生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应.ppt

生化实验绪论及蛋白质沉淀变性反应 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望主要内容主要内容绪论实验室一般规则及实验室安全实验报告的撰写及实验成绩的评定本学期实验内容及安排实验一 蛋白质沉淀、变性反应3生物化学实验室规则（1）1 1、遵守纪律，不得无故迟到、早退、大声谈笑。、遵守纪律，不得无故迟到、早退、大声谈笑。2 2、预习，熟悉实验目的、原理、步骤。、预习，熟悉实验目的、原理、步骤。3 3、严格听从教师的指导，及时记录实验原始数据。、严格听从教师的指导，及时记录实验原始数据。4 4、实验场所整洁、公用试剂用后放回原位，实验完毕，清洗、实验场所整洁、公用试剂用后放回原位，实验完毕，清洗实验器皿、收拾台面，方可离开。实验器皿、收拾台面，方可离开。5 5、注意节约试剂，防止损坏仪器。使用贵重仪器时，严格遵、注意节约试剂，防止损坏仪器。使用贵重仪器时，严格遵守操作规程，发现故障，立即报告教师，不得擅自检修。守操作规程，发现故障，立即报告教师，不得擅自检修。4生物化学实验室规则（2）6 6、乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加热，远离火源操作及乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加热，远离火源操作及放置。放置。7 7、所有废液、废弃物等，均收集在指定容器内，不得倒在水、所有废液、废弃物等，均收集在指定容器内，不得倒在水槽内或到处乱仍。强酸和强碱不能直接倒在水槽中，应先稀槽内或到处乱仍。强酸和强碱不能直接倒在水槽中，应先稀释，然后倒入水槽，再用大量自来水冲洗水槽及下水道。释，然后倒入水槽，再用大量自来水冲洗水槽及下水道。8 8、室内严禁吸烟！煤气、水管用完即关。、室内严禁吸烟！煤气、水管用完即关。Long hair should be tied back to avoid burns.In addition,avoid wearing loose articles of clothing such as ties or dangling jewelry that may come into contact with laboratory surfaces.5实验室安全实验室安全-安全用电安全用电使用电学仪器时，要注意电压、电流是否符合仪器的要求，使用电学仪器时，要注意电压、电流是否符合仪器的要求，必要时需使用稳压设备。必要时需使用稳压设备。严格按照电器使用规程操作，不能随意拆卸，摆弄电器。严格按照电器使用规程操作，不能随意拆卸，摆弄电器。严防触电。绝不可用湿手或眼睛旁视时开电闸和电器开关。严防触电。绝不可用湿手或眼睛旁视时开电闸和电器开关。检查电器设备是否漏电时，应使用试电笔。凡是漏电仪器一检查电器设备是否漏电时，应使用试电笔。凡是漏电仪器一律不能使用。律不能使用。6实验室安全实验室安全-防止火灾防止火灾起火的原因：有电流短路，不安全地使用电炉、煤气灯起火的原因：有电流短路，不安全地使用电炉、煤气灯和易燃易爆药物着火。和易燃易爆药物着火。实验必须配备一定数量的消防器材，请按消防规定保管实验必须配备一定数量的消防器材，请按消防规定保管使用，最重要的是每个实验者都应有实验室安全观念，使用，最重要的是每个实验者都应有实验室安全观念，时刻保持警惕。时刻保持警惕。7实验室内严禁贮存大量的易燃物实验室内严禁贮存大量的易燃物(如乙醚、丙酮、乙醇，如乙醚、丙酮、乙醇，苯等苯等)。必须存放的少量即将使用的易燃物，也应将它放在远离必须存放的少量即将使用的易燃物，也应将它放在远离火源处，火焰熄灭后才可大量倾倒这些液体。火源处，火焰熄灭后才可大量倾倒这些液体。低沸点的有机溶剂不准在火焰上直接加热，只能利用带低沸点的有机溶剂不准在火焰上直接加热，只能利用带回流冷凝管的装置在水浴上加热或蒸馏回流冷凝管的装置在水浴上加热或蒸馏。