《GPC基础知识》PPT课件.ppt

凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱SEC定义SEC全称全称Size Exclusion Chromatography(体积排体积排阻色谱，或者尺寸排阻色谱阻色谱，或者尺寸排阻色谱）SEC定义定义：是利用多孔凝胶固定相的独特特性，是利用多孔凝胶固定相的独特特性，而产生的一种主要而产生的一种主要依据分子尺寸大小的差异依据分子尺寸大小的差异来分来分离的液相色谱方法。离的液相色谱方法。凝胶渗透色谱(GPC:Gel permeation chromatography)主要用于聚合物领域主要用于聚合物领域以有机溶剂为流动相以有机溶剂为流动相(氯仿，氯仿，THF，DMF)常用固定相填料：苯乙烯二乙烯基苯常用固定相填料：苯乙烯二乙烯基苯共聚物共聚物 高聚物的性能特别是机械性能、加工性能及高分子在溶液中的特性等都与高聚物分子量有关。如冲击强度、模量、拉伸强度、如冲击强度、模量、拉伸强度、耐热、耐腐蚀性都与高聚物的分子量和分子耐热、耐腐蚀性都与高聚物的分子量和分子量分布有关量分布有关(分子量低易碎，分子量高难加工分子量低易碎，分子量高难加工)。例如，一般的聚苯乙烯制品平均分子量为十几万，如果分子量低到几千极易粉碎，几乎没有应用价值。当分子量达到20万以上时，其机械性能较好，但分子量达到百万以上时，又难以加工，也失去实用价值。高分子材料的加工性能，不仅和高聚高分子材料的加工性能，不仅和高聚物的平均分子量有关，而且也与分子量分物的平均分子量有关，而且也与分子量分布有关。布有关。例如，在涤纶片基生产过程中，（若分子量分布过宽，即含有较多的高分子量和低分子量部分时，其成膜性差，抗应力开裂能力也会降低）。测定高聚物的分子量分布也是研究高分子聚合物或降解动力学的重要途径。高聚物分子量的多分散性是高聚物最高聚物分子量的多分散性是高聚物最基本特征之一，平均分子量及其分布宽度基本特征之一，平均分子量及其分布宽度不仅可以用来表征聚合物的链结构，而且不仅可以用来表征聚合物的链结构，而且也是决定高分子材料性能的基本参数之一，也是决定高分子材料性能的基本参数之一，因此研究高聚物就必须掌握分子量分布的因此研究高聚物就必须掌握分子量分布的测定方法。测定方法。分子量测定方法要得到试样的相对分子质量分布，实验上需要测定的是试样中各种不同相对分子质量的相对含量经典测量方法可分为两类：一类是直接法，需要把试样先分离为不同相对分子质量的级分，然后测定各级分的相对分子质量和相对含量另一类是间接法，例如超离心沉降速读法，是在离心力场下测定高分子溶液的沉降系数分布，然后从沉降系数与相对分子质量的关系得到相对分子质量分布。直接法测量时间很长，测定一个试样的相对分子质量需要一个月时间，而间接法受到实验设备的限制没有推广 固定相是固定相是多孔填料多孔填料，小分子样品可以进入孔径内，小分子样品可以进入孔径内部部样品与固定相之间样品与固定相之间无作用力无作用力迁移时间迁移时间不同不同孔穴孔穴填充物填充物颗颗粒粒 大大 中中小小样样品品GPC分离原理分离原理简单吧！体积排除分离机理GPC是如何工作的分子量校正曲线分子量校正曲线（Log M-V曲线曲线）由凝胶色谱图计算样品的分子量分布的关键是把凝胶色谱曲线中的淋洗体积由凝胶色谱图计算样品的分子量分布的关键是把凝胶色谱曲线中的淋洗体积V V转转化成分子量化成分子量M M，这种分子量的对数值与淋洗体积之间的关系曲线（，这种分子量的对数值与淋洗体积之间的关系曲线（Log M-VLog M-V）称称之为分子量校正曲线之为分子量校正曲线排阻极限排阻极限渗透极限渗透极限GPC柱柱Log (MW)MW与V之间的关系GPC理想理想校正校正曲线曲线 排阻极限排阻极限 排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。