生物分离工程-细胞破碎.ppt

14.发酵液的预处理和固液分离影响发酵液后处理的主要因素粘度粘度粘度粘度,杂蛋白杂蛋白杂蛋白杂蛋白影响树脂对产物的吸附能力；影响树脂对产物的吸附能力；影响树脂对产物的吸附能力；影响树脂对产物的吸附能力；在萃取操作中，易产生乳化，不利在萃取操作中，易产生乳化，不利在萃取操作中，易产生乳化，不利在萃取操作中，易产生乳化，不利 于于于于两相的分离；两相的分离；两相的分离；两相的分离；污染滤膜，降低滤速污染滤膜，降低滤速污染滤膜，降低滤速污染滤膜，降低滤速高价无机离子高价无机离子高价无机离子高价无机离子 当采用离子交换法提取产物时，影响树脂当采用离子交换法提取产物时，影响树脂当采用离子交换法提取产物时，影响树脂当采用离子交换法提取产物时，影响树脂对生化物质的交换容量对生化物质的交换容量对生化物质的交换容量对生化物质的交换容量发酵液的预处理降低发酵液粘度去除杂蛋白14.1.1 14.1.1 凝聚凝聚和和絮凝絮凝技术技术 这两项技术能有效地改变细胞、菌体和这两项技术能有效地改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态、使之聚集，蛋白质等胶体粒子的分散状态、使之聚集，增大体积，利于过滤，常用于菌体细小且粘增大体积，利于过滤，常用于菌体细小且粘度大的发酵液预处理中。度大的发酵液预处理中。凝 聚定义：在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象，称凝聚。sd电位：可测 电位：电位：电位与扩散层厚度电位与扩散层厚度和电动电荷密度和电动电荷密度q q成成正比。扩散成厚度正比。扩散成厚度又与溶液的离子强度又与溶液的离子强度I I有关。高价阳离子的存在，可压缩扩散层有关。高价阳离子的存在，可压缩扩散层厚度，使电位迅速降低。厚度，使电位迅速降低。常用凝聚剂高价阳离子凝聚能力的次序为：凝聚能力的次序为：AlAl3+3+FeFe3+3+HH+CaCa2+2+MgMg2+2+KK+NaNa+LiLi+常用电解质：常用电解质：AlAl2 2(SO(SO4 4)3 318H18H2 2O O、AlClAlCl3 36H6H2 2O O、FeClFeCl3 3、ZnSOZnSO4 4、MgSOMgSO4 4絮 凝定义：定义：是指在某些高是指在某些高分子絮凝剂存在下，分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使基于架桥作用，使细胞聚集形成粗大细胞聚集形成粗大的絮凝团的过程。的絮凝团的过程。常用絮凝剂：人工高分子聚合物：聚丙烯酰胺、聚苯乙烯，聚乙稀人工高分子聚合物：聚丙烯酰胺、聚苯乙烯，聚乙稀人工高分子聚合物：聚丙烯酰胺、聚苯乙烯，聚乙稀人工高分子聚合物：聚丙烯酰胺、聚苯乙烯，聚乙稀亚胺的衍生物亚胺的衍生物亚胺的衍生物亚胺的衍生物无机高分子聚合物：聚合铝盐、聚合铁盐无机高分子聚合物：聚合铝盐、聚合铁盐无机高分子聚合物：聚合铝盐、聚合铁盐无机高分子聚合物：聚合铝盐、聚合铁盐天然有机高分子絮凝剂：壳聚糖、葡聚糖、明胶、骨天然有机高分子絮凝剂：壳聚糖、葡聚糖、明胶、骨天然有机高分子絮凝剂：壳聚糖、葡聚糖、明胶、骨天然有机高分子絮凝剂：壳聚糖、葡聚糖、明胶、骨胶胶胶胶微生物絮凝剂：糖蛋白，粘多糖，纤维素，核酸微生物絮凝剂：糖蛋白，粘多糖，纤维素，核酸微生物絮凝剂：糖蛋白，粘多糖，纤维素，核酸微生物絮凝剂：糖蛋白，粘多糖，纤维素，核酸聚丙烯酰胺絮凝剂聚丙烯酰胺絮凝剂影响絮凝的因素絮凝剂的加量絮凝剂的加量絮凝剂的加量絮凝剂的加量絮凝剂的分子量絮凝剂的分子量絮凝剂的分子量絮凝剂的分子量溶液的溶液的溶液的溶液的pHpHpHpH搅拌速度搅拌速度搅拌速度搅拌速度搅拌时间搅拌时间搅拌时间搅拌时间14.1.2 