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EBV LMP2 B细胞表位的预测、细胞表位的预测、克隆、表达及其融合蛋白免疫原克隆、表达及其融合蛋白免疫原性的初步研究性的初步研究温州医学院温州医学院2004级硕士学位论文答辩级硕士学位论文答辩答辩人：欧答辩人：欧 琴琴导导 师：张丽芳师：张丽芳 教授教授 夏克栋夏克栋 教授教授专专 业：病原生物学业：病原生物学主主 要要 内内 容容 研究背景研究背景 研究目的研究目的 研究方案研究方案 结结 果果 分析与讨论分析与讨论 结结 论论研研 究究 背背 景景 EB病毒病毒(Epstein-Barr virua,EBV)属于属于疱疹病毒科。引起的主要疾病包括传疱疹病毒科。引起的主要疾病包括传染性单核细胞增多症、移植后淋巴细胞染性单核细胞增多症、移植后淋巴细胞增多症增多症(PTLD)、霍奇金病、霍奇金病、Burkitt淋巴淋巴瘤以及鼻咽癌瘤以及鼻咽癌(NPC)。研研 究究 背背 景景 肿瘤肿瘤 亚型亚型 EBV阳性率阳性率表表1 EBV相关的增生性疾病相关的增生性疾病BurkittBurkitt淋巴瘤淋巴瘤淋巴瘤淋巴瘤 E-BL 100%E-BL 100%S-BL 15%-85%S-BL 15%-85%AIDS-BL 100%AIDS-BL 100%NPC NPC 低分化或未分化低分化或未分化低分化或未分化低分化或未分化 100 100霍奇金病霍奇金病霍奇金病霍奇金病 mc/ld 80%-90%mc/ld 80%-90%ns 30 ns 30T T细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤 fatal IM 100%fatal IM 100%AILD 40%AILD 40%淋巴母细胞瘤淋巴母细胞瘤淋巴母细胞瘤淋巴母细胞瘤 fatal IM 100%fatal IM 100%与器官移植相关与器官移植相关与器官移植相关与器官移植相关 100 100 与与与与AIDSAIDS相关相关相关相关 70 70-80%-80%研研 究究 背背 景景 LMP2不是转化基因，维持不是转化基因，维持EBV潜伏感染。潜伏感染。LMP2成为成为NPC等等EBV相关肿瘤治疗的理想相关肿瘤治疗的理想 靶抗原之一。靶抗原之一。研研 究究 背背 景景表位疫苗是目前研制感染性疾病与恶表位疫苗是目前研制感染性疾病与恶性肿瘤疫苗的方向。性肿瘤疫苗的方向。多表位疫苗能选择性诱导多价、多特多表位疫苗能选择性诱导多价、多特异性应答和控制免疫应答类型。异性应答和控制免疫应答类型。研研 究究 背背 景景 NPC患者血清中能检测患者血清中能检测LMP2抗体。抗体。B细胞表位的研究为单克隆抗体的制备提细胞表位的研究为单克隆抗体的制备提供更充分的依据，以供更充分的依据，以B细胞表位为基础的多肽细胞表位为基础的多肽 抗原可用于血清学检测。抗原可用于血清学检测。研研 究究 目目 的的 1.预测预测EBV LMP2的的B细胞表位，可为其单克隆抗体的制细胞表位，可为其单克隆抗体的制备及表位疫苗设计等研究提供理论依据。备及表位疫苗设计等研究提供理论依据。2.分别构建含预测分别构建含预测B细胞表位多肽的原核重组质粒，采用细胞表位多肽的原核重组质粒，采用6个组氨酸标签个组氨酸标签()表达表位融合蛋白，并用表达表位融合蛋白，并用Ni-NTA树脂亲和层析树脂亲和层析法分别纯化表位融合蛋白。法分别纯化表位融合蛋白。3.将纯化的蛋白分别免疫小鼠，检测其诱导小鼠产生的特将纯化的蛋白分别免疫小鼠，检测其诱导小鼠产生的特异性异性IgG抗体；选择抗原性强的融合蛋白作包被抗原，用抗体；选择抗原性强的融合蛋白作包被抗原，用ELISA检测检测NPC组、组、CA疾病对照组和健康对照组的血清特异性抗体。疾病对照组和健康对照组的血清特异性抗体。为为B细胞表位多肽的免疫原性和抗原性及其在细胞表位多肽的免疫原性和抗原性及其在NPC血清学诊断血清学诊断中的应用价值进行初步探讨。中的应用价值进行初步探讨。