分子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。随固定相不同，排阻极限范围约在 400至60106之间。渗透极限渗透极限 能够完全进入凝胶颗粒孔穴内部的最大分子的分子量能够完全进入凝胶颗粒孔穴内部的最大分子的分子量。在选择固定相时，应使欲分离样品粒子的相对分子质量落在固定相的渗透极限和排阻极限之间。GPC两个术语两个术语 数均分子量数均分子量 重均分子量重均分子量 Z均分子量均分子量Mw=S S Mi HiS S Hi Mn=S S HiS S(Hi/Mi)Mz=Mi2 HiS S Mi Hi Hi：峰高峰高Mi：分子量：分子量数均分子量(Mn)重均分子量(Mw)Z 均分子量(Mz)分布宽度指数D(分散度)=Mw/Mn对于多分散试样 Mn Mw Mz平平 均均 分分 子子 量量 含含 义义高聚物多分散性表征高聚物多分散性表征样品间分子量分布宽度的比较，最直接的方法是将实验所得到的分子量分布曲线作对比。分子量分布曲线有两种形式：用重量分数W对分子量作图的曲线叫做微分分布曲线；用累积重量分布对分子量作图的曲线叫做积分分布曲线。还有一种更一般化且最常用的方法就是重均数均比，即：Mw/Mn。测定聚合物分子量的方法测定聚合物分子量的方法直接方法直接方法渗透压方法(for Mn)光散射方法(for Mw)粘度方法(for Mv)超速离心方法(for Mz)间接方法间接方法GPC(for Mn,Mw and Mz)用标准品进样得到分子量校正曲线，间接算出聚合物样品的相对分子量。如和标准品结构不同，还需进行相应的计算才能得到聚合物样品自身的分子质量相对分子量分布(多分散性指数)对聚合物的性质有重要影响。在相对分子质量分布（多分散性指数）成为人们关注的热点后，经典方法却不能同时测定聚合物的相对分子质量分布。凝胶渗透色谱(GPC)的应用改善了测试条件，并提供了可以同时测定聚合物的相对分子质量及其分布的方法，使其成为测定高分子相对分子质量及其分布最常用、快速和有效的技术。为什么要用为什么要用GPC法法GPC系统配置系统配置泵泵进样进样器器色色谱谱柱柱柱温箱柱温箱检测检测器器THF,氯氯仿仿,DMF 示差示差检测检测器器需要GPC软件才可计算Mw多检测器集成的 GPC 系统紫外检测器（浓度型）粘度检测器（分子量型）多角激光光散射检测器（分子量型）红外接口（特征基团型为测量短链支化）GPC色谱柱类型色谱柱类型普通凝胶柱按照不同的排阻极限分成很多种型号按照不同的排阻极限分成很多种型号(如如GPC-80X)每种排阻极限的柱子使用同一种凝胶颗粒每种排阻极限的柱子使用同一种凝胶颗粒在一段范围内校正曲线成线性在一段范围内校正曲线成线性混合凝胶柱一种型号一种型号(如如GPC-80M)使用混合凝胶颗粒使用混合凝胶颗粒在较宽范围内校正曲线都成线性，可消除不同柱子串在较宽范围内校正曲线都成线性，可消除不同柱子串联时可能产生非线性校正曲线导致结果偏差的问题联时可能产生非线性校正曲线导致结果偏差的问题GPC色谱柱选择色谱柱选择按照样品所溶解的溶剂来选择柱子所属系按照样品所溶解的溶剂来选择柱子所属系列列THF、氯仿、氯仿、DMF必须选择合适的溶剂来溶解聚合物必须选择合适的溶剂来溶解聚合物按照样品分子量范围来选择柱子型号按照样品分子量范围来选择柱子型号样品分子量应该处在排阻极限和渗透极限范围内，并且最好是处样品分子量应该处在排阻极限和渗透极限范围内，并且最好是处在校正曲线线性范围内在校正曲线线性范围内聚苯乙烯(PS，溶于各种有机溶剂)聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)聚环氧乙烷(PEO，也叫聚氧化乙烯，溶于水)聚乙二醇(PEG，溶于水)(PEO与与PEG的碳链骨架相同，但是的碳链骨架相同，但是其合成原料和封端其合成原料和封端不同，由于原料的性质，使其产物的分子量和结构都不同，由于原料的性质，使其产物的分子量和结构都有一定的区别。