14.1.2 14.1.2 14.1.2 杂蛋白的其他去除方法杂蛋白的其他去除方法杂蛋白的其他去除方法杂蛋白的其他去除方法变性沉淀变性沉淀变性沉淀变性沉淀热变性：适于热稳定物质热变性：适于热稳定物质热变性：适于热稳定物质热变性：适于热稳定物质大幅度调整大幅度调整大幅度调整大幅度调整pHpHpHpH：根据产物特性反向调节，：根据产物特性反向调节，：根据产物特性反向调节，：根据产物特性反向调节，加有机溶剂加有机溶剂加有机溶剂加有机溶剂等电点沉淀等电点沉淀等电点沉淀等电点沉淀化合法沉淀化合法沉淀 在酸性溶液中，蛋白质与阴离子形在酸性溶液中，蛋白质与阴离子形成沉淀，如：三氯乙酸，水杨酸盐，钨成沉淀，如：三氯乙酸，水杨酸盐，钨酸盐，苦味酸盐，鞣酸盐，过氯酸盐等酸盐，苦味酸盐，鞣酸盐，过氯酸盐等 在碱性溶液中，与阳离子形成沉淀，在碱性溶液中，与阳离子形成沉淀，如：如：AgAg+，CuCu2+2+，ZnZn2+2+，FeFe3+3+，PbPb2+2+等等14.1.3 14.1.3 高价无机离子的去除高价无机离子的去除GaGaGaGa2+2+2+2+：加入草酸和草酸盐，生成草酸钙；加入磷：加入草酸和草酸盐，生成草酸钙；加入磷：加入草酸和草酸盐，生成草酸钙；加入磷：加入草酸和草酸盐，生成草酸钙；加入磷酸盐，生成磷酸钙酸盐，生成磷酸钙酸盐，生成磷酸钙酸盐，生成磷酸钙MgMgMgMg2+2+2+2+：加入草酸；加入磷酸盐，生成磷酸镁；三：加入草酸；加入磷酸盐，生成磷酸镁；三：加入草酸；加入磷酸盐，生成磷酸镁；三：加入草酸；加入磷酸盐，生成磷酸镁；三聚磷酸钠（聚磷酸钠（聚磷酸钠（聚磷酸钠（NaNaNaNa5 5 5 5P P P P3 3 3 3O O O O10101010），生成可溶性络合物），生成可溶性络合物），生成可溶性络合物），生成可溶性络合物FeFeFeFe3+3+3+3+：加入黄血盐，生成普鲁士兰沉淀：加入黄血盐，生成普鲁士兰沉淀：加入黄血盐，生成普鲁士兰沉淀：加入黄血盐，生成普鲁士兰沉淀14.2 发酵液的固液分离14.2.1 14.2.1 14.2.1 14.2.1 影响固液分离的因素影响固液分离的因素影响固液分离的因素影响固液分离的因素14.2.2 14.2.2 14.2.2 14.2.2 过滤过滤过滤过滤定义：定义：在一定的压力差下，利用在一定的压力差下，利用多孔性介质截留固液悬浮液多孔性介质截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分中的固体粒子，进行固液分离的方法称为过滤。离的方法称为过滤。过滤介质无定形颗粒：无烟煤、砂、颗粒活性炭、铁矿砂等无定形颗粒：无烟煤、砂、颗粒活性炭、铁矿砂等无定形颗粒：无烟煤、砂、颗粒活性炭、铁矿砂等无定形颗粒：无烟煤、砂、颗粒活性炭、铁矿砂等成形颗粒：烧结金属、烧结塑料以及用合成树脂粘成形颗粒：烧结金属、烧结塑料以及用合成树脂粘成形颗粒：烧结金属、烧结塑料以及用合成树脂粘成形颗粒：烧结金属、烧结塑料以及用合成树脂粘结的硅砂、塑料颗粒等，做成圆筒形或板状。结的硅砂、塑料颗粒等，做成圆筒形或板状。结的硅砂、塑料颗粒等，做成圆筒形或板状。结的硅砂、塑料颗粒等，做成圆筒形或板状。