实验室安全实验室安全-防止火灾防止火灾8实验室安全实验室安全-防止火灾防止火灾2008.03.13 2008.03.13 东南大学东南大学2007.03.28 2007.03.28 兰州理工大学兰州理工大学9名称名称 沸点沸点/闪点闪点/自燃点自燃点/乙醚乙醚 34.5 34.54040180180丙酮丙酮 56 561717538538二硫化碳二硫化碳 46 463030100100苯苯 80 801111乙醇乙醇 78 78 12 12400400闪点：液体表面的蒸汽和空气的混合物在遇明火或火花时着火的最低温度。闪点：液体表面的蒸汽和空气的混合物在遇明火或火花时着火的最低温度。自燃点：液体蒸汽在空气中自燃时的温度。自燃点：液体蒸汽在空气中自燃时的温度。常见有机溶剂的易燃性常见有机溶剂的易燃性不能放冰箱中储存！不能在火源附近储存、操作！不能放冰箱中储存！不能在火源附近储存、操作！10易燃物蒸汽在空气中的爆炸极限易燃物蒸汽在空气中的爆炸极限名称爆炸极限(体积百分数)乙醚1.936.5丙酮2.613乙醇3.319氢气4.174.2甲醇6.736.5乙炔382实验室内严禁贮存大量的易燃物！实验室内严禁贮存大量的易燃物！11实验室安全实验室安全-严防中毒严防中毒化学试剂有相对无毒、中度毒性和剧毒之分，在处理剧毒药物时要特别谨慎、小心。国际上常用某些标志标示不同毒型的化学药品。使用毒性物质和致癌物必须根据试剂瓶上标签说明严格操作，安全称量、转移和保管。操作戴手套，必要时戴口罩或防毒面具，并在通风橱中进行。沾过毒性、致癌物的容器应单独清洗、处理。12实验室安全实验室安全-严防中毒严防中毒水银温度计、气量计等汞金属设备破损时必须立即采取措施回收汞，并在污染处撒上一层硫磺粉以防汞蒸气中毒，注意室内通风。2022/12/513警告标志有辐射性有辐射性 安全布告安全布告生物危险品生物危险品2022/12/514高度可燃的高度可燃的爆炸性的爆炸性的危险化学药品标志危险化学药品标志有毒的有毒的腐蚀性的腐蚀性的刺激性有害的刺激性有害的有氧化作用的有氧化作用的2022/12/515氯化钠氯化钠优级纯优级纯化学药品的质量标签化学药品的质量标签2022/12/516氯化钠氯化钠分析纯分析纯化学药品的质量标签化学药品的质量标签2022/12/517氯化钠氯化钠化学纯化学纯化学药品的质量标签化学药品的质量标签18实验室安全实验室安全-避免烧伤和创伤避免烧伤和创伤使用玻璃、金属器材时注意防止割伤及机械创伤。如发生意外，找实验室工作人员(少量急用药物备用)。浓酸、浓碱腐蚀性很强，必须极为小心地操作。用吸量管量取这些试剂(包括有毒物)时，必须使用橡皮球，绝对不能用口吸取。19 实验室安全实验室安全-预防生物危害预防生物危害 微生物、动物的组织、细胞培养物、血液和分泌物 都可能存在细菌和病毒感染的潜在危害，处理生物材料必需小心谨慎，做完实验必须用肥皂、洗涤剂或消毒液洗手。被污染的物品，必须进行高压消毒或烧成灰烬。被污染的玻璃用具应在清洗和高压消毒前立即浸泡在适当的消毒液中。20实验室急救实验室急救 1机械损伤：立即止血，到医院诊治。强碱：先用大量自来水冲洗，再用5%硼酸溶液或 2%乙酸溶液涂洗。强酸：大量自来水冲洗，再以5%碳酸氢钠溶液洗涤。酚：用酒精洗涤。煤气中毒：立即到室外，严重者就医。21实验室急救实验室急救 2玻璃割伤：检查伤口内有无玻璃碎片，硼酸水洗净，涂擦碘酒或红汞水，必要时用纱布包扎。烫伤：浓酒精消毒，涂上苦味酸软膏。触电：关闭电源 用干木棍使电线与被害者分开。着火：汽油、乙醚等有机溶剂：石棉布、沙土 电线：切断电源或用四氯化碳灭火器 衣服：勿奔走，湿衣包裹或躺地滚动。22实验报告的撰写实验报告的撰写实验报告分为以下几部分：实验报告分为以下几部分：原理原理实验步骤实验步骤结果与讨论结果与讨论问答问答实验成绩的评定：实验成绩的评定：实验报告实验报告平时操作、表现平时操作、表现姓名，班级，学号，课室，实验时间、实验教师实验内容及安排实验内容及安排(72学时学时)1、绪论、蛋白质沉淀、变性反应绪论、蛋白质沉淀、变性反应 9月月26-272、蛋白蛋白质质浓度测定浓度测定考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法 10月月10-113、阳离子交换树脂层析分离氨基酸阳离子交换树脂层析分离氨基酸 10月月17-184、血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 