基因组DNA变异的检测.ppt

ECUST创新教育人类疾病易感基因鉴定大赛人类疾病易感基因鉴定大赛系列讲座内容：一、生物实验室规范与微量移液器操作（俞建瑛 副教授）二、基因组DNA的提取和酶切 （李素霞 副教授）三、PCR原理与技术（吴海珍 副教授）四、基因组DNA变异的检测（欧阳立明 副教授）ECUST创新教育基地人类疾病易感基因鉴定大赛人类疾病易感基因鉴定大赛系列讲座之四系列讲座之四基因组基因组DNA变异的检测变异的检测Teacher:欧阳立明 博士生物工程学院应用生物学系2008.7 奉贤ECUST创新教育Contentsp53基因与肿瘤基因与肿瘤个体基因组差异个体基因组差异PCR-RFLP检测技术检测技术本实验整体流程本实验整体流程 4123ECUST创新教育生命的核心奥秘生命的核心奥秘生命的奥秘？生命的奥秘？多样性多样性发育的时空特异性发育的时空特异性对环境的反应对环境的反应遗传与变异遗传与变异都可以从基因组中找到答案！都可以从基因组中找到答案！ECUST创新教育什么是基因组？什么是基因组？基因组基因组（Genome）生物体全部的遗传生物体全部的遗传物质；物质；原核生物的基因组原核生物的基因组真核生物的基因组：细胞核；细胞器真核生物的基因组：细胞核；细胞器 生物体生物体对基因组信息复制、传递、解对基因组信息复制、传递、解码的复杂系统。码的复杂系统。ECUST创新教育人类基因组概况人类基因组概况The Human Genome Project(HGP)是代是代表性测序：表性测序：24条染色体（条染色体（22条常染色体条常染色体+X+Y）；）；3109碱基碱基只有约只有约3%DNA编码蛋白质编码蛋白质约约34万个基因万个基因ECUST创新教育人体基因组核型图人体基因组核型图ECUST创新教育每个人的基因组一样吗？每个人的基因组一样吗？随着测序技术的飞速发展，随着测序技术的飞速发展，2007年年基因组基因组测序测序开始进入了开始进入了个体化个体化时代。时代。WastonVenter(Diploid genome sequence)炎黄炎黄1号号个体之间基因组的差异约在个体之间基因组的差异约在0.11%！2007年年Science评出的十大科学进展评出的十大科学进展之首！之首！LevyS,SuttonG,NgPC,FeukL,HalpernAL,etal.(2007)TheDiploidGenomeSequenceofanIndividualHuman.PLoSBiology.5(10):2113-2144ECUST创新教育个体基因组差异中的秘密个体基因组差异中的秘密为什么？为什么每个人相貌、性格、智为什么每个人相貌、性格、智力力都不一样？都不一样？为什么有的人容易得病，有的为什么有的人容易得病，有的人却对疾病的免疫能力特别高人却对疾病的免疫能力特别高？为什么在药物的使用过程中，为什么在药物的使用过程中，有的人一用就灵，有的人却不有的人一用就灵，有的人却不灵，甚至中毒？灵，甚至中毒？这些现象使人们认识到：必须这些现象使人们认识到：必须从不同从不同个体基因组个体基因组序列的多态序列的多态性上去阐明个体对疾病和药物性上去阐明个体对疾病和药物反应上的多态性反应上的多态性，才才能真正了能真正了解解与与疾病特別是多基因疾病有疾病特別是多基因疾病有关关的的遗传机制遗传机制，同，同时时深入了解深入了解人人类类起源、起源、进进化和化和迁徙过程迁徙过程中中的的DNA序列序列变变化。化。ECUST创新教育基因组差异的主要表现基因组差异的主要表现SNP(Single nucleotide polymorphism)：单核苷酸多：单核苷酸多态性，基因组中数量最多的分子标记态性，基因组中数量最多的分子标记SSLP(Simple sequences length polymorphism)，简，简单序列长度多态性，也称微卫星单序列长度多态性，也称微卫星(Microsatellite)Insertion and deletion(Indel)：碱基的插入和缺失：碱基的插入和缺失ECUST创新教育SNP的特点的特点就好像单词的变体或者中文中的通假字就好像单词的变体或者中文中的通假字在基因组中大量存在，已经报道了超过在基因组中大量存在，已经报道了超过300万个万个SNP，估计整个人类中存在，估计整个人类中存在1500万个万个SNP一般为二等位性一般为二等位性转换转换(transition,如如AG)高于颠换高于颠换(transversion,如如AT)同一位点极少发生再次复制错误同一位点极少发生再次复制错误30%位于编码区，位于编码区，70%位于非编码区位于非编码区ECUST创新教育DNA的双链互补结构的双链互补结构ECUST创新教育同源染色体、姐妹染色单体、等位位点同源染色体、姐妹染色单体、等位位点一对同源染色体一对同源染色体一一对对姐姐妹妹染染色色单单体体A,a：一对等位位点：一对等位位点ECUST创新教育同源染色体、姐妹染色单体、等位位点同源染色体、姐妹染色单体、等位位点同源染色体：是指形态、结构、遗传组成基本相同源染色体：是指形态、结构、遗传组成基本相同的染色体。