非金属织补棉：化学纤维、玻璃纤维织品、长纤维非金属织补棉：化学纤维、玻璃纤维织品、长纤维非金属织补棉：化学纤维、玻璃纤维织品、长纤维非金属织补棉：化学纤维、玻璃纤维织品、长纤维滤布、短纤维滤布。滤布、短纤维滤布。滤布、短纤维滤布。滤布、短纤维滤布。金属织布：不锈钢丝或铁丝等的织布。金属织布：不锈钢丝或铁丝等的织布。金属织布：不锈钢丝或铁丝等的织布。金属织布：不锈钢丝或铁丝等的织布。无纺品：纸、毡、石棉板、合成纤维无纺布等。无纺品：纸、毡、石棉板、合成纤维无纺布等。无纺品：纸、毡、石棉板、合成纤维无纺布等。无纺品：纸、毡、石棉板、合成纤维无纺布等。过滤设备选择的依据被过滤液体的特性被过滤液体的特性被过滤液体的特性被过滤液体的特性 固形物含量固形物含量固形物含量固形物含量1-101-101-101-10是采用连续式过滤机的极限。是采用连续式过滤机的极限。是采用连续式过滤机的极限。是采用连续式过滤机的极限。生产规模：大规模生产规模：大规模生产规模：大规模生产规模：大规模连续式连续式连续式连续式 小规模小规模小规模小规模间歇式间歇式间歇式间歇式操作条件操作条件操作条件操作条件操作要求操作要求操作要求操作要求过滤机的材料：食品和药品工业过滤机的材料：食品和药品工业过滤机的材料：食品和药品工业过滤机的材料：食品和药品工业聚丙烯或聚酯聚丙烯或聚酯聚丙烯或聚酯聚丙烯或聚酯过滤设备板框过滤机板框过滤机优点：优点：结结结结构构构构简简简简单单单单、装装装装配配配配紧紧紧紧凑凑凑凑、过过过过滤滤滤滤面面面面积积积积大大大大、允允允允许许许许采采采采用用用用较较较较大大大大的的的的操操操操作作作作压压压压力力力力，辅辅辅辅助助助助设设设设备备备备少少少少，动动动动力力力力消消消消耗耗耗耗小小小小，过过过过滤滤滤滤和和和和洗洗洗洗涤涤涤涤质质质质量量量量好好好好，对对对对固固固固形形形形物物物物含含含含量量量量要要要要求求求求低低低低，材材材材料料料料选择范围广。选择范围广。选择范围广。选择范围广。缺点：缺点：设设设设备备备备笨笨笨笨重重重重、占占占占地地地地面面面面积积积积多多多多、辅辅辅辅助助助助时时时时间间间间长长长长生生生生产产产产效效效效率低。率低。率低。率低。板框过滤机板框过滤机 真空转鼓过滤机优点：优点：真空转鼓过滤机具有自动化程度高、操作连续、处理真空转鼓过滤机具有自动化程度高、操作连续、处理真空转鼓过滤机具有自动化程度高、操作连续、处理真空转鼓过滤机具有自动化程度高、操作连续、处理量大。特别适合固体含量大（量大。特别适合固体含量大（量大。特别适合固体含量大（量大。特别适合固体含量大（10101010）的悬浮液的分离，在）的悬浮液的分离，在）的悬浮液的分离，在）的悬浮液的分离，在发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌和酵母发酵液或细胞悬发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌和酵母发酵液或细胞悬发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌和酵母发酵液或细胞悬发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌和酵母发酵液或细胞悬浮液的过滤分离。浮液的过滤分离。浮液的过滤分离。浮液的过滤分离。