研研 究究 方方 案案一、一、EBV LMP2的二级结构分析的二级结构分析和和B细胞表位预测细胞表位预测研研 究究 方方 案案采用采用EXPASY服务器提供的服务器提供的SwissProt蛋白质数据库检索蛋白质数据库检索LMP2完整蛋白质的氨基酸序列完整蛋白质的氨基酸序列(http:/);采用采用EXPASY服务器提供的服务器提供的SOPMA、GOR、nnPredict、HNN方法方法预测预测LMP2二级结构二级结构(http:/tools)；采用采用EXPASY服务器提供的服务器提供的SOSUI方法预测方法预测LMP2跨膜区域跨膜区域(http:/tools)；采用采用EXPASY服务器提供的服务器提供的Hopp&Woods、Emini、Jameson-Wolf、Zimmerman方法预测方法预测LMP2的亲水性、表面可及性、抗原性、极性及的亲水性、表面可及性、抗原性、极性及柔韧性参数柔韧性参数()；对上述方法预测的结果进行综合分析，推断对上述方法预测的结果进行综合分析，推断LMP2的的B细胞表位，并细胞表位，并用吴玉章等建立的抗原性指数用吴玉章等建立的抗原性指数(AI)综合评判综合评判EBV LMP2的的B细胞优势细胞优势表位。表位。研研 究究 方方 案案二、二、EBV LMP2 B细胞表位的克隆、细胞表位的克隆、表达及其融合蛋白的纯化表达及其融合蛋白的纯化研研 究究 方方 案案引物设计与合成引物设计与合成退火获得目的基因退火获得目的基因pET32a(+)/EBV-LMP2 B细胞表位重组质粒的构建细胞表位重组质粒的构建纯化、连接、转化纯化、连接、转化DH5大肠杆菌大肠杆菌转化转化BL21大肠杆菌，诱导、表达、纯化表位融合蛋白大肠杆菌，诱导、表达、纯化表位融合蛋白SDS-PAGE、Western blot分析分析pET32a(+)质粒酶切质粒酶切酶酶切切、测测序序鉴鉴定定研研 究究 方方 案案引物引物 碱基序列碱基序列 酶切位点酶切位点OZLF-67 5TCGAGTTACAGCAGGCTGTTAA BamHI AGGGCGGATCTTCGATGCGG 3OZLF-68 5GATCCCGCATCGAAGATCCGCC XhoI CTTTAACAGCCTGCTGTAAC 3 OZLF-69 5TCGAGTTAAGTGAGATTTAAGGTG 3 BamHI OZLF-70 5GATCCACCTTAAATCTCACTTAAC 3 XhoI OZLF-71 5TCGAGTTAATTCGGGATAAATTC BamHI TGTGCTGGACAATGATTTG 3 OZLF-72 5GATCCAAATCATTGTCCAGCACA XhoI GAATTTATCCCGAATTAAC 3 图图1 pET32a/B细胞表位的重组质粒图细胞表位的重组质粒图研研 究究 方方 案案研研 究究 方方 案案层析纯化蛋白：层析纯化蛋白：灌灌 胶胶Buffer B液调节吸光度和透光度液调节吸光度和透光度样本处理样本处理样本加入层析柱中，收集滤液样本加入层析柱中，收集滤液Buffer B液洗涤，至液洗涤，至A，收集滤液，收集滤液Buffer D液洗涤，至液洗涤，至A，收集滤液，收集滤液Buffer E液洗涤，至液洗涤，至A，收集滤液，收集滤液样本收集样本收集SDS-PAGE分析滤液中目的蛋白分布情况分析滤液中目的蛋白分布情况Buffer B:8M尿素尿素(pH8.0)Buffer D:8M尿素尿素(pH6.8)Buffer E:8M尿素尿素(pH4.0)研研 究究 方方 案案三、三、EBV LMP2 B细胞表位融合蛋白细胞表位融合蛋白免疫原性的初步研究及血清学检测免疫原性的初步研究及血清学检测研研 究究 方方 案案uu动物：动物：动物：动物：ICRICR小鼠小鼠小鼠小鼠uu免疫方式：背部皮下多点注射免疫方式：背部皮下多点注射免疫方式：背部皮下多点注射免疫方式：背部皮下多点注射uu采血方式：眶静脉采血，采血方式：眶静脉采血，采血方式：眶静脉采血，采血方式：眶静脉采血，3 3只只只只/组组组组表表2 动物实验设计动物实验设计 组别组别 数量数量(只只)蛋白蛋白 剂量剂量(ug/只只)注射时间注射时间 取血时间取血时间 9 ozlf-67 50 0、2、3W 2、3、6W 9 ozlf-69 50 0、2、3W 2、3、6W 9 ozlf-71 