《蛋白质的性质》PPT课件.ppt

变性变性蛋白质空间结构被破坏蛋白质空间结构被破坏;生物活性丧失生物活性丧失;物理化学性质物理化学性质发生改变发生改变(溶解性降低；粘度增加溶解性降低；粘度增加)一级结构未发生改变；分子量不变一级结构未发生改变；分子量不变易被蛋白酶降解易被蛋白酶降解 第第4节节 蛋白质的性质蛋白质的性质影响蛋白质变性的因素影响蛋白质变性的因素物理因素物理因素 高温高温 紫外紫外 剧烈振荡剧烈振荡/搅拌搅拌 高压高压 超声波等超声波等化学因素化学因素:酸碱酸碱 有机溶剂有机溶剂 尿素等尿素等蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀活性蛋白的沉淀活性蛋白的沉淀 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀 硫酸氨沉淀硫酸氨沉淀 等电沉淀等电沉淀有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀原理原理:破坏蛋白质分子外层水膜，加强蛋白质分子之间的破坏蛋白质分子外层水膜，加强蛋白质分子之间的相互作用相互作用.常用的有机溶剂常用的有机溶剂:乙醇乙醇 丙酮丙酮注意！注意！低温下操作低温下操作 缩短操作时间缩短操作时间硫酸氨沉淀硫酸氨沉淀(盐析盐析)原理原理:与自由水分子结合与自由水分子结合 破坏蛋白质分子的水分子层破坏蛋白质分子的水分子层 加强蛋白质分子之间的相互作用加强蛋白质分子之间的相互作用常用的中性盐常用的中性盐:硫酸铵硫酸铵 优点：优点：操作简单操作简单 室温下操作室温下操作 无时间限制无时间限制 可以通过过滤或透析除去样品中的中性盐可以通过过滤或透析除去样品中的中性盐等电沉淀等电沉淀原理原理 在在pI点，蛋白质分子所带静电荷为点，蛋白质分子所带静电荷为0，无静电作，无静电作用力用力 实际通常会将等电沉淀与有机溶剂或硫酸铵沉实际通常会将等电沉淀与有机溶剂或硫酸铵沉淀结合起来进行淀结合起来进行非活性蛋白的沉淀非活性蛋白的沉淀热凝固：热凝固：豆腐豆腐 soybean milk boiled magnesium chloride or acid added proteins precipitated重金属：重金属：适宜的适宜的pH条件下，蛋白质可以与重金属结合条件下，蛋白质可以与重金属结合生物碱试剂生物碱试剂:苦味酸，三氯乙酸，鞣酸等苦味酸，三氯乙酸，鞣酸等 当当pH低于低于pI时时,蛋白质分子带正电荷，可以蛋白质分子带正电荷，可以与带负电的生物碱试剂发生反应形成沉淀。与带负电的生物碱试剂发生反应形成沉淀。第第5节节 蛋白质的纯化蛋白质的纯化原理原理 溶解性溶解性(pI沉淀沉淀,盐析盐析,有机溶剂有机溶剂,温度温度)蛋白分子大小蛋白分子大小(透析透析,超滤超滤,密度梯度密度梯度,凝胶层析凝胶层析)电荷电荷(电泳、离子交换电泳、离子交换)特异性的亲和作用特异性的亲和作用(亲和层析亲和层析)蛋白质纯化的步骤蛋白质纯化的步骤蛋白样品的选择蛋白样品的选择预处理预处理(均质和溶解均质和溶解)粗提粗提(有机溶剂有机溶剂,硫酸铵硫酸铵,等电点等电点)纯化纯化(离子交换离子交换,凝胶过滤凝胶过滤,亲和层析亲和层析,电泳等电泳等)纯蛋白纯蛋白S1 蛋白样品的选择蛋白样品的选择蛋白含量丰富蛋白含量丰富来源广来源广S2 预处理预处理破碎细胞的途径破碎细胞的途径 均质均质 超声波超声波 高压高压 纤维素酶纤维素酶 溶菌酶溶菌酶膜蛋白膜蛋白 以去垢剂破坏膜的脂双层，使膜蛋白完整地释放出来以去垢剂破坏膜的脂双层，使膜蛋白完整地释放出来离心离心S3 粗蛋白的制备粗蛋白的制备有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀等电沉淀等电沉淀S4 蛋白的纯化蛋白的纯化离子交换离子交换凝胶层析凝胶层析亲和层析亲和层析离子交换离子交换依据蛋白质分子所带的静电荷来分离依据蛋白质分子所带的静电荷来分离阴离子交换层析：用于分离带正电荷的蛋白质分子阴离子交换层析：用于分离带正电荷的蛋白质分子阳离子交换层析：用于分离带正电荷的蛋白分子阳离子交换层析：用于分离带正电荷的蛋白分子通常以通常以NaCl溶液进行蛋白洗脱溶液进行蛋白洗脱凝胶过滤层析凝胶过滤层析根据蛋白分子的大小进行分离根据蛋白分子的大小进行分离(分子量分子量)原理原理:大的蛋白分子不能进入填充物的孔径中直接从柱底端大的蛋白分子不能进入填充物的孔径中直接从柱底端流出；小的蛋白分子能够进入填充物的孔径中，因而流出；小的蛋白分子能够进入填充物的孔径中，因而流出柱底端需要的时间更长。流出柱底端需要的时间更长。估算蛋白质的分子量估算蛋白质的分子量亲和层析亲和层析原理原理 蛋白质的配基被固定在不溶性载体上装入柱内蛋白质的配基被固定在不溶性载体上装入柱内.只有目的蛋白可与配基结合，其它杂蛋白流出柱外只有目的蛋白可与配基结合，其它杂蛋白流出柱外.洗脱纯蛋白洗脱纯蛋白纯化过程中蛋白质的稳定性纯化过程中蛋白质的稳定性pH 溶液的pH要严格控制，使蛋白质稳定存在温度温度 温度维持在25 以下(通常大约4)，避免蛋白的热变性蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂 通常在缓冲液中加入蛋白质抑制剂以避免蛋白质的水解