昆明医学院分子生物学实验设计2012.ppt
昆明医学院分子生物学实验设计2012 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望实验名称 高铁血红蛋白还原实验实验目的掌握高铁血红蛋白还原实验的操作及步骤了解G6PD的活性检测实验原理正常红细胞的G6PD能使6磷酸葡萄糖转变为6磷酸葡萄糖酸，同时又能使其辅酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)还原为还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，高铁血红蛋白在NADPH供氢条件下还原成还原血红蛋白。氧化型亚甲基蓝可作为递氢体加速磷酸戊糖旁路代谢中此种作用的速度，当G6PD缺乏时，在递氢体亚甲基蓝加速磷酸戊糖旁路的条件下，高铁血红蛋白还原速度显著降低，因此，可根据高铁血红蛋白还原的速度来了解红细胞有无G6PD缺乏。G6PD的缺陷不能提供足够的NADPH以维持还原型谷胱甘肽（GSH）的还原性（抗氧化作用），在遇到蚕豆中某种因子后更诱发了红细胞膜被氧化，红细胞膜上的磷脂分子中的不饱和脂肪酸氧化生成过氧化脂质，损害细胞膜。G-6-PD有保护正常红细胞免遭氧化破坏的作用，新鲜蚕豆是很强的氧化剂，当G-6-PD缺乏时则红细胞被破坏而致病。亚甲基蓝与血红蛋白结合能力强亚硝酸钠能使血红蛋白变成高铁血红蛋白高铁血红蛋白还原试验意义 当红细胞G-6-PD活性正常时，还原率75%；如G-6-PD缺陷，形成高铁血红蛋白，还原速度远较正常红细胞慢，还原率显著降低。实验试剂高铁血红蛋白还原试验法试剂(自制，有效期内使用)：018 mo1 亚硝酸钠一028 molI 葡萄糖溶液(亚硝酸钠125 g，葡萄糖5o g，加蒸馏水至100 mL，贮存于棕色瓶中，放4冰箱可保存1个月)04 mmolI 亚甲基蓝溶液(先将0.15 g含3个结晶水的亚甲基蓝放入乳钵中，加蒸馏水少量研磨，待溶解后移到100 mL容量瓶中再加蒸馏水至100 mL，混匀过滤，此液可贮存3个月)、生理盐水、蒸馏水。实验仪器抗凝管、紫外分光光度仪、离心机、试管、恒温水浴箱。实验步骤1 将抗凝血以1000 rmin离心沉淀1 5 min，取出调整血细胞与血浆比侧为1：l后再混匀。2 将018 molL 亚硝酸钠一028 molL葡萄糖溶液与04 mmolL亚甲基蓝溶液等量混合形成混合试剂3 取1 5 mm150 mm 试管3支，标明A、B、S，按表1顺序进行操作表1 高轶血红蛋白还原试验操作步骤ABC混合试剂/ml 0.01_生理盐水/ml_0.01_0.18mol/l亚硝酸钠,-0.28mol/l葡萄糖溶液_0.01经调整的全血/ml0.10.10.1来回摇动15-20次,置37水浴箱静置3 h 蒸馏水mL 10.0010.0010.004 颠倒混匀，以“B”管为空白管，在波长635 nm 处测定“A”管及“S”管吸光度。5 高铁血红蛋白还原率(MHb%)=(1一AS)100，MHb%在3174 之间(中间值，杂合子)或30(纯台子)，即为G 6PD活性缺乏，均判断为阳性。MHb%75，则为G6PD活性正常，判断为阴性。实验结果朗伯比尔定律A=lg（1/T）=Kbc（A-吸光度，T-透射比，K-摩尔吸收系数，c-吸光物质的浓度，b-收层厚度）高铁血红蛋白还原率(MHb%)=(1一AS)100，MHb%在3174 之间(中间值，杂合子)或30(纯台子)，即为G 6PD活性缺乏，均判断为阳性。MHb%75，则为G6PD活性正常，判断为阴性。思考题1.