一节细菌的生化试验.pptx
第一节第一节 细菌的生化试验细菌的生化试验第1页/共154页一、概述（一）、什么是生化试验?指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。第2页/共154页（二）（二）检验细菌的生化试验范围检验细菌的生化试验范围1、糖（醇）类代谢试验2、氨基酸和蛋白质代谢试验3、有机酸盐和铵盐的利用试验4、呼吸酶类试验5、毒性酶类试验第3页/共154页（三）生化试验的方法1.在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培养后,观察培养基的PH值变化。2.在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。3.根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。4.根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。第4页/共154页（四）生化试验的注意事项1、待检菌应是新鲜培养物。培养1824h。2、待检菌应是纯种培养物。3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。4、应做必要的对照试验。5、提高阳性检出率，至少挑取23待检的疑似菌落分别进行试验。第5页/共154页二、糖醇类代谢试验（一）糖醇类发酵试验（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验（三）V-P试验（四）甲基红（MethylRed）试验MR（五）七叶苷水解试验（六）甘油品红试验第6页/共154页（一）糖醇类发酵试验1.原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇），有的只能分解12种糖醇，有的分解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。第7页/共154页常用的糖醇单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖三糖：棉子糖多糖：菊糖、肝糖、淀粉醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇第8页/共154页2、试验方法：用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。置361.0培养13天，每天观察结果。第9页/共154页3、结果观察和记录记录：产酸不产气，阳性，以“+”表示产酸产气，阳性，以“”表示不产酸产气，阴性，以“-”表示第10页/共154页气泡导管气泡气泡阳性阳性阴性培养基变为黄色培养基未变色、无气泡产生第11页/共154页（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验1、原理：细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖；发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。第12页/共154页2、方法取待检菌，以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上，在其中一管加入一层（约1Cm）灭菌的液体石蜡以隔绝空气，在37培养24h天，每天观察结果。第13页/共154页3、结果观察与记录封油管封油管未封油管未封油管发酵型发酵型产酸（黄色）产酸（黄色）产酸（黄色）产酸（黄色）氧化型氧化型不产酸（绿色）不产酸（绿色）产酸（黄色）产酸（黄色）产碱型产碱型不产酸（绿色）不产酸（绿色）不产酸（绿色）不产酸（绿色）第14页/共154页（三）V-P试验1、原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为双乙酰，在-萘酚和肌酸的催化作用下，双乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称VP（+）反应。第15页/共154页2、试验方法（1）奥梅拉（OMeara）法（2）贝立脱（Barritt）氏法（3）快速法第16页/共154页（）奥梅拉法：将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于361 培养48h，每1ml培养液加奥梅拉OMeara试剂0.1ml，摇动试管12min，静置于37恒温箱4h，或在4850水浴放置2h后判定结果。