缺点：缺点：由于受真空度的限制，不适于菌体较小和粘度较大的由于受真空度的限制，不适于菌体较小和粘度较大的由于受真空度的限制，不适于菌体较小和粘度较大的由于受真空度的限制，不适于菌体较小和粘度较大的细菌发酵液的过滤，且过滤所得固相的干度不如加压过滤。细菌发酵液的过滤，且过滤所得固相的干度不如加压过滤。细菌发酵液的过滤，且过滤所得固相的干度不如加压过滤。细菌发酵液的过滤，且过滤所得固相的干度不如加压过滤。真空转鼓过滤机真空转鼓过滤机14.2.3 离 心定义：借助离心机旋转所产生的离心力的作用，促使不同大小，不同密度的粒子分离的技术。离心力（单位质量）分离因数粒子的重力沉降速度Stokes 定律：粒子的离心沉降速度离心分离方法差速离心差速离心差速离心差速离心工业上最常用的离心分离方法工业上最常用的离心分离方法工业上最常用的离心分离方法工业上最常用的离心分离方法菌体、菌体、菌体、菌体、细细细细胞胞胞胞大小大小大小大小/m/m离心力离心力离心力离心力/g/g实验实验实验实验室室室室工工工工业业业业规规规规模模模模大大大大肠肠肠肠杆菌杆菌杆菌杆菌2-42-4150015001300013000酵母酵母酵母酵母2-72-71500150080008000血小血小血小血小板板板板2-42-450005000红细红细红细红细胞胞胞胞6-96-912001200淋巴淋巴淋巴淋巴球球球球7-127-12500500肝肝肝肝细细细细胞胞胞胞20-3020-30800800区带离心区带离心区带离心区带离心多用于生化研究多用于生化研究多用于生化研究多用于生化研究 事先在离心管中用某种低分子溶质调配事先在离心管中用某种低分子溶质调配事先在离心管中用某种低分子溶质调配事先在离心管中用某种低分子溶质调配好密度梯度，在密度梯度之上加待处理的料液后好密度梯度，在密度梯度之上加待处理的料液后好密度梯度，在密度梯度之上加待处理的料液后好密度梯度，在密度梯度之上加待处理的料液后进行离心。进行离心。进行离心。进行离心。常用密度梯度物质：常用密度梯度物质：蔗糖、蔗糖、蔗糖、蔗糖、CsClCsCl、NaBrNaBr实验室常用的转子碟片式离心机 是是是是传传传传统统统统离离离离心心心心机机机机，为为为为目目目目前前前前工工工工业业业业上上上上应应应应用用用用最最最最广广广广泛泛泛泛的的的的离离离离心心心心机机机机。分分分分离离离离因因因因数数数数可可可可达达达达1000-200001000-200001000-200001000-20000，最最最最大大大大处处处处理理理理量达到量达到量达到量达到300m300m300m300m3 3 3 3/h/h/h/h，常用于大规模的分离过程，常用于大规模的分离过程，常用于大规模的分离过程，常用于大规模的分离过程。适用范围适用范围 细菌、酵母菌、放线菌、细胞碎片细菌、酵母菌、放线菌、细胞碎片细菌、酵母菌、放线菌、细胞碎片细菌、酵母菌、放线菌、细胞碎片离心分离设备 管式离心机 管式离心机是一种分离效率很高的离心分离设管式离心机是一种分离效率很高的离心分离设管式离心机是一种分离效率很高的离心分离设管式离心机是一种分离效率很高的离心分离设备，其转鼓细长，可在备，其转鼓细长，可在备，其转鼓细长，可在备，其转鼓细长，可在15000-5000015000-5000015000-5000015000-50000的高转速下工作，的高转速下工作，的高转速下工作，的高转速下工作，分离因数可达分离因数可达分离因数可达分离因数可达101010104 4 4 4-610-610-610-6105 5 5 5。它设备简单、操作稳定。它设备简单、操作稳定。