50 0、2、3W 2、3、6W 9 is蛋白蛋白 50 0、2、3W 2、3、6W 9 PBS 0、2、3W 2、3、6W 研研 究究 方方 案案ELISA检测：检测：uu以纯化的融合蛋白作包被抗原以纯化的融合蛋白作包被抗原uu以以细胞作包被抗原细胞作包被抗原uu选择抗原性强的融合蛋白作包被抗原，检选择抗原性强的融合蛋白作包被抗原，检测测NPC组、组、CA疾病对照组和健康对照组疾病对照组和健康对照组的血清特异性抗体的血清特异性抗体结结 果果一、一、EBV LMP2的二级结构的二级结构 分析和分析和B细胞表位预测细胞表位预测结结 果果H:-螺旋；螺旋；e:-片层；片层；c:无规卷曲；无规卷曲；-:未预测结构；未预测结构；t:-转角转角 图图2 EBV LMP2二级结构预测二级结构预测结结 果果aa 144150 202208 265268 318322 375390 445455 图图2 按按SOSUI程序预测程序预测EBV LMP2蛋白跨膜区蛋白跨膜区膜内区域膜内区域跨膜区跨膜区膜外区域膜外区域结结 果果图图3 各种不同参数对各种不同参数对EBV LMP2的预测结果的预测结果a.亲水性参数亲水性参数 b.极性参数极性参数 c.柔韧性参数柔韧性参数d.表面可及性表面可及性 e.抗原性抗原性 二级结构二级结构 1082,89108,116126,142149,198206,288295,317321,339348,379389,414422,481497 膜外区域膜外区域 144150,202208,265268,318322,375390,445455 亲水性亲水性 1526,3641,4360,6574,9096,101119,176179,199205,236242,414416,483492 表面可及性表面可及性 1318,2022,2532,3964,6782,9092,95112,114116,73 178 199201,203204,235240,378380,383384,416 420,484 496 抗原性抗原性 1083,88109,111121,174179,198207,235241,290293,340 348,380387,413421,471476,483491 极性极性 2023,4555,5759,6574,9094,102117,198203,234342,483491 柔韧性柔韧性 1085,89121,199205,218222,236244,289296,342347,370 378,381383,385388,412420,483493预测方法预测方法 预测结果预测结果结结 果果表表3 应用不同方法预测应用不同方法预测EBV LMP2 蛋白蛋白B细胞表位的肽段位置细胞表位的肽段位置结结 果果 145 199 318 381391 KSLSSTEFIPN 0.028 B细胞表位区域细胞表位区域 氨基酸序列氨基酸序列 抗原性指数抗原性指数表表4 EBV LMP2的的B细胞表位优势区域的平均抗原性指数细胞表位优势区域的平均抗原性指数 二、二、EBV LMP2 B细胞表位的克隆、细胞表位的克隆、表达及其融合蛋白的纯化表达及其融合蛋白的纯化结 果结结 果果图图4 重组质粒重组质粒pET32a/ozlf-67酶切鉴定酶切鉴定1:DNA/Hind DNA Marker;2.pET32a/ozlf-67;3:pET32a/ozlf-67/EcoR I;4:pET32a(+);5:pET32a(+)/EcoR I图图5 重组质粒重组质粒pET32a/ozlf-69酶切鉴定酶切鉴定1:DNA/Hind DNA Marker;2.pET32a/ozlf-69;3:pET32a/ozlf-69/EcoR I;4:pET32a(+);5:pET32a(+)/EcoR I图图6 重组质粒重组质粒pET32a/ozlf-71酶切鉴定酶切鉴定1:DNA/Hind DNA Marker;2.pET32a/ozlf-71;3:pET32a/ozlf-71/EcoR I;4:pET32a(+);5:pET32a(+)/EcoR I重组质粒酶切鉴定重组质粒酶切鉴定结结 果果测序结果测序结果图图7 