根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？（必答）面色苍白贫血伴血尿血红蛋白尿恶心、呕吐说明有溶血性贫血尿呈酱油色蚕豆病典型体征姐姐有过类似情况符合蚕豆病具有遗传性这一特点相关知识蚕豆病是由于遗传性红细胞六磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD酶)缺乏者进食蚕豆后，随后发生的急性溶血性疾病。通过性联不全显性遗传，G-6-PD基因在X染色体上，病人大多为男性，男女之比约为71，在生吃蚕豆后数小时至数日（13天）内突然发热、头晕、烦躁、恶心，尿呈酱油样或葡萄酒色，一般发作26天后能自行恢复，但重者若不及时抢救，会因循环衰竭危及生命。3.从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果。（必答）蚕豆病遗传性葡萄糖-6磷-酸脱氢酶 急性溶血性贫血1，G6PD的缺陷不能提供足够的NADPH以维持还原型谷胱甘肽（GSH）的还原性（抗氧化作用），在遇到蚕豆中某种因子后更诱发了红细胞膜被氧化，红细胞膜上的磷脂分子中的不饱和脂肪酸氧化生成过氧化脂质，损害细胞膜发生溶血。故临床表现为黄疸，精神萎靡，低热。溶血严重发生心力衰竭，造成食欲不振、恶心、呕吐 这些临床症状，心衰最典型的症状是程度不同的呼吸困难，所以病人呼吸急促。2，还原型谷胱甘肽（GSH）是体内重要的抗氧化剂，可以保护一些含SH(氢硫基)的蛋白质或酶免受氧化剂尤其是过氧化物的损害。因G6PD的缺陷不能提供足够的NADPH以维持还原型谷胱甘肽（GSH）的还原性（抗氧化作用），高铁血红蛋白还原成血红蛋白降低。3，高铁血红蛋白还原率(MHb%)在3174 之间(中间值，杂合子)或30(纯台子)，即为G 6PD活性缺乏，均判断为阳性。MHb%75，则为G6PD活性正常，判断为阴性。4,急性溶血性贫血急性溶血性贫血起病急骤、可突发寒战、高热、面色苍白、起病急骤、可突发寒战、高热、面色苍白、腰酸背痛、气促、乏力、烦躁、亦可出现腰酸背痛、气促、乏力、烦躁、亦可出现恶心、呕吐、腹痛恶心、呕吐、腹痛 等胃肠道症状。这是等胃肠道症状。这是由于红细胞大量破坏，其分解产物对机体由于红细胞大量破坏，其分解产物对机体的毒性作用所致。游离血红蛋白在血浆内的毒性作用所致。游离血红蛋白在血浆内浓度加深时，即由尿液排出，出现血红蛋浓度加深时，即由尿液排出，出现血红蛋白尿，尿色如浓红茶或酱油样，白尿，尿色如浓红茶或酱油样，12小时后小时后可出现黄疸，溶血产物损害肾小管细胞，可出现黄疸，溶血产物损害肾小管细胞，引起坏死和血红蛋白沉积于肾小管，以及引起坏死和血红蛋白沉积于肾小管，以及周围循环衰弱等因素，可致急性肾功能衰周围循环衰弱等因素，可致急性肾功能衰竭。竭。4.要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么目的基因？（选答）1.PCR，利用PCR技术由变性-退火-延伸三个基本反应步骤，扩增葡萄糖6磷酸脱氢酶热点基因片段。采用单链构象多态性（SSCP）技术对扩增片段进行分析。用PCR直接测序以确定突变的基因位点检测X染色体内G6PD的基因及扩增其因.5.患者体型瘦小与该病症是否有关，为什么？（选答）无关，体型瘦小跟先天遗传有一点关系，但是后天性的运动跟营养更重要。有蚕豆病不一定就瘦小。蚕豆病不能吃蚕豆，但可以从其它食物中来弥补。蚕豆病最主要的特征是 G6PD缺陷。然而G6PD缺乏症是一种遗传性代谢疾病，G6PD缺陷症有多种临床表现，包括新生儿高胆血红素症、感染及药物引起的急性溶血性贫血和慢性非球形细胞溶血性贫血等。但并不会引起体型瘦小。谢谢观赏