第17页/共154页（2）贝立脱法：将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于361培养2天，每2ml培养液先加入6%a-萘酚纯酒精溶液1ml，再加40%氢氧化钾水溶液0.4ml，摇动25min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或361 培养 4h，如显现红色为阳性，呈黄色或有类似铜色者，可判定为阴性。第18页/共154页（3）快速法：将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中，挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5%-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min，判定结果。不产酸的培养物不能使用。第19页/共154页3、结果观察与记录（1）发酵管出现红色者，为阳性，记V-P +（2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记 V-P -第20页/共154页（四）甲基红试验（MR）1、原理细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢的途径不同，有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红色，为甲基红试验阳性；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液pH5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性。第21页/共154页2、试验方法：挑取新鲜的待试培养物少许，接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于361 或30（以30 较好）培养35天，从第48h起，每日取培养液1ml，加入甲基红指示剂12滴，立即观察结果。第22页/共154页MR-VP试验原理及照片V-P第23页/共154页3、结果观察与记录（1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色为弱阳性，记MR +；（2）呈橘黄色或黄色为阴性，记MR -，迄至发现阴性并培养至第5天仍为阴性，即可判定结果。第24页/共154页MR+MR-第25页/共154页（五）七叶苷水解试验、原理：七叶苷被细菌分解后，生成葡萄糖和七叶素，七叶素与Fe2+结合，生成黑色化合物，使培养基呈黑色，以此鉴别细菌。第26页/共154页2、试验方法：将待试纯培养物少许，接种于七叶苷培养基，于361 培养24h,观察结果。第27页/共154页3、结果观察与记录（1）培养基变为黑色或棕黑色者，为阳性，记录为+（2）培养基不变色者，为阴性，记录为-第28页/共154页（六）甘油品红试验1、原理：某些细菌可分解甘油成为丙酮酸，并进一步脱羧生成乙醛，乙醛与无色品红生成醌式化合物，呈深紫红色，以此鉴别细菌。第29页/共154页2、试验方法：取待检菌的新鲜纯培养物，接种于甘油品红肉汤培养基中，于361 培养8天,并用未接种的培养基在相同条件下培养作为阴性对照，观察结果。第30页/共154页3、结果观察与记录（1）出现紫色或紫红色者,为阳性，记录为+；（2）与对照管颜色相同者,为阴性，记录为-第31页/共154页复习题1、什么是生化试验?2、做生化试验要注意哪些事项？3、简述糖醇类发酵试验的原理，写出其试验方法和结果的记录5、简述甲基红试验（MR）的原理，写出其试验方法和结果的记录第32页/共154页（一）靛基质（吲哚）试验（二）H2S试验（三）尿素酶试验（四）氨基酸脱羧酶试验（五）苯丙氨酸脱氨酶试验 (六)明胶（Gelatin）液化试验三、氨基酸和蛋白质代谢试验第33页/共154页（一）靛基质试验1、原理：某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红色化合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细菌。第34页/共154页2、试验方法：所用试剂:（1）柯凡克(Kovacs)试剂;或（2）欧波试剂第35页/共154页将待检菌小量接种于培养基中，于361 培养2448h时后，加入柯凡克试剂数滴，轻摇试管，呈红色者为阳性。