《蛋白质的重要性质》PPT课件.ppt

(一一)胶体性质胶体性质 蛋白质的分子量蛋白质的分子量1 1万万-100-100万之间，其分子直万之间，其分子直径径1-1001-100nmnm之间，在胶体颗粒的范围。之间，在胶体颗粒的范围。蛋白质的水蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为在蛋溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为在蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如白质颗粒表面带有很多极性基团，如 NHNH3 3、COOCOO-、OHOH-、SHSH、CONHCONH2 2等和水有高度亲等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易在蛋白质和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易在蛋白质颗粒外面形成颗粒外面形成层水膜。层水膜。所以蛋白质具有胶体性质，如所以蛋白质具有胶体性质，如布朗运布朗运动动、光散射光散射、电泳电泳、不能透过半透膜不能透过半透膜及及具具有吸附能力有吸附能力等等。利用蛋白质不能透过半透。利用蛋白质不能透过半透膜的性质，可用羊皮纸、火棉胶、玻璃纸膜的性质，可用羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等来分离纯化蛋白质，这个方法称等来分离纯化蛋白质，这个方法称透析透析（dialysis）。）。(一一)胶体性质胶体性质(二二)两性解离及等电点两性解离及等电点 蛋白质同氨基酸一样也是两性电解质，即能和蛋白质同氨基酸一样也是两性电解质，即能和酸作用，也能和碱作用。蛋白质分子中可解离的基酸作用，也能和碱作用。蛋白质分子中可解离的基团除肽链末端的团除肽链末端的-氨基和氨基和-羧基外，主要还是多肽羧基外，主要还是多肽链中氨基酸残基上的侧链基团如链中氨基酸残基上的侧链基团如-氨基、氨基、-羧基、羧基、-羧基、咪唑基，胍基、酚基、疏基等。在一定的羧基、咪唑基，胍基、酚基、疏基等。在一定的pHpH条件下，这些基团能解离为带电基团从而使蛋白质条件下，这些基团能解离为带电基团从而使蛋白质带电。带电。蛋白质的等电点蛋白质的等电点（pIpI）：）：当某蛋白质在一定的当某蛋白质在一定的pHpH的的溶液中，所带的正负电荷相等，它在电场中既不向阳极溶液中，所带的正负电荷相等，它在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的也不向阴极移动，此时溶液的pHpH值叫做该蛋白质的等电值叫做该蛋白质的等电点。点。酸性蛋白、碱性蛋白酸性蛋白、碱性蛋白 蛋白质的带电性质与溶液的蛋白质的带电性质与溶液的pHpH有关。利用蛋白质有关。利用蛋白质的两性解离可以通过电泳分离纯化蛋白质。的两性解离可以通过电泳分离纯化蛋白质。(二二)两性解离及等电点两性解离及等电点 蛋白质受到某些理化因素的影响，其空间结构蛋白质受到某些理化因素的影响，其空间结构发生改变，蛋白质的理化性质和生物学功能随之改发生改变，蛋白质的理化性质和生物学功能随之改变或丧失，但未导致蛋白质一级结构的改变，这种变或丧失，但未导致蛋白质一级结构的改变，这种现象叫现象叫变性作用变性作用（denaturationdenaturation）。物理因素物理因素：加热、紫外线、超声波、高压等；：加热、紫外线、超声波、高压等；化学因素化学因素：强酸、强碱、脲、盐酸胍、去垢：强酸、强碱、脲、盐酸胍、去垢剂、重金属盐等；剂、重金属盐等；(三三)蛋白质的变性蛋白质的变性生物活性丧失（酶）；生物活性丧失（酶）；生物活性丧失（酶）；生物活性丧失（酶）；溶解度降低，粘度增大，扩散系数变小（蛋清）；溶解度降低，粘度增大，扩散系数变小（蛋清）；溶解度降低，粘度增大，扩散系数变小（蛋清）；溶解度降低，粘度增大，扩散系数变小（蛋清）；基团位置改变；基团位置改变；基团位置改变；基团位置改变；对蛋白酶敏感性增大。对蛋白酶敏感性增大。对蛋白酶敏感性增大。