有一定的区别。PEO常是指一端为甲基封端，一端为常是指一端为甲基封端，一端为羟基封端的聚环氧乙烷，而羟基封端的聚环氧乙烷，而PEG一般是两端都是羟基一般是两端都是羟基封端的聚乙二醇。封端的聚乙二醇。)标标样样校正曲线校正曲线逐一注入聚合物标样以确定分子量与保留时间的关系IDTimeMW114.797853000215.559380000316.239186000416.888100000517.47648000618.03223700718.49512200819.0055800常用线性拟合或者三次方拟合GPC校正方法校正方法窄分布标样校正法窄分布标样校正法选用与被测样品同类型的单分散性(d1.1)标样，先用其他方法精确测定其平均相对分子质量，然后与被测样品在同样的条件下进行GPC分析。普适校正法普适校正法此法的优点是只要用一种高聚物（一般用窄分布聚苯乙烯）作标准曲线就可以测定其他类型的聚合物，但先决条件是2种高聚物的K和值必须己知。渐进试差法渐进试差法(宽分布标样校正法宽分布标样校正法)这种方法不需要窄分布样品，其标样可为13个不同相对分子质量的宽分布标样（平均相对分子质量精确测量，Mw和Mn为已知），采用数学处理方法得到渐进试差法的校正曲线。GPC分析大致步骤分析大致步骤根据样品的特点选择合适的GPC柱子和标样，并且确定采用的GPC校正方法;配制标样和样品，用进样器进样得到色谱图;用数据采集器和GPC软件生成校正曲线并计算样品平均分子量，制作报告.GPC分析注意事项分析注意事项如何配制标样和样品系统平衡柱子冲洗及保存校正曲线有效时间亲水性聚合物分析GPC标样配制标样配制由于凝胶色谱中浓度检测通常使用示差折光检测由于凝胶色谱中浓度检测通常使用示差折光检测器，其灵敏度不太高，所以试样的浓度不能配置器，其灵敏度不太高，所以试样的浓度不能配置得太稀。但另一方面色谱柱的负荷量是有限的，得太稀。但另一方面色谱柱的负荷量是有限的，浓度太大易发生浓度太大易发生“超载超载”现象。现象。一般情况下，进样浓度按分子质量大小的不同在一般情况下，进样浓度按分子质量大小的不同在0.050.5%（质量分数）（质量分数）范围内配置。分子质量越范围内配置。分子质量越大，溶液浓度越低。大，溶液浓度越低。标样配制应该严格按照标样说明书进行。通常室标样配制应该严格按照标样说明书进行。通常室温静置温静置12小时以上，然后轻轻混匀。绝对不能超小时以上，然后轻轻混匀。绝对不能超声或者剧烈振荡来加速溶解。声或者剧烈振荡来加速溶解。溶液进样前应先经过溶液进样前应先经过过滤过滤，以防止固体颗粒进入，以防止固体颗粒进入色谱柱内，引起柱内堵塞，损坏色谱柱色谱柱内，引起柱内堵塞，损坏色谱柱。进样浓度范围及体积进样浓度范围及体积分子量范围 样品浓度低于低于5,000 1.0%5,00025,000 0.5%25,000200,000 0.25%200,0002,000,000 0.1%高于高于2,000,000 0.05%进样体积50-100uL之间之间(浓度在浓度在0.05%-0.5%之间之间)标准品标准品及及样品样品配制方法配制方法分子量校准曲线所用的标准品为PS，有8种不同分子量的标品。