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生物化学实验CQMU Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望p学习氨基酸纸层析的基本原理学习氨基酸纸层析的基本原理p掌握氨基酸纸层析的操作技术掌握氨基酸纸层析的操作技术实验目的实验目的p 层析技术层析技术层析法又称色谱法，是一种根据层析法又称色谱法，是一种根据物质的物理或化学性质不同（如物质的物理或化学性质不同（如吸附力、溶解度等）而建立的物吸附力、溶解度等）而建立的物质分离、分析方法，是近代生化质分离、分析方法，是近代生化最常用技术之一。最常用技术之一。实验原理实验原理基本原理：在层析系统（基本原理：在层析系统（固定相流动相固定相流动相）中，）中，由于混合物各组份理化性质不同，与两相的相互由于混合物各组份理化性质不同，与两相的相互作用（吸附、溶解等）能力不同，随着流动相不作用（吸附、溶解等）能力不同，随着流动相不断向前移动，不同组分最终得以分开。断向前移动，不同组分最终得以分开。p纸层析纸层析属于分配层析，利用混合物在二种或二种以上属于分配层析，利用混合物在二种或二种以上的不同溶剂中总的分配系数的不同而使物质分的不同溶剂中总的分配系数的不同而使物质分离的方法。离的方法。以滤纸为支持介质，水被吸附在滤纸纤维上形以滤纸为支持介质，水被吸附在滤纸纤维上形成固定相，有机溶剂如酚等为流动相。成固定相，有机溶剂如酚等为流动相。把预分离物质加在纸的一端，使流动溶剂经此把预分离物质加在纸的一端，使流动溶剂经此向另一端移动，随着流动相的移动，待分离物向另一端移动，随着流动相的移动，待分离物质进行连续、动态的不断分配。在固定相分配质进行连续、动态的不断分配。在固定相分配趋势大的组份，随流动相移动的速度慢；反之，趋势大的组份，随流动相移动的速度慢；反之，在流动相分配趋势较大的成分，移动速度快，在流动相分配趋势较大的成分，移动速度快，最终不同的组份彼此分离。最终不同的组份彼此分离。p ALT催化的转氨基反应催化的转氨基反应纸层析观察转氨基作用的技术基础：纸层析观察转氨基作用的技术基础：丙氨酸丙氨酸和和谷氨酸谷氨酸可以通过纸层析得以分离可以通过纸层析得以分离实验步骤实验步骤p 肝匀浆制备：肝匀浆制备：p 转氨基反应：取试管二支，分别标明转氨基反应：取试管二支，分别标明测定管测定管与与对照管对照管，各加入肝匀浆，各加入肝匀浆10滴，测定管加入滴，测定管加入37水浴保温水浴保温10分钟，分钟，对照管放入沸水浴中煮对照管放入沸水浴中煮10分分钟钟，待对照管冷却后，于两试管中分别加入，待对照管冷却后，于两试管中分别加入0.1 mol/L 丙氨酸丙氨酸10滴，滴，0.1 mol/L-酮戊二酸酮戊二酸10滴，滴，pH 7.4 0.01 mol/l 磷酸缓冲液磷酸缓冲液1.5 ml，摇匀，放，摇匀，放进进37水浴保温水浴保温30分钟，保温完毕，立即将测分钟，保温完毕，立即将测定管放入沸水浴中煮沸定管放入沸水浴中煮沸10分钟以终止反应，取分钟以终止反应，取出冷却后，过滤。取滤液备用。出冷却后，过滤。取滤液备用。p层析：准备滤纸层析：准备滤纸点样点样层析层析终止。终止。1.测定管上清液测定管上清液 2.0.1 mol/L丙氨酸丙氨酸 3.对照管上清液对照管上清液 4.0.1 mol/L谷氨酸谷氨酸 p 显色显色：将上述滤纸平放在培养皿上，用：将上述滤纸平放在培养皿上，用喷雾器喷上喷雾器喷上0.5%茚三酮之丙酮溶液，使茚三酮之丙酮溶液，使滤纸全部湿润再用吹风机或滤纸全部湿润再用吹风机或60烘箱干燥烘箱干燥之，此时可见紫色斑出现。之，此时可见紫色斑出现。p 分析：分析：比较色斑的位置及色泽深浅，计比较色斑的位置及色泽深浅，计算算Rf值，分析是否发生了转氨基反应。值，分析是否发生了转氨基反应。注意事项注意事项p 层析液中含有腐蚀性酚，取用时注层析液中含有腐蚀性酚，取用时注意安全，防止溅到皮肤及眼睛；意安全，防止溅到皮肤及眼睛；p 操作中接触滤纸前要洗手擦净，并操作中接触滤纸前要洗手擦净，并尽量避免手与滤纸中间部位接触；尽量避免手与滤纸中间部位接触；p 点样点不宜过大，直径小于点样点不宜过大，直径小于0.5 cm。开始实验！开始实验！