或沿试管壁缓慢加入欧-波试剂约0.5ml覆盖液面，两液接触处呈现玫瑰红色者，为阳性反应，无红色者为阴性反应。第36页/共154页靛基质试验原理及照片 靛基质+第37页/共154页3、结果观察与记录呈现玫瑰红色，为阳性反应，记+无红色者，为阴性反应，记-第38页/共154页（二）硫化氢（H2S）试验1、原理：某些细菌可分解培养基中的含硫氨基酸或含硫化合物，产生硫化氢，硫化氢遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鉴别细菌。第39页/共154页2、试验方法：挑取待检菌，用穿刺接种法接种于三糖铁培养上，于361培养2448h，观察结果。第40页/共154页3、结果观察与记录培养基底部呈黑色，为阳性，记+培养基底部无黑色，为阴性，记-第41页/共154页（三）尿素酶试验1、原理：某些细菌能产生尿素酶，将尿素分解产生氨，氨使培养基变为碱性，使培养基中的酚红指示剂呈粉红色，培养基由黄色变为红色，为阳性。以此鉴别细菌。第42页/共154页2、试验方法：挑取大量培养1824h的待试菌，浓密涂布接种于尿素琼脂斜面上，不要到达底部，留底部作变色对照。培养2、4和24h分别观察一次结果，培养基变为粉红色为阳性，颜色不变者为阴性。如阴性应继续培养至4天，作最终判定。第43页/共154页尿素酶试验图 阳性第44页/共154页3、结果观察与记录培养基变呈粉红色，为阳性，记+培养基颜色不变，为阴性，记 -第45页/共154页（四）氨基酸脱羧酶试验1、原理：某些细菌能产生氨基酸脱羧酶,可使赖氨酸、鸟氨酸生产脱羧作用,生成胺类物质和CO2。胺类物质使培养基呈碱性变紫色，为阳性,如呈黄色为阴性，以此鉴别细菌。第46页/共154页2、试验方法 取待检菌，分别接种于含有氨基酸的培养基内和不含氨基酸的对照培养基内，在361 培养14天，每天观察结果。第47页/共154页3、结果观察与记录试验管呈紫色，对照管呈黄色，为阳性，记+试验管、对照管都呈黄色，为阴性，记 -。第48页/共154页试验管对照管阳性+阴性-对照管变黄试验管变黄第49页/共154页阳性反应试验管颜色变化过程紫色黄色紫色原理：对照管呈黄色，说明有细菌生长。在培养的早期（1012h），细菌发酵葡萄糖产酸使培养液PH下降，指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄色，以后由于氨基酸脱羧生成胺，PH又回升至碱性，指示剂显紫色。第50页/共154页阳性反应试验管颜色变化过程：紫色黄色紫色第51页/共154页（五）苯丙氨酸脱氨酶试验1、原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合物，以此鉴别细菌。第52页/共154页2、试验方法从待检菌琼脂斜面上挑取大量培养物，接种于苯丙氨酸培养基上，在361 培养1824h后，加入氯化铁溶液45滴，转动试管，使试剂与菌苔表面充分接触，立即观察结果。第53页/共154页3、结果观察与记录试验管立即出现绿色，为阳性，记+无色为阴性，记-。第54页/共154页加氯化铁试剂出现绿色+第55页/共154页（六）明胶液化试验1、原理 有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步将多肽水解为氨基酸，明胶失去凝胶性质，使培养基由固态变为液态。第56页/共154页2、试验方法 挑取培养1824h的待试菌，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度。于2022培养714天。明胶高层亦可培养于361。另取一支未接种的培养基一同培养作对照，每天取出两支试管，放入冰箱放置2030min后，再观察结果。第57页/共154页3、结果观察与记录明胶液化，为阳性，+。明胶凝固，为阴性，-。第58页/共154页复习题1、简述靛基质试验的原理，写出其试验方法、结果的记录和注意事项2、简述硫化氢试验的原理，写出其试验结果的记录和注意事项3、简述尿素酶试验的原理，写出其试验方法、结果的记录4、简述氨基酸脱羧酶试验的原理，写出结果的记录、阳性反应试验管颜色变化过程和原理第59页/共154页四、有机酸盐和铵盐的利用试验枸橼酸盐利用试验丙二酸盐利用试验第60页/共154页（一）枸橼酸盐利用试验1、原理：某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，分解枸橼(柠檬)酸盐生成碳酸盐；同时分解培养基的铵盐生成氨，使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿转为深蓝色，为阳性。