它设备简单、操作稳定。它设备简单、操作稳定。适用范围适用范围 细细细细胞胞胞胞、细细细细胞胞胞胞碎碎碎碎片片片片、细细细细胞胞胞胞器器器器、病病病病毒毒毒毒、蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质、核核核核酸酸酸酸等等等等。特特特特别别别别适适适适合合合合一一一一般般般般分分分分离离离离机机机机难难难难以以以以分分分分离离离离的的的的固固固固形形形形物物物物含含含含量量量量1%1%1%1%发酵液的分离。发酵液的分离。发酵液的分离。发酵液的分离。倾析式分离机 是一种靠离心力和螺旋的推动力作用自是一种靠离心力和螺旋的推动力作用自动连续排渣的离心机。具操作连续、适应动连续排渣的离心机。具操作连续、适应性强、结构紧凑和维修方便的优点。分离性强、结构紧凑和维修方便的优点。分离因数为因数为1500-30001500-3000。适用范围 特别适合固形物含量较多的悬浮液的特别适合固形物含量较多的悬浮液的分离。分离。14.3 全发酵液提取全发酵液提取全发酵液的提取全发酵液的提取:从悬浮液中直接提取生化物从悬浮液中直接提取生化物质质膜技术膜技术双水相萃取双水相萃取扩张床扩张床(膨胀床膨胀床):):expended bed adsorption 膨胀床操作过程膨胀床操作过程 全发酵液萃取装置全发酵液萃取装置思考题:1.1.为什么要进行发酵液预处理？为什么要进行发酵液预处理？2.2.絮凝和凝聚的定义和区别。常用的絮凝絮凝和凝聚的定义和区别。常用的絮凝剂剂3.3.发酵液分离的主要方法发酵液分离的主要方法.4.4.分离和过滤的主要设备有哪些分离和过滤的主要设备有哪些?5滤饼的比阻滤饼的比阻X1014cm/g15 15 细胞破碎细胞破碎定义定义:细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中，破碎后的细物最大程度地释放到液相中，破碎后的细胞浆液经固液分离除去细胞碎片后，再采胞浆液经固液分离除去细胞碎片后，再采用不同的分离手段进一步纯化用不同的分离手段进一步纯化.细胞壁的组成和结构细胞壁的组成和结构微生物细胞壁的化学组成和结构微生物细胞壁的化学组成和结构细菌，肽聚糖的网状结构细菌，肽聚糖的网状结构酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质真菌：细胞壁更厚真菌：细胞壁更厚植物细胞壁的化学组成和结构植物细胞壁的化学组成和结构初生壁，次生壁初生壁，次生壁具有很高的机械强度具有很高的机械强度15.2 15.2 细胞破碎技术细胞破碎技术机械法和非机械法机械法和非机械法 机械法主要是利用高压、研磨或超声波等机械法主要是利用高压、研磨或超声波等手段在细胞壁上产生的剪切力达到破碎目手段在细胞壁上产生的剪切力达到破碎目的的.包括高压匀浆法包括高压匀浆法,珠磨法和超声破碎法珠磨法和超声破碎法高压匀浆器高压匀浆器影响匀浆破碎的主要影响匀浆破碎的主要因素是压力、温度和因素是压力、温度和通过匀浆器阀的次数。通过匀浆器阀的次数。高压匀浆法的适用范高压匀浆法的适用范围较广，在微生物细围较广，在微生物细胞和植物细胞的大规胞和植物细胞的大规模处理中常采用模处理中常采用.