对于同一个体来说，同源染色体对同的染色体。对于同一个体来说，同源染色体对在减数第一次分裂前期中彼此联会在减数第一次分裂前期中彼此联会(配对配对)，并且，并且能够形成能够形成四分体四分体，然后分裂到不同的生殖细胞的，然后分裂到不同的生殖细胞的一对染色体，一个来自母方，另一个来自父方。一对染色体，一个来自母方，另一个来自父方。姐妹染色单体：姐妹染色单体是由一个着丝点连姐妹染色单体：姐妹染色单体是由一个着丝点连着的并行的两条染色单体，是在细胞分裂的间期着的并行的两条染色单体，是在细胞分裂的间期由同一条染色体经复制后形成的。由同一条染色体经复制后形成的。等位位点：个体或群体同源染色体上相同的位置。等位位点：个体或群体同源染色体上相同的位置。ECUST创新教育四分体四分体每个四分体都有每个四分体都有2条染色体，条染色体，2对姐妹染色对姐妹染色单体，单体，4个个DNA分子。分子。由于四分体时期同源染色体之间经常互相由于四分体时期同源染色体之间经常互相缠绕，再分开时不一定能维持染色体原来缠绕，再分开时不一定能维持染色体原来的形态和组成，有可能发生同源非姐妹染的形态和组成，有可能发生同源非姐妹染色体之间的交叉互换，这是染色单体上，色体之间的交叉互换，这是染色单体上，也是不久之后染色体上基因重组的原因。也是不久之后染色体上基因重组的原因。ECUST创新教育SNP的含义的含义同一个体或不同个体基因组中同一个体或不同个体基因组中等位位点等位位点上上的单核苷酸碱基不同。的单核苷酸碱基不同。对于二倍体生物，等位位点上的对于二倍体生物，等位位点上的SNP有杂有杂合、纯合之分！合、纯合之分！SNP与与DNA突变：突变：都起源于都起源于DNA复制差错。复制差错。SNP具有相对稳定性，一般来说在群体中出具有相对稳定性，一般来说在群体中出现频率大于现频率大于1%；而突变不具有稳定性，在群；而突变不具有稳定性，在群体中存在的频率小于体中存在的频率小于1%。ECUST创新教育编码区的编码区的SNP与疾病或药物反应个体差异关系密切，是制药企与疾病或药物反应个体差异关系密切，是制药企业的金矿业的金矿四种后果：四种后果：同义同义Synonymous：AAA(Lys)AAG(Lys)(silent mutation)无义无义non-sense：TGG(Trp)TGA(Stop)错义错义mis-sense：AGU(Ser)ATU(Ile)。一些单。一些单基因遗传病的病因。基因遗传病的病因。sickle cell anemia,hemoglobin 146 residue(GAG(Glu)GTG(Val)改变基因的表达改变基因的表达ECUST创新教育SNP的演化过程的演化过程ECUST创新教育如何检测如何检测SNP或突变或突变酶法：根据酶对酶法：根据酶对DNA序列的识别特异性序列的识别特异性限制性内切酶限制性内切酶:RFLPDNA 连接酶连接酶DNA聚合酶在合成时的校正功能：聚合酶在合成时的校正功能：TaqMan 构象分离法：电泳检测构象分离法：电泳检测DNA的构象变化的构象变化单链构象多态性（单链构象多态性（SSCP）异源双链电泳迁移率变化异源双链电泳迁移率变化dHPLCDNA杂交法：碱基变化对杂交法：碱基变化对DNA互补配对杂交动力学的影响互补配对杂交动力学的影响DASH,DNA chip,ASO斑点杂交等斑点杂交等直接测序法直接测序法 焦磷酸测序（焦磷酸测序（Pyrosequencing）单碱基延伸标签测序单碱基延伸标签测序：(Single Base Extension,SBE tag)Fluorescent Dye Terminator;Fluorescence polarization;MS;MALDI-TOFECUST创新教育RCR-RFLP检测检测SNP或突变或突变原理：由于碱基的变异可引起酶切位点的原理：由于碱基的变异可引起酶切位点的消失或出现，从而使不同个体同一位置的消失或出现，从而使不同个体同一位置的基因组片段（用基因组片段（用PCR扩增获得）用同一限扩增获得）用同一限制性内切酶酶切时，产生的制性内切酶酶切时，产生的DNA片段长度片段长度有差异，即限制性片段长度多态性有差异，即限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism,RFLP）。）