第61页/共154页2、试验方法 挑取待检菌，在西蒙枸橼酸盐培养基斜面上密集划线接种，在361 培养14天，每天观察结果。第62页/共154页3、结果观察与记录斜面有菌苔生长，培养基斜面变为蓝色或深蓝色，为阳性，记+；无菌苔生长，培养基斜面仍为绿色者，为阴性，记-第63页/共154页枸椽酸盐试验原理及斜面照片 阳性+第64页/共154页（二）丙二酸盐利用试验1.原理:某些细菌可以利用培养基中的丙二酸盐作为唯一碳源,丙二酸盐被分解成碳酸钠,使培养基变为碱性,培养基由草绿色变成蓝色，为阳性，以此鉴别细菌。第65页/共154页2、试验方法 取待检菌新鲜纯培养物，接种于丙二酸钠培养基上，于361 培养48h，观察结果。第66页/共154页3、结果观察与记录培养基由草绿色变成蓝色,为阳性,记+;培养基无颜色变化,为阴性,记-第67页/共154页五、呼吸酶类试验F氧化酶试验F过氧化氢酶试验F硝酸盐还原试验F氰化钾试验第68页/共154页（一）氧化酶试验1.原理:氧化酶使细胞色素C氧化后，氧化型细胞色素C再使盐酸二甲基对苯二胺氧化，使生成玫瑰红色到暗紫色的醌类化合物,再和-萘酚结合,生成吲哚酚蓝,呈蓝色反应，为阳性。第69页/共154页试剂1%-萘酚-乙醇液1%盐酸二甲基对苯二胺第70页/共154页2、试验方法用滴管直接滴加1%盐酸二甲基对苯二胺试剂12滴在培养物上,再加入1%-萘酚-乙醇液12滴,在30秒内判定试验结果。第71页/共154页3、结果观察与记录在30秒内呈蓝色反应,为阳性,记 +不变色或为红色者,为阴性,记 -第72页/共154页成蓝色为+不变色或为红色为-第73页/共154页（二）过氧化氢酶试验1.原理：某些细菌可分泌过氧化氢酶，加入过氧化氢后，可将过氧化氢分解生成水和氧气，产生气泡，即为阳性反应。第74页/共154页2、试验方法挑取固体培养基上的新鲜菌落一环，置于洁净玻片上（或试管），滴加3%过氧化氢液数滴，或在琼脂斜面培养物上直接滴加过氧化氢液，立即观察结果。第75页/共154页3、结果观察与记录产生气泡者，为阳性，记+不产生气泡者，为阴性，记-第76页/共154页（三）硝酸盐还原试验1、原理：某些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，在酸性条件下，亚硝酸盐可生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸再与-萘胺作用，生成红色的化合物，呈红色反应，为阳性反应。第77页/共154页试剂A、对氨基苯磺酸试剂B、-萘胺试剂第78页/共154页2、试验方法取待检菌新鲜纯培养物，在硝酸盐培养基上接种，在361 培养14天，每天取2mL培养液,加入A、B试剂的等量混合物各二滴混匀，立即观察结果。第79页/共154页3、结果观察与记录呈现红色，为阳性，记+若无红色出现，为阴性，记-第80页/共154页（四）氰化钾试验1.原理：氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂,可与呼吸酶作用使酶失去活性,抑制细菌的生长,但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能生长,以此鉴别细菌.第81页/共154页2、试验方法取培养2024h的营养肉汤培养液或菌落1环，接种至对照培养基及氰化钾培养基内，立即以橡胶塞塞紧，361培养2448h，观察结果。第82页/共154页3、结果观察与记录对照管有菌生长，试验管有菌生长为阳性，记+。对照管有菌生长，试验管无菌生长为阴性。记-。第83页/共154页 六、毒性酶类试验F溶血试验F链激酶试验F卵磷脂酶试验F血浆凝固酶试验第84页/共154页（一）溶血试验1、原理：某些细菌在代谢过程中能产生溶血素，可使人或动物的红细胞发生溶解，不同的细菌有不同的溶血反应，借此可鉴别细菌。第85页/共154页2、试验方法有二种：平板法试管法第86页/共154页平板法 将培养物接种于血平板培养基上，361 培养24 48h，观察结果。第87页/共154页溶血试验的溶血类型及现象（1）（甲型）溶血:菌落周围出现较窄的半透明的草绿色溶血环。（2）（乙型）溶血:菌落周围出现较宽的透明溶血环。（3）（-丙型）溶血:菌落周围无溶血环。第88页/共154页甲型（-）溶血乙型（-）溶血丙型（-）溶血第89页/共154页试管法 将待检菌培养液与等量的2%羊血球混合，在361 培养16 18h，观察结果。如溶血，培养液可出现透明状。第90页/共154页3、结果观察与记录有溶血现象，为阳性，记+；无溶血现象，为阴性，记-第91页/共154页（二）链激酶试验1、原理：A群链球菌群能产生链激酶，该酶能使血液中的纤维蛋白酶原变成纤维蛋白酶，而后溶解纤维蛋白，使血凝块溶解,为阳性反应。