3个重组的目的基因的测序图个重组的目的基因的测序图结结 果果B细胞表位融合蛋白鉴定细胞表位融合蛋白鉴定图图8 B细胞表位融合蛋白表达产物细胞表位融合蛋白表达产物SDS-PAGE和和Western-Blot分析分析1:蛋白分子标准物；蛋白分子标准物；2:IPTG诱导重组质粒诱导重组质粒pET32a/ozlf-67蛋白表达；蛋白表达；3:IPTG诱导重组质粒诱导重组质粒pET32a/ozlf-69蛋白表达；蛋白表达；4:IPTG诱导重组质粒诱导重组质粒pET32a/ozlf-71蛋白表达；蛋白表达；5:IPTG诱导重组质粒诱导重组质粒pET32a蛋白表达；蛋白表达；6:BL21结结 果果ozlf-67、ozlf-69、ozlf-71融合蛋白和融合蛋白和His蛋白的纯化蛋白的纯化图图9 纯化的纯化的ozlf-67蛋白蛋白SDS-PAGE电泳分析电泳分析1：蛋白分子标准物；：蛋白分子标准物；2：样品穿透液；：样品穿透液；3：Buffer B液滤液；液滤液；4：Buffer C液液滤滤液；液；5-7：Buffer E液液滤滤液液图图10 纯化的纯化的ozlf-69蛋白蛋白SDS-PAGE电泳分析电泳分析1：蛋白分子标准物；：蛋白分子标准物；2：样品穿透液；：样品穿透液；3：Buffer B液液滤滤液；液；4：Buffer C液液滤滤液；液；5-8：Buffer E液液滤滤液液图图11 纯化的纯化的ozlf-71蛋白蛋白SDS-PAGE电泳分析电泳分析1：蛋白分子标准物；：蛋白分子标准物；2：样品穿透液；：样品穿透液；3：Buffer B液滤液；液滤液；4：Buffer C液滤液；液滤液；5-6：Buffer E液滤液液滤液图图12 纯化的纯化的His蛋白蛋白SDS-PAGE电泳分析电泳分析1：蛋白分子标准物；：蛋白分子标准物；2：样品穿透液；：样品穿透液；3：Buffer B液滤液；液滤液；4：Buffer C液滤液；液滤液；5：Buffer E液滤液液滤液结结 果果结结 果果三、三、EBV LMP2 B细胞表位融合细胞表位融合 蛋白免疫原性的初步研究蛋白免疫原性的初步研究结结 果果图图13 不同免疫原在不同时间的抗体均值（不同免疫原在不同时间的抗体均值（XSD）分别包被分别包被3种表位融合蛋白种表位融合蛋白ozlf-67、ozlf-69和和ozlf-71，分别，分别检测检测3 3种表位融合蛋白的免疫血清与种表位融合蛋白的免疫血清与His蛋白免疫血清的抗体效蛋白免疫血清的抗体效价差异。价差异。结结 果果图图14 多肽表位诱导鼠免疫血清的抗体效价的多肽表位诱导鼠免疫血清的抗体效价的ELISA检测结果检测结果*：与：与His蛋白免疫组比较蛋白免疫组比较*结结 果果 细胞作为包被抗原，细胞作为包被抗原，ELISA检测检测3 3种表位融合种表位融合蛋白免疫小鼠制备的鼠血清抗体效价。蛋白免疫小鼠制备的鼠血清抗体效价。图细胞包被图细胞包被ELISA检测鼠免疫血清抗体效价检测鼠免疫血清抗体效价*：与：与His蛋白免疫组比较蛋白免疫组比较*结结 果果 选用选用Ozlf-67融合蛋白为诊断抗原，融合蛋白为诊断抗原，ELISA检测检测NPC组、组、CA疾病对照组及健康对照组血清特异性疾病对照组及健康对照组血清特异性IgG抗体。抗体。图图16 ozlf-67蛋白包被蛋白包被ELISA检测病人血清抗体效价检测病人血清抗体效价*：与正常组比较：与正常组比较*结结 果果分组分组 份数份数 A值值 阳性阳性 阴性阴性 阳性率阳性率 NPC组组 48 0.866 0.231 34 13 70.8 CA组组 68 0.140 0.106 4 64 5.9 正常组正常组 68 0.184 0.067 0 68 0表表5 ozlf-67蛋白包被蛋白包被ELISA检测病人血清抗体阳性率检测病人血清抗体阳性率*与正常组比较与正常组比较*分分 析析 与与 讨讨 论论 预测的预测的B 细胞表位是线性细胞表位是线性B 细胞表位，主要细胞表位，主要的参数有二级结构、跨膜区、亲水性、表面可及的参数有二级结构、跨膜区、亲水性、表面可及性、抗原性以及柔韧性等，抗原性和亲水性是形性、抗原性以及柔韧性等，抗原性和亲水性是形成表位的首要条件，因而优势表位的形成是多种成表位的首要条件，因而优势表位的形成是多种因素综合作用的结果。