10月月24-255、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白 10月月31-11月月16、影响酶促反应速度因素影响酶促反应速度因素最适最适pH、激活剂激活剂（抑制剂抑制剂）11月月7-87、脂肪酶活性的测定脂肪酶活性的测定 11月月14-158、过氧化氢酶米氏常数测定、过氧化氢酶米氏常数测定 11月月21-22实验内容及安排实验内容及安排（续）（续）9、糖的定量测定糖的定量测定 11月月28-2910、维生素维生素C的定量测定的定量测定 12月月5-611、脂肪酸脂肪酸B氧化作用氧化作用 12月月12-1312、转氨基作用、转氨基作用 12月月19-2013、鱼类鱼类DNA的提取的提取 12月月26-2714、核酸浓度测定核酸浓度测定UV吸收法吸收法 1月月2-315、聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）1月月2-316、DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳 1月月9-10一、实验目的一、实验目的 1 1、了解蛋白质的一些理化性质，认识蛋白质的、了解蛋白质的一些理化性质，认识蛋白质的 可逆反应和不可逆反应。可逆反应和不可逆反应。2、了解蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的了解蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的 原理及它们的相互关系。原理及它们的相互关系。实验一实验一 蛋白质沉淀、变性反应蛋白质沉淀、变性反应 蛋白质是由氨基酸组成的大分子化合物,其分子量颇大，介于一万到百万之间，是一种亲水胶体。蛋白质分子表面的亲水基团（-OH,-COOH,-NH3,以及肽键）等，在水溶液中能与水分子起水化作用（Hydration），使蛋白质分子表面形成一个水化层水化层。每克蛋白质分子能结合0.3-0.5克水。蛋白质分子表面上的可解离基团，在适当的PH条件下，都带有相同的净电荷，与其周围的反离子构成稳定的双电层双电层。二、实验原理二、实验原理 由于蛋白质溶液具有水化层和双电层两方面的稳定因素，所以胶体系统是相当稳定的。在一定物理化学因素(如盐析、重金属离子、有机酸、无机酸和加热)影响下,蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，以固态形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应。这种反应可分为两种类型：1、可逆沉淀反应：蛋白质分子内部结构并未发生显著变化，基本保持 原有的性质，沉淀因素除去后，能溶于原来的溶剂中。2、不可逆沉淀反应：蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏，失去原来的天然性质。蛋白质溶液的沉淀稳定是相对的，有条件的。如果条件发生改变，破坏了蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。蛋白质分子表面蛋白质分子表面水化层水化层双电层双电层稳定的亲水胶稳定的亲水胶脱水，失去电荷脱水，失去电荷沉淀反应沉淀反应可逆沉淀反应可逆沉淀反应（不变性沉淀反应）（不变性沉淀反应）如：盐析作用如：盐析作用不可逆沉淀反应不可逆沉淀反应（变性沉淀反应）（变性沉淀反应）如：重金属盐沉淀作用如：重金属盐沉淀作用蛋白质沉淀变性的常见方法蛋白质沉淀变性的常见方法常用方法常用方法原理原理常用试剂常用试剂实用实用盐析盐析破坏蛋白质胶体溶液的水化层和电荷破坏蛋白质胶体溶液的水化层和电荷层层(NH4)2S04、Na2S04、Na3P04、NaCl、MgS04常用此法来分离和纯化蛋白质。常用此法来分离和纯化蛋白质。