此试验用于测定链球菌的致病性。阳性反应具有致病性。第92页/共154页2、试验方法 吸取草酸钾血浆0.2 mL(0.01 g草酸钾加5 mL兔血浆混匀，经离心沉淀，吸取上清液)，加入0.8 mL生理盐水，混匀后，再加入待检菌36下培养18-24h肉汤培养物0.5 mL和0.25氯化钙0.25 mL，混匀，放37水浴中，2 min观察一次。第93页/共154页 待血浆凝固后继续观察并记录溶化时间。如2 h内不溶化，继续放置24 h后观察。同时用肉浸液肉汤做阴性对照，用已知的链激酶阳性的菌株做阳性对照。第94页/共154页3、结果观察与记录如凝块全部溶化,为阳性+，凝块24 h仍不溶化,为阴性-第95页/共154页（三）卵磷脂酶试验1、原理：某些微生物能产生卵磷脂酶，在钙离子存在时，能迅速分解卵磷脂，生成不溶性甘油酯和水溶性磷酸胆碱，在卵黄琼脂平板上菌落周围形成不透明的乳浊环或混浊白环，或使血清、卵黄液变混浊，以此鉴别细菌。第96页/共154页2、试验方法（1）卵黄平板法：A法：将待检菌培养物划线接种或点种于卵黄琼脂平板上，361 培养3 6h，观察结果。第97页/共154页菌落白色混浊环，第98页/共154页B 法：先用卵黄磷脂酶抗血清将平板涂一半，置于36 待干后，将待检菌接种于未涂抗血清的一半卵黄琼脂平板上，再转划已涂过抗血清的一半，361 厌氧培养24 48h，观察结果。在未涂抗血清的一半平板上，菌落周围形成较大的不透明乳白色混浊区，在涂抗血清的一半平板上，菌落周围无不透明混浊区，为阳性。两边均无不透明区，为阴性。第99页/共154页菌落周围无混浊白环菌落周围有混浊白环乳糖卵黄琼脂平板,借以确定该菌可否产生卵磷脂酶。卵磷脂酶具抗原性，其活性可被相应抗血清所抑制，第100页/共154页（2）卵黄盐水法 将庖肉培养基培养物经除菌过滤，收集滤液。在两支灭菌试管内，每管加入1%卵黄盐水0.4mL,在一管中加入滤液0.2mL，另一管加入生理盐水0.2mL作对照。在36 水浴中，经2h、4h、8h、24h观察结果。管底发生混浊沉淀，对照管无沉淀者，为阳性。第101页/共154页3、结果观察与记录菌落周围形成较大的不透明区，为阳性。两边均无不透明区，为阴性。管底发生混浊沉淀，对照管无沉淀者，为阳性。两管无沉淀者，为阴性。第102页/共154页（四）血浆凝固酶试验1、原理：致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，附着在细菌的表面，形成凝块；或作用于血浆凝固酶原，使它成为血浆凝固酶，从而使抗凝的血浆发生凝固现象,为阳性。第103页/共154页2、试验方法（1）玻片法：取清洁干燥载玻片，一端滴加一滴生理盐水，另一端滴加一滴兔（人）血浆，挑取菌落分别与生理盐水和血浆混合，5 min内,如血浆内出现团块或颗粒状凝块，而盐水滴仍呈均匀混浊，则为阳性;如两者呈均匀混浊，无凝固则为阴性。第104页/共154页有凝块均匀混浊血浆生理盐水血浆凝固酶试验第105页/共154页（2）试管法 取灭菌小试管3支，各加入血浆无菌水(1:1)0.5ml，1支加入被检菌株的营养肉汤培养液（或浓菌悬液）0.5ml；其余2支作对照管，1支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作阳性对照;另1支加入营养肉汤或0.9氯化钠溶0.5ml作空白对照。将3管同时放37温箱或水浴中培养，每0.5 h观察一次，4 h 内无凝固现象者，观察直至24小时。第106页/共154页阳性反应阴性反应不凝固少量、零散凝固明显的块状凝固巨大块凝固完全凝固，倒置不流动第107页/共154页金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验 第108页/共154页3、试管法的结果观察与记录空白对照管的血浆流动自如，阳性对照管血浆凝固，试验管血浆凝固者为阳性；均无凝固则为阴性。第109页/共154页七、三糖铁（TSI）试验第110页/共154页1、三糖铁试验的原理 如果细菌可利用乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气，培养基全部变黄；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面最后为红色，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，仍保持黄色。如果细菌又能分解含硫化合物，产生硫化氢，培养基底部变黑。