将它们按下表分为4组，每组含2种标品，各称约4mg左右，然后用20ml流动相溶解，配成4个标样。PS Standard分子量分子量称量值称量值(mg)STD_15600004.2206504.1STD_21560004.0116004.0STD_3660004.270004.1STD_4285004.029504.2固态固态(半结晶半结晶)液态液态(稀溶液稀溶液)样品制备的影响溶剂必须聚合物链打开成最放松的状态允许充分的时间让链展开有些聚合物需要大于3小时分子量及结晶度愈大，所需真正溶解的时间就俞多某些结晶的聚合物需要加热样品制备的影响除非该样品可能会有剪切效应发生，聚合物溶液必须过滤为了增加样品的溶解，可轻微扰动（不要剧烈摇动或用超声）窄分布标样不必过滤，高分子量标样也不要剧烈摇动可使用在线过滤器，但是不推荐使用保护柱 样品制备的影响标样图谱四种颜色分别表示四个标样的图谱分子量校准曲线样品分析结果样品分析结果MnMwMzMz1Mw/MnMz/Mw43679731781013771251211.675341.38536结果评价示例PS1和PS2为同一操作人员测定同一样品的两次测定结果PS3为另一实验室对同一样品测得的结果例测定木质素的分子量凝胶色谱法广泛地应用于木素样品相对分子质量及其分布的测定，然而由于木素结构的复杂性和特殊性，在溶剂中表现出不同的流体力学性质。因此，并没有一个普遍适用的测定木素相对分子量及其分布的色谱条件。对于不同的样品，需要用不同的凝胶柱、流动相和标样相配合，才能收到良好的效果 测定木质素的分子量另一方面，除了木素磺酸盐易溶于水外，各种木素在四氢呋喃（THF）中溶解度都很小。若不能充分溶解，会影响结果的准确性。另外，木素的酚羟基可以与THF形成氢键，从而使其流体力学体积增大，使测定结果偏高，因此木素样品需经衍生化处理才能测定，一般木素、硫酸盐木素、碱木素、有机溶解木素都用乙酰化或甲基化处理 测定木质素的分子量乙酰化方法：将木素样品溶解与已经纯化的吡啶-醋酐混合液（体积比11）中，通N2保护，在室温下置于暗处反应24h以上。反应结束后，过量的酸酐可以通过加入甲醇-冰水分解。混合蒸干后，加甲苯，使乙酰混合物悬浮于甲苯中，再蒸去甲苯。残留的乙酰化试剂随共沸物蒸去。这种方法有不能使全部羟基乙酰化以及可能造成木素级分丢失的缺点，有人提出在常规乙酰化之后，用醋酐、吡啶和甲苯进行共沸蒸馏改进 甲基化方法：将木素溶解或悬浮于二氧六环-甲醇（体积比91）中，每2mL溶剂加入一滴，在N2保护下加入重氮甲烷，室温下反应20min。继续加入重氮甲烷进行甲基化反应。此过程反复进行三次，以保证反应完全。反应结束后，通N2排除未反应的甲基化试剂。反产物用硫酸镁干燥，蒸去溶剂，将衍生后的木素溶于THF 测定木质素的分子量甲基化方法：将木素溶解或悬浮于二氧六环-甲醇（体积比91）中，每2mL溶剂加入一滴，在N2保护下加入重氮甲烷，室温下反应20min。继续加入重氮甲烷进行甲基化反应。此过程反复进行三次，以保证反应完全。反应结束后，通N2排除未反应的甲基化试剂。反产物用硫酸镁干燥，蒸去溶剂，将衍生后的木素溶于THF 测定木质素的分子量油相：THF流动相，聚苯乙烯参比水相：NaNO3 水溶液或NaNO3 的NaOH溶液作为流动相，聚乙烯醇做参比测定木质素的分子量测定半纤维素的分子量半纤维素特性：溶于水或氢氧化钠流动相：磷酸缓冲溶液，普鲁兰多糖做参比测定纤维素的分子量纤维素特性：不溶于水或氢氧化钠或普通有机溶剂衍生化：制备成纤维素硝酸酯或纤维素三苯胺基甲酸酯，然后进行凝胶色谱分析 一般采用粘度法测定测定助剂的分子量聚丙烯酰胺和淀粉：粘度法或者GPC测定液化产物的分子量PEG液化产物特性：溶于水和THF直接测量，THF为流动相