高速珠磨机高速珠磨机高速珠磨机高速珠磨机(high(high spced bead mill)spced bead mill)研研研研磨是常用的一种方法，磨是常用的一种方法，磨是常用的一种方法，磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻它将细胞悬浮液与玻它将细胞悬浮液与玻它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧璃小珠、石英砂或氧璃小珠、石英砂或氧璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快化铝等研磨剂一起快化铝等研磨剂一起快化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得速搅拌，使细胞获得速搅拌，使细胞获得速搅拌，使细胞获得破碎。破碎。破碎。破碎。在工业规模的破碎中在工业规模的破碎中在工业规模的破碎中在工业规模的破碎中常采用高速珠磨机常采用高速珠磨机常采用高速珠磨机常采用高速珠磨机超声波破碎器超声波破碎器超声波处理细胞悬浮液时，超声波处理细胞悬浮液时，破碎作用受许多因素的影响，破碎作用受许多因素的影响，通常声强和振幅影响很大，通常声强和振幅影响很大，但强度太高易使蛋白质变性，但强度太高易使蛋白质变性，频率的变化影响不明显：此频率的变化影响不明显：此外介质的离子强度、外介质的离子强度、pHpH值、值、菌体的种类和浓度也有很大菌体的种类和浓度也有很大的影响的影响.超声波振荡过程中遇到的最超声波振荡过程中遇到的最大问题就是产生的热量不容大问题就是产生的热量不容易驱散，所以影响了它在大易驱散，所以影响了它在大规模工业上的应用，但在实规模工业上的应用，但在实验室和小规模生产中是一种验室和小规模生产中是一种很好的方法很好的方法15.2.2 15.2.2 非机械法非机械法非机械方法很多，包括酶解、渗透压冲击、冻非机械方法很多，包括酶解、渗透压冲击、冻结和融化、干燥法和化学法溶胞等结和融化、干燥法和化学法溶胞等.1)1)酶解法酶解法 是利用酶反应，分解破坏细胞壁上是利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破碎目的。酶解法可以在特殊的键，从而达到破碎目的。酶解法可以在细胞悬浮液中加入特定的酶，也可以采用自溶细胞悬浮液中加入特定的酶，也可以采用自溶作用。作用。酶解法的优点是发生酶解的条件温和、能选择酶解法的优点是发生酶解的条件温和、能选择性地释放产物、胞内核酸等泄出量少、细胞外性地释放产物、胞内核酸等泄出量少、细胞外形较完整、便于后步分离等；但酶水解价格高，形较完整、便于后步分离等；但酶水解价格高，故小规模应用较广故小规模应用较广.渗透压冲击法冻融法干燥法化学法:采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂。15.2.3 选择破碎方法的依据(1)细胞的处理量(2)细胞壁的强度和结构(3)目标产物对破碎条件的敏感性(4)破碎程度 适宜的操作条件应从高的产物释放率，低的能耗和便于后步提取这二方面进行权衡15.2.4 15.2.4 破碎技术研究的方向破碎技术研究的方向(1)(1)多种破碎法的结合多种破碎法的结合(2)(2)与上游技术结合与上游技术结合(3)(3)与下游操作技术结合与下游操作技术结合15.3 15.3 破碎率的测定破碎率的测定破碎率破碎率R R:细胞破碎的程度细胞破碎的程度.常用的方法是测定目的产物的释放量常用的方法是测定目的产物的释放量:释放的蛋释放的蛋白的量或酶的量白的量或酶的量.15.4 基因工程包涵体的纯化方法包涵体的洗涤和目标蛋白的变性溶解目标蛋白的复性思考题3.