对蛋白酶敏感性增大。(三三)蛋白质的变性蛋白质的变性 蛋蛋白白质质的的变变性性作作用用若若不不过过于于剧剧烈烈，则则是是一一种种可可逆逆过过程程。高高级级结结构构松松散散了了的的变变性性蛋蛋白白质质通通常常在在除除去去变变性性因因素素后后，可可缓缓慢慢地地重重新新自自发发折折叠叠形形成成原原来来的的构构象象，恢恢复复原原有有的的理理化化性性质质和和生生物物活活性性，这这种种现现象象称称为为复性复性(renaturation)renaturation)。大多蛋白质变性后，很难复性。大多蛋白质变性后，很难复性。(三三)蛋白质的变性蛋白质的变性(四四)蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀 加入适当试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去加入适当试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层，蛋白质的胶体溶液就不稳定水化层，蛋白质的胶体溶液就不稳定,并将产生沉淀。并将产生沉淀。能使蛋白质沉淀的试剂有：能使蛋白质沉淀的试剂有：1.1.高浓度中性盐高浓度中性盐 （NHNH4 4)2 2SOSO4 4、NaNa2 2SOSO4 4、NaClNaCl（中和蛋白质的电荷）中和蛋白质的电荷）这这种种加加入入盐盐使使蛋蛋白白质质沉沉淀淀析析出出的的现现象象称称为为盐盐析析，用于蛋白质分离制备。用于蛋白质分离制备。2.2.有机溶剂有机溶剂 丙酮、乙醇丙酮、乙醇 (破坏蛋白质水膜破坏蛋白质水膜)Hg Hg2+2+、AgAg+、PbPb+（与蛋白质中带负电基团形与蛋白质中带负电基团形成不易溶解的盐成不易溶解的盐,或改变蛋白质的空间结构或改变蛋白质的空间结构）4.4.生物碱试剂生物碱试剂 苦味酸、目酸、钨酸等苦味酸、目酸、钨酸等 （与蛋白质中带正电荷的基团生成不溶性盐）（与蛋白质中带正电荷的基团生成不溶性盐）(四四)蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀(五五)蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应1.1.双缩脲反应双缩脲反应 双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。双双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多物，此反应称双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应。和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应。通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产物的颜色深浅在产物的颜色深浅在540540nmnm处进行蛋白质的定量测定。处进行蛋白质的定量测定。2.2.酚试剂（酚试剂（Folin-酚试剂）反应酚试剂）反应 蛋白质分子中一般都含有酪氨酸，而酪氨酸蛋白质分子中一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能将中的酚基能将Folin-酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（即钼蓝和钨蓝的混合物）。还原成蓝色化合物（即钼蓝和钨蓝的混合物）。这一反应常用来定量测定蛋白质含量。这一反应常用来定量测定蛋白质含量。可根据反可根据反应产物的颜色深浅在应产物的颜色深浅在540540nmnm处进行蛋白质的定量处进行蛋白质的定量测定测定.(五五)蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应3.3.茚三酮反应茚三酮反应 由由于于蛋蛋白白质质多多肽肽链链两两端端有有游游离离的的-NH2和和-COOH，所所以以蛋蛋白白质质也也可可以以和和茚茚三三酮酮发发生生反反应应。4.