有机试剂盐有机试剂盐析析脱水作用；降低水的介电常数和蛋白脱水作用；降低水的介电常数和蛋白质溶解度；蛋白质析出质溶解度；蛋白质析出乙醇、丙酮、甲醇乙醇、丙酮、甲醇低温乙醇提取血液中的蛋白质组低温乙醇提取血液中的蛋白质组分分强酸、强碱强酸、强碱沉淀沉淀破坏蛋白质分子结构发生蛋白质变性破坏蛋白质分子结构发生蛋白质变性盐酸盐酸,硫酸硫酸,硝酸、氢氧硝酸、氢氧化钠化钠 灭活病毒灭活病毒加热加热变性变性鸡蛋、肉类等加工鸡蛋、肉类等加工重金属盐沉重金属盐沉淀淀变性；生成不溶性盐变性；生成不溶性盐Ag+Ag+，Hg2+Hg2+，Cu2+Cu2+和和Pb2+Pb2+临床上常用蛋清或牛乳解救误服临床上常用蛋清或牛乳解救误服重金属盐的病人重金属盐的病人有机酸沉淀有机酸沉淀生成不溶性盐生成不溶性盐苦味酸、鞣酸、三氯醋酸、苦味酸、鞣酸、三氯醋酸、磺基水杨酸等生物碱试剂磺基水杨酸等生物碱试剂沉淀蛋白滤液等沉淀蛋白滤液等三、实验材料及设备三、实验材料及设备蛋白质溶液：取10ml鲜鸡蛋清，用蒸馏水稀释至100ml，搅拌后用4-8层纱布过滤，新鲜配制。蛋白质氯化钠溶液：取20ml蛋清，加蒸馏水200ml和饱和氯化钠溶液l00ml，充分搅匀后用4-8层纱布滤去不溶物（加氯化钠的目的是溶解球蛋白）。1.材料材料2.试剂3%硝酸银，0.5%乙酸铅，10%三氯乙酸溶液，饱和硫酸铵溶液，10%氢氧化钠溶液，浓盐酸，浓硫酸，浓硝酸，5%磺基水杨酸，0.1%硫酸铜，饱和硫酸铜溶液，0.1%乙酸，10%乙酸，饱和氯化钠溶液，硫酸铵粉。3.器材水浴锅,漏斗,滤纸,吸管,试管及试管架,量筒等。四、实验内容四、实验内容1.蛋白质的可逆反应蛋白质的可逆反应蛋白质的盐析蛋白质的盐析步骤步骤现象现象解释结论解释结论取一支试管，加入3mL蛋白质氯化钠溶液和等量的饱和硫酸铵溶液，混匀，静置10分钟观察有无蛋白质（球蛋白）的沉淀过滤后，向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅拌，直至粉末不再溶解，直至饱和观察有无沉淀（清蛋白）析出静置，弃去上清液，取出部分清蛋白，加少量蒸馏水观察沉淀的再溶解操作现象操作现象Tube 11mL蛋白质溶液 3-4滴3%硝酸银溶液 过量的硝酸银 Tube 21mL蛋白质溶液 1-3滴0.5%乙酸铅 过量的乙酸铅 Tube 31mL蛋白质溶液 3-4滴0.1%硫酸铜 过量的硫酸铜 2.蛋白质的不可逆反应蛋白质的不可逆反应2.1.重金属离子沉淀蛋白质（3支试管）操作现象Tube 10.5mL蛋白质溶液数滴10%三氯乙酸溶液 Tube 20.5mL蛋白质溶液数滴5%磺基水杨酸2.蛋白质的不可逆反应蛋白质的不可逆反应2.2 有机酸沉淀蛋白质（2支试管）操作现象操作现象Tube 115滴浓盐酸 沿管壁加入6滴蛋白质溶液，勿摇 振荡Tube 215滴浓硫酸 沿管壁加入6滴蛋白质溶液，勿摇 振荡Tube 315滴浓硝酸 沿管壁加入6滴蛋白质溶液，勿摇 振荡2.蛋白质的不可逆反应蛋白质的不可逆反应2.3 无机酸沉淀蛋白质（3支试管）2.蛋白质的不可逆反应蛋白质的不可逆反应2.4 加热沉淀蛋白质 试剂试剂管号管号蛋白质溶液蛋白质溶液0.1%乙酸乙酸10%乙酸乙酸 饱和饱和NaCl 10%NaOH纯净水纯净水123451010101010-5-55-2-2722-5取试管5支按下表添加试剂和操作（单位：滴）操作步骤编号混匀沸水浴中加热10分钟中和过量的酸或碱1Pro.+d.H2O2Pro.+0.1%乙酸+d.H2O3Pro.+10%乙酸+d.H2O4Pro.+10%乙酸+饱和NaCl5Pro.+10%NaOH+d.H2O2.4 加热沉淀蛋白质的总结卵清蛋白的PI(等电点)=4.7；“+”表示沉淀；“-”表示沉淀未生成，或沉淀溶解；沉淀的多少，以“+”的多少表示五、注意事项五、注意事项实验操作强酸强碱时，一定注意自身和同学的安全，防止接触衣服、鞋和皮肤。为观察到正常现象，需将试管洗刷洁净。浓度较高的蛋白质溶液，实验现象更明显。变性蛋白质一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质沉淀，在一定条件下，变性的蛋白质也可不发生沉淀。1、蛋白质分子中哪些基团分别可以与重金属离子和有蛋白质分子中哪些基团分别可以与重金属离子和有机酸作用而使蛋白质沉淀？机酸作用而使蛋白质沉淀？2、举例说明蛋白质变性和沉淀之间的关系。从原理上举例说明蛋白质变性和沉淀之间的关系。从原理上说明一个蛋白质沉淀的实用例子。说明一个蛋白质沉淀的实用例子。思考题思考题精品课件资料分享 SL出品