：QCH首首QCMQCLQC首首首样品首样品2SDABD尾尾样样品品QC尾尾A区：准确区区：准确区B区：正偏差区区：正偏差区C区：负偏差区区：负偏差区D区：不精密区区：不精密区意意义义：一一种种简简便便，直直观观、有有效效地地评评价价精精密密度度和和偏偏倚倚的的方法。方法。5、Cusum图图：把把每每批批实实验验的的QC测测定定值值与与靶靶值值相相减减后后做图。做图。评价：评价：1）小斜线连续上升或下降提示有正、负偏差）小斜线连续上升或下降提示有正、负偏差2）小斜线的斜率反映偏差的大小）小斜线的斜率反映偏差的大小3）斜斜线线两两端端点点落落差差的的绝绝对对值值超超出出QC的的3SD说说明明有有偏偏差出现，超出差出现，超出5SD说明有明显偏差，数据不可靠。说明有明显偏差，数据不可靠。反映稳定性的评价指标可有反映稳定性的评价指标可有Cusum图、质控图等。图、质控图等。质质控控图图（Shewart作作用用法法）或或LeveyJennings：可可选选多多种种参参数数如如B0、NSB%、EOX、QC0假假如如选选QC，求出它的，求出它的SD（需多批可靠实验求出平均（需多批可靠实验求出平均SD值）。值）。然然后后作作图图：以以后后的的实实验验中中测测得得的的QCSD可可用用该该图图评价。评价。正常要求：正常要求：大于大于2SD不得超过不得超过5%大于大于3SD不得超过不得超过1%如如果果有有下下列列情情况况之之一一发发生生，说说明明实实验验失失败败、应舍弃该批数据：应舍弃该批数据：1）三个三个QC样品有一个样品有一个SD大于大于3SD2）三个三个QC样品有二个样品有二个SD大于大于2SD3）三个三个QC样品都同侧超出样品都同侧超出1SD