考马斯亮兰考马斯亮兰 与与蛋蛋白白质质反反应应形形成成蓝蓝色色透透明明物物质质，在在595nm下进行比色。下进行比色。(五五)蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应(六六)蛋白质的蛋白质的的分离、纯化与鉴定的分离、纯化与鉴定1.1.蛋白质分离、纯化的过程和一般原则蛋白质分离、纯化的过程和一般原则 （1 1）前处理（）前处理（Pretreatment）-细胞破碎，蛋白细胞破碎，蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来。质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来。（2 2）粗分级（）粗分级（Rough fractionation）当蛋白质混当蛋白质混合物的提取液获得后，选用一套适当分离纯化方法，合物的提取液获得后，选用一套适当分离纯化方法，使目的蛋白与大量的杂蛋白分离开。使目的蛋白与大量的杂蛋白分离开。1 1.蛋白质分离、纯化的过程和一般原则蛋白质分离、纯化的过程和一般原则 （3 3）细分级（）细分级（Fine fractionation）是将样品进一是将样品进一步提纯的过程。样品经粗分级以后，一般体积较小，步提纯的过程。样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白已经大部分被除去。杂蛋白已经大部分被除去。（4 4）结晶（）结晶（Crystal）由于结晶中从未发现过变性蛋由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。蛋白质纯也是断定制品处于天然状态的有力指标。蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。(六六)蛋白质的蛋白质的的分离、纯化与鉴定的分离、纯化与鉴定2.2.蛋白质分离纯化的一般方法蛋白质分离纯化的一般方法 （1）根据蛋白质分子大小不同的分离方法）根据蛋白质分子大小不同的分离方法a.透析和超滤透析和超滤 透析（透析（dialysis）b.和超滤（和超滤（ultrafiltration）(六六)蛋白质的蛋白质的的分离、纯化与鉴定的分离、纯化与鉴定2.2.蛋白质分离纯化的一般方法蛋白质分离纯化的一般方法 （1）根据蛋白质分子大小不同的分离方法）根据蛋白质分子大小不同的分离方法b.密度梯度（区带）离心密度梯度（区带）离心 c.凝胶过滤（凝胶过滤（gel filtration）(六六)蛋白质的蛋白质的的分离、纯化与鉴定的分离、纯化与鉴定葡聚糖凝胶过滤2.2.蛋白质分离纯化的一般方法蛋白质分离纯化的一般方法 （2）根据蛋白质溶解度的差异进行分离的方法根据蛋白质溶解度的差异进行分离的方法 a.等电点沉淀（等电点沉淀（isoelectric precipitation）b.蛋白质的盐溶和盐析蛋白质的盐溶和盐析 c.有机溶剂分级分离有机溶剂分级分离(六六)蛋白质的蛋白质的的分离、纯化与鉴定的分离、纯化与鉴定2.2.蛋白质分离纯化的一般方法蛋白质分离纯化的一般方法 （3）根据蛋白质电荷不同的分离方法）根据蛋白质电荷不同的分离方法 a.电泳电泳-在电场中，带电颗粒向着与其带相反电荷的在电场中，带电颗粒向着与其带相反电荷的电极移动，这种现象称电泳（电极移动，这种现象称电泳（electrophoresis）。）。(六六)蛋白质的蛋白质的的分离、纯化与鉴定的分离、纯化与鉴定n影响迁移率的因素：电位梯度影响迁移率的因素：电位梯度 电流密度电流密度 导电性导电性 环境环境pH（分子电荷）分子电荷）离子强度离子强度 分子的大小、形状分子的大小、形状 n根据电泳的原理和影响因素可以设计不同的电根据电泳的原理和影响因素可以设计不同的电泳方法以达到预期的目的泳方法以达到预期的目的n按分离的原理分：区带电泳按分离的原理分：区带电泳 移界电泳移界电泳 等速电泳等速电泳 等电聚焦等电聚焦n按有无支持物分：自由电泳按有无支持物分：自由电泳 支持物电泳支持物电泳n第一代固体介质：第一代固体介质：纸，醋酸纤维素薄膜，硅胶等纸，醋酸纤维素薄膜，硅胶等 