因素综合作用的结果。分分 析析 与与 讨讨 论论 采用分子生物学方法分别得到了包含预测采用分子生物学方法分别得到了包含预测表位片段的重组质粒，并得到了融合蛋白，为表位片段的重组质粒，并得到了融合蛋白，为进一步表位融合蛋白的免疫学检测奠定基础。进一步表位融合蛋白的免疫学检测奠定基础。分分 析析 与与 讨讨 论论n n3 3种表位融合蛋白均具有良好的免疫原性种表位融合蛋白均具有良好的免疫原性种表位融合蛋白均具有良好的免疫原性种表位融合蛋白均具有良好的免疫原性n nB B细胞表位多肽均能诱导产生特异性抗体细胞表位多肽均能诱导产生特异性抗体细胞表位多肽均能诱导产生特异性抗体细胞表位多肽均能诱导产生特异性抗体n n以细胞作为抗原包被酶标板，以细胞作为抗原包被酶标板，以细胞作为抗原包被酶标板，以细胞作为抗原包被酶标板，B B细胞表位细胞表位细胞表位细胞表位 融合蛋白诱导的小鼠免疫血清与融合蛋白诱导的小鼠免疫血清与融合蛋白诱导的小鼠免疫血清与融合蛋白诱导的小鼠免疫血清与EBVEBV抗原特异抗原特异抗原特异抗原特异性结合，但抗体效价较低，可能是由于单个表位性结合，但抗体效价较低，可能是由于单个表位性结合，但抗体效价较低，可能是由于单个表位性结合，但抗体效价较低，可能是由于单个表位 肽的结合能力较弱。肽的结合能力较弱。肽的结合能力较弱。肽的结合能力较弱。分分 析析 与与 讨讨 论论 选用选用Ozlf67融合蛋白为诊断抗原，融合蛋白为诊断抗原，ELISA检测检测NPC患者血清特异性抗体，用患者血清特异性抗体，用于于NPC的血清学诊断试剂的研制具有临床的血清学诊断试剂的研制具有临床应用价值。应用价值。结结 论论 1.预测预测EBV LMP2的的B细胞表位可能位于其细胞表位可能位于其N端端199209、318322和和381391区段；区段；2.分别成功构建了含分别成功构建了含B细胞表位的重组质粒细胞表位的重组质粒pET32a(+)/ozlf-67、pET32a(+)/ozlf-69和和pET32a(+)/ozlf-71；在；在原核表达系统内分别高效表达了表位融合蛋白原核表达系统内分别高效表达了表位融合蛋白ozlf-67、ozlf-69、ozlf-71；通过亲和层析法得到了纯化的表位融合蛋白。；通过亲和层析法得到了纯化的表位融合蛋白。3.表位融合蛋白免疫小鼠血清学检测，表明表位融合蛋白免疫小鼠血清学检测，表明3个个B细胞表位细胞表位融合蛋白均能刺激机体产生抗体，具有较强的免疫原性，抗体融合蛋白均能刺激机体产生抗体，具有较强的免疫原性，抗体效价随免疫次数增加而升高；表位融合蛋白诱导所产生的抗体效价随免疫次数增加而升高；表位融合蛋白诱导所产生的抗体均能与均能与EBV抗原结合。抗原结合。蛋白作为诊断抗原，具有较强的抗原性，用于蛋白作为诊断抗原，具有较强的抗原性，用于NPC的血清的血清学诊断试剂的研制具有临床应用价值。学诊断试剂的研制具有临床应用价值。首先我要衷心感谢我的导师张丽芳教授、夏克栋教首先我要衷心感谢我的导师张丽芳教授、夏克栋教授三年来对我的悉心指教和无私关怀。本文是在导师的授三年来对我的悉心指教和无私关怀。本文是在导师的悉心指导和严格要求下得以完成。在此向导师致以最诚悉心指导和严格要求下得以完成。在此向导师致以最诚 挚的敬意和感谢！挚的敬意和感谢！感谢基础医学院微免教研室和基础医学院实验平台感谢基础医学院微免教研室和基础医学院实验平台 全体老师给予的帮助和支持！感谢附一和附二检验科老全体老师给予的帮助和支持！感谢附一和附二检验科老师给予实验的帮助！感谢师姐、师弟、师妹及我的同学师给予实验的帮助！感谢师姐、师弟、师妹及我的同学等对我实验的帮助及生活的关心！等对我实验的帮助及生活的关心！我要衷心感谢我的家人，他们的关心和鼓励给予我我要衷心感谢我的家人，他们的关心和鼓励给予我强大的精神动力。他们为我所做的无私奉献将使我终生强大的精神动力。他们为我所做的无私奉献将使我终生感激！感激！最后感谢评审委员和参与本人论文答辩的各位专家最后感谢评审委员和参与本人论文答辩的各位专家教授在百忙之中对本文的指导！教授在百忙之中对本文的指导！致致 谢谢