第111页/共154页制好的培养基对照管斜面红色，底面黄色培养基全黄色斜面、底部黄色，并产生H2S斜面红色，底部黄色，产生H2S底面黄色，并产生CO2第112页/共154页2、试验方法 以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置361培养1824h，观察结果。第113页/共154页思考题提问：1.志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生H2S。在培养基上应该产生什么现象？2.大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生H2S。在培养基上应该是什么现象？3.沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖，大多数产生H2S，多数产气，在培养基上应该是什么现象？第114页/共154页下面照片所示2-3-4，可能是大肠杆菌、沙门氏菌还是志贺氏菌？答案：2志贺氏菌3沙门氏菌4大肠杆菌第115页/共154页复习题1、什么是生化试验?2、做生化试验要注意哪些事项？3、简述糖酵解试验的原理，写出其试验方法和结果的记录4、简述甲基红试验（MR）的原理，写出其试验方法和结果的记录5、简述靛基质（Imdole）(吲哚)试验的原理，写出其试验方法、结果的记录和注意事项6、简述硫化氢（H2S）试验的原理，写出其试验结果的记录和注意事项第116页/共154页7、简述尿素酶（Urease）试验的原理，写出其试验方法、结果的记录8、简述氨基酸脱羧酶试验的原理，写出结果的记录、阳性反应试验管颜色变化过程和原理9、简述氰化钾试验的原理，写出其试验方法、结果的记录和注意事项第117页/共154页10、写出溶血试验的溶血类型及现象11、简述链激酶试验的原理，12、简述血浆凝固酶试验的原理，并写出玻片法的试验方法13、简述三糖铁（TSI）试验的试验的原理第118页/共154页第二节 血清学试验血清学反应：指相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，所出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。第119页/共154页一、抗原与抗体第120页/共154页（一）抗原1、抗原的概念抗原(Ag)：是指凡能刺激机体免疫系统诱导免疫应答，并能与应答产生的抗体或致敏淋巴细胞发生特异反应的物质。第121页/共154页2、抗原的特性免疫原性免疫反应性第122页/共154页（二）抗体1、抗体是指机体内的淋巴系统细胞在抗原物质的激发下，所合成的一种具有特异性免疫功能的球蛋白(免疫球蛋白)。第123页/共154页第124页/共154页2、抗体的理化性质（1）抗体是球蛋白（2）免疫球蛋白第125页/共154页图2-1兔血清电泳分离图第126页/共154页其后，经对不同免疫血清的电泳分析，超速离心分析和分子量测定等方法，发现大部分抗体活性存在于球蛋白内，但有小部分抗体活性可存在于球蛋白内。它们的离心常数分别为7S和平共处9S，分子量分别为16万和万。因此它们分别被命名为7S球蛋白分子（16万）19S,2巨球蛋白分子(2M,90万)和2A球蛋白分子，所以从早期对抗体性质的研究证明抗体不是由均质性球蛋白组成，而是由异性球蛋白组成。图2-2不同类免疫球收白的电泳分离图第127页/共154页（三）抗原抗体反应（三）抗原抗体反应抗原抗体反应：是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应第128页/共154页1、抗原抗体反应的化学本质、抗原抗体反应的化学本质（1）结构基础第129页/共154页（2）、化学变化：四种分子间作用力参与并促进Ag-Ab的反应电荷引力范登华引力氢键结合力疏水作用第130页/共154页抗原抗体反应的胶体状态的变化过程总结如下。Ag+Ab(AgAb)n特异性结合AgAb电解质亲水胶体带电荷的疏水胶体疏水胶体凝集理化性质改变：亲水胶体转化为疏水胶体第131页/共154页2.反应过程：不可见阶段可见阶段第132页/共154页二、血清学反应的特点：1、具有特异性与交叉性2、具有敏感性3、具有定理特性。4、反应的两个阶段性5、反应的稳定性与可逆性的。第133页/共154页图9-1沉淀反应中没淀量与抗原抗体的比例关系Ag：抗原；Ab：抗体第134页/共154页三、影响血清学试验的的因素三、影响血清学试验的的因素1.抗体2.抗原3.电解质:常用:0.85:0.85氯化钠或各种缓冲液作用:中和胶体粒子上的电荷，使胶体粒子的电势下降，促使抗原抗体复合物从溶液中析出，形成可见的沉淀物或凝集物。