n第二代固体介质：第二代固体介质：淀粉，聚丙烯酰胺淀粉，聚丙烯酰胺（多用于蛋白质），（多用于蛋白质），琼脂糖（多用于核酸分离）琼脂糖（多用于核酸分离）聚丙烯酰胺的结构和特点聚丙烯酰胺的结构和特点单体：丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺单体：丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺增速剂：增速剂：TEMEDTEMED（N,N,N,N-N,N,N,N-四甲基乙二胺）、四甲基乙二胺）、3-3-二甲胺丙腈二甲胺丙腈引发剂：过硫酸铵、过硫酸钾、核黄素引发剂：过硫酸铵、过硫酸钾、核黄素特性：机械性能、弹性、透明度、粘着度、孔径特性：机械性能、弹性、透明度、粘着度、孔径大小大小n电泳原理：电泳原理：1.1.最主要的特性是蛋白质的带电行为，产生电最主要的特性是蛋白质的带电行为，产生电荷效应荷效应3.3.分子形状分子形状2.2.蛋白质分离纯化的一般方法蛋白质分离纯化的一般方法 (六六)蛋白质的蛋白质的的分离、纯化与鉴定的分离、纯化与鉴定（3）根据蛋白质电荷不同的分离方法）根据蛋白质电荷不同的分离方法 b.离子交换层析（离子交换层析（ion-exchange chromatography）(六六)蛋白质的蛋白质的的分离、纯化与鉴定的分离、纯化与鉴定2.2.蛋白质分离纯化的一般方法蛋白质分离纯化的一般方法 （3）根据蛋白质电荷不同的分离方法）根据蛋白质电荷不同的分离方法 c.亲和层析法亲和层析法d.（affinity chromatography）(六六)蛋白质的蛋白质的的分离、纯化与鉴定的分离、纯化与鉴定3.3.蛋白质蛋白质分子量的测定方法分子量的测定方法 (1)(1)凝胶过滤测定蛋白质的分子质量凝胶过滤测定蛋白质的分子质量 (2)(2)凝胶过滤层析法（凝胶过滤层析法（gel filtration gel filtration chromatographychromatography）或称为分子排阻层析（或称为分子排阻层析（size size exclusionexclusion）或分子筛层析（或分子筛层析（molecular sieve molecular sieve chromatographychromatography）能够测定完整的蛋白质分子质量能够测定完整的蛋白质分子质量(六六)蛋白质的蛋白质的的分离、纯化与鉴定的分离、纯化与鉴定3.3.蛋白质蛋白质分子量的测定方法分子量的测定方法 (2)(2)SDSSDS（十二烷基硫酸钠）十二烷基硫酸钠）-PAGE-PAGE测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量 (六六)蛋白质的蛋白质的的分离、纯化与鉴定的分离、纯化与鉴定2.2.蛋白质蛋白质分子量的测定方法分子量的测定方法 (3)3)毛细管电泳测定蛋白质的分子质量毛细管电泳测定蛋白质的分子质量 毛细管电泳（毛细管电泳（CECE）则可以在很大程度上克服常则可以在很大程度上克服常规方法时间长、灵敏芽低不利情况。用毛细管电泳规方法时间长、灵敏芽低不利情况。用毛细管电泳测定蛋白质分子量仅需要纳克量蛋白质，而且还可测定蛋白质分子量仅需要纳克量蛋白质，而且还可以用积分仪或电脑联机精确定量。以用积分仪或电脑联机精确定量。(六六)蛋白质的蛋白质的的分离、纯化与鉴定的分离、纯化与鉴定2.2.蛋白质蛋白质分子量的测定方法分子量的测定方法 (4)(4)质谱测定蛋白质分子量质谱测定蛋白质分子量 质质谱谱测测定定蛋蛋白白质质分分子子量量是是近近年年来来发发展展的的一一项项新新技技术术，其其分分辨辨率率和和精精确确度度都都较较前前几几项项技技术术高高。尤尤其其近近几几年年发发展展起起来来的的磁磁质质谱谱可可精精确确测测定定分分子子质质量量20002000DaDa以以下下的的多多肽肽；而而电电喷喷雾雾质质谱谱（ESIESI）可可以以测测5 5万万DaDa的的蛋蛋白白质质，而而且且只只需需要要皮皮摩摩尔尔（pmolpmol）量量的的蛋蛋白质，精确度为白质，精确度为0.01%0.01%。(六六)蛋白质的蛋白质的的分离、纯化与鉴定的分离、纯化与鉴定本章结束本章结束