。AnimationECUST创新教育基于杂交的基于杂交的RFLP提取基因组酶切特异性探针DNA杂交注意等位位点上SNP的杂合、纯合在检测结果上的差异！RFLP的特征可遗传给子代并符合孟德尔规律。ECUST创新教育基因组变异的数据库基因组变异的数据库1)NCBI的遗传变异数据库（dbSNP）2)SNP研究联盟（The SNP Consortium,TSC）提供的数据库：3)人类基因组突变数据库（the Human Genome Variation,HGVbase）http:/ECUST创新教育p53基因与肿瘤基因与肿瘤p53 是一个抑癌基因，可诱导异常细胞进是一个抑癌基因，可诱导异常细胞进入凋亡。入凋亡。几乎所有的肿瘤和约几乎所有的肿瘤和约50%的恶性肿瘤中都的恶性肿瘤中都发现了发现了p53基因的突变或缺失。基因的突变或缺失。突变的结果是突变的结果是90%导致翻译出的氨基酸发导致翻译出的氨基酸发生改变，生改变，10%是不能形成是不能形成P53蛋白。蛋白。More details please refer to:ECUST创新教育p53基因的结构基因的结构P53基因位于人17号染色体短臂（17p13），有11个外显子。粉红色区域所示部分不编码结构蛋白，灰色区域为内含子内部的外显子，蓝色为蛋白编码区。ECUST创新教育P53蛋白的结构蛋白的结构转录激转录激活区活区脯氨酸富含区，与脯氨酸富含区，与DNA损伤介导的细胞损伤介导的细胞凋亡有关凋亡有关核心结构区核心结构区(DNA结合区结合区)，突变高发区，引起蛋白，突变高发区，引起蛋白质构象变化。质构象变化。核定位信号（核定位信号（NLS），），高度保守高度保守ECUST创新教育p53的突变位点统计的突变位点统计ECUST创新教育突变热点位于突变热点位于DNA结合区结合区ECUST创新教育p53热点突变的类型热点突变的类型ECUST创新教育人类肿瘤人类肿瘤p53基因突变基因突变肿瘤类型突变频率（）突变热点（密码子）肺癌56157，248，273结肠癌50175，245，248，273卵巢癌44273胰腺癌44273皮肤癌44248,278胃癌41不确定头颈部鳞癌37248膀胱癌24280前列腺癌30不确定肝细胞癌45249胶质瘤25175,248乳腺癌22175，248，273 子宫内膜癌 22248甲状腺癌13248，273白血病12175，248 食管癌45不确定ECUST创新教育PCR扩增区域图解扩增区域图解Codon 248cCGG(Arg)cTGG(Trp)cCTG(Leu)cCAG(Gln)MspIECUST创新教育248位密码子的突变类型位密码子的突变类型ECUST创新教育预期电泳结果预期电泳结果正常PCR Genome100bp200bp300bp500bpDNA MarkerFig.1 PCR-RFLP result of p53 gene M1:Marker 3(200,500,800)bp;1:Genome DNA2:PCR result of exon 7 fragment of p53 geneM2:100bp ladder DNA Marker3:Digestion result200bp500bp800bpM1 1 2 M2 3ECUST创新教育大赛实验流程（大赛实验流程（PCR-RFLP）1)个体基因组提取个体基因组提取2)PCR获得获得p53基基因第因第7外显子片段外显子片段3)对对PCR产物用产物用MspI酶切酶切4)3%琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测1),2),3)产物，分析肿瘤易感性产物，分析肿瘤易感性ECUST创新教育实验大赛评分要点实验大赛评分要点每个环节操作得到的产物质量；每个环节操作得到的产物质量；操作细节；操作细节；速度（合作）；速度（合作）；要点要点ECUST创新教育一等奖一等奖一等奖一等奖二等奖二等奖二等奖二等奖三等奖三等奖三等奖三等奖PPT报告报告最后的奖励考核最后的奖励考核ECUST创新教育基地Explore life,explore yourself!丰厚奖品等你拿丰厚奖品等你拿!