4.酸碱度:pH为68进行5.温度:一般以1540为宜，最适为37，第135页/共154页四、四、血清学反应的种类血清学反应的种类1 1、凝集反应2 2、沉淀反应 3、中和反应4、标志抗体技术第136页/共154页（一）凝集试验颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合，在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应第137页/共154页鲜血者红细胞受血者血清O型(抗A、抗B)A型(抗B)B型(抗A)AB型(无)O型-A型+-+-B型+-AB型+-注:“+”表示有凝集反应,“-”表示无凝集反应第138页/共154页（二）、凝集试验的方法1直接凝集法2间接凝集法3抗球蛋白试验第139页/共154页（三）、直接凝集试验1、玻片凝集法（1）原理:用已知抗体作为诊断血清，来检测未知抗原,以鉴定相应的抗原。第140页/共154页（2）方法步骤:、于洁净玻片的一端加诊断血清1 1滴，另一端加生理盐水1 1滴作为阴性对照。、用接种环取待检菌或血细胞的悬液分别涂于诊断血清和生理盐水中。、轻轻转动玻片，使其充分混匀，静置数分钟，观察结果。第141页/共154页抗血清生理盐水待检菌凝集者为+未凝集第142页/共154页（4）诊断血清及类型诊断血清：将已知的抗原注射于动物体，使其产生相应的抗体，采出动物的血液，分离出含有大量抗体的血清，称为诊断血清（或抗血清、免疫血清）抗O O血清：用菌体抗原（O O抗原）免疫动物后所获得的血清。抗H H血清：用鞭毛抗原（H H抗原）免疫动物后所获得的血清。表面抗原血清：用含有表面抗原的菌体免疫动物后所获得的血清。第143页/共154页多价诊断血清：用含有两种（型）的菌体免疫动物后所获得的血清。单价诊断血清：只含有一种（型）特异性抗体的血清。因子诊断血清：把含有多种抗体的混合免疫血清，用具有共同抗原成分的有关细菌将其共同抗体吸收，只留下一种或几种所需的特异性抗体的血清。第144页/共154页诊断血清的使用与保存保存：210 冰箱；无菌取用，有效期2年第145页/共154页操作方法1、制备待检菌悬浮液：12108个/ml，（四）试管凝集法第146页/共154页2、稀释待检血清：取10支试管，依次编号，用吸管加入生理盐水，第1管0.9ml，其余各管均为0.5ml。然后吸取0.1ml待检血清加入第1管内，吹打3次，使混匀，该管含1:10稀释血清。接着用同一吸管从第1管吸出0.5ml加入第2管内，按上法混合，以同法连续稀释至第9管，从该管内吸取0.5ml弃去。如此每管内所含受检血清浓度为前一管的一半，即1:10、1:20、1:401:2560，最后一管留作对照。第147页/共154页3 3、加入抗原：各管加入诊断菌液0.5ml0.5ml，振摇试管架，充分混匀4 4、保温静置：鞭毛凝集反应最好先37静置2h，初步判读结果，然后移放冰箱过夜，再次判读。菌体凝集试验需较高的温度和较长的时间，最好是放37后，移置55 24h。而布鲁菌凝集反应以放置552天最佳。第148页/共154页试管号试管号123456789对对照照生理盐水生理盐水（ml)0.90.50.5 0.5 0.5 0.50.50.50.50.5稀释血清稀释血清（ml)0.10.50.5 0.5 0.5 0.50.50.50.50.5血清稀释血清稀释度度1:101:201:401:801:1601:3201:6401:12801:2560菌悬浮液菌悬浮液（ml)0.50.50.5 0.5 0.5 0.50.50.50.50.5血清最后血清最后稀释度稀释度1:201:401:801:1601:3201:6401:12801:25601:5120试管凝集试验稀释步骤第149页/共154页第150页/共154页结果记录（1）完全凝集：凝集块完全沉于管底。上层液体澄清，以+记录（2）凝集块沉于管底。上层液体稍混浊，以+记录（3）部分凝集，上层液体混浊以+记录（4）很少凝集，液体较混浊以+记录（5）与对照管相同，无变化，以-记录第151页/共154页复习题1、血清学反应、抗原、抗体、抗原抗体反应的概念2、影响血清学试验的因素有哪些？、影响血清学试验的因素有哪些？3、血清学试验、血清学试验常用的电解质有哪些，有什么有哪些，有什么作用？4、写出血清学试验中、写出血清学试验中玻片凝集法的原理和试验的方法步骤。5 5、诊断血清、抗O O血清、抗H H血清、多价诊断血清、单价诊断血清、因子诊断血清的概念第152页/共154页第153页/共154页感谢您的观看！第154页/共154页
