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农业生物学实验教学中心生物化学实验技术 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望农业生物学实验教学中心目 录PCR的反应原理PCR的类型和应用PCR示例农业生物学实验教学中心 多聚酶链式反应多聚酶链式反应（PCR：Polymerase Chain Reaction)Kary B.MullisKary B.Mullis PCR是由美国科学家是由美国科学家穆利斯提出的一种穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟体外简化条件下模拟DNADNA体内复制的体内复制的DNADNA快速扩增的方法，此技术获得快速扩增的方法，此技术获得19931993年诺贝年诺贝尔化学奖。尔化学奖。农业生物学实验教学中心体内体内DNADNA的复制体系的复制体系DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶（I II IIII II IIII II IIII II III）拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶解旋酶类解旋酶类解旋酶类解旋酶类SSBSSBSSBSSB 引物引物引物引物dNTP MgdNTP MgdNTP MgdNTP Mg2+2+2+2+5 5 33农业生物学实验教学中心Mullis的的PCR构思构思引物引物引物引物DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定DNADNA片段片段TaqTaq DNADNA聚合酶（聚合酶（thermus aquaticus)thermus aquaticus)酶酶酶酶活活活活性性性性(%)温度温度温度温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶Saiki（1988）将耐热）将耐热DNA聚合酶引入聚合酶引入PCR，使利用热变性解链，使利用热变性解链DNA模板可行。模板可行。农业生物学实验教学中心PCR反应循环反应循环7272949494945555PCRPCR循环循环循环循环变性变性变性变性退火退火退火退火延伸延伸延伸延伸农业生物学实验教学中心 PCRPCRPCRPCR的指数扩增（的指数扩增（的指数扩增（的指数扩增（2 2 2 2n n n n）引物引物引物引物延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸5 5 5 53 33 3变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火农业生物学实验教学中心TaqTaqP1P1P2P2PCR反应体系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：模板：DNA引物：引物：P1 P2DNA聚合酶：聚合酶：Taq原料：原料：dNTP反应缓冲液反应缓冲液辅助因子：辅助因子：Mg2+农业生物学实验教学中心1 1）PCRPCR反应成分反应成分（1 1 1 1）模板）模板）模板）模板 单、双链单、双链DNADNA均可。均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNADNA聚合酶抑制剂、聚合酶抑制剂、DNADNA结合蛋白类。结合蛋白类。DNA DNA模板一般模板一般100ng/100100ng/100 L L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCR反应条件农业生物学实验教学中心（2 2 2 2）引物浓度）引物浓度）引物浓度）引物浓度 0.1-0.5 0.1-0.5 mol/Lmol/L 浓度过高易导致模板与引物错配浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。反应特异性下降。（3 3 3 3）Taq Taq Taq Taq DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 0.5-2.5 U/50 0.5-2.5 U/50 l l 酶量增加使反应特异性下降酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。酶量过少影响反应产量。农业生物学实验教学中心（4 4 4 4）dNTPdNTPdNTPdNTP dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度 四种四种dNTPdNTP浓度应相等浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降浓度过低则降低反应产量低反应产量 dNTP dNTP可与可与Mg2+Mg2+结合结合,使游离的使游离的Mg2+Mg2+浓度下降浓度下降,影响影响DNADNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。农业生物学实验教学中心（5 5 5 5）Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+是是DNADNA聚合酶的激活剂。适宜浓度为聚合酶的激活剂。适宜浓度为0.5-0.5-2.5mmol/L2.5mmol/L反应体系。反应体系。Mg2+Mg2+浓度过低会使浓度过低会使TaqTaq酶活性丧失、酶活性丧失、PCRPCR产量下降；产量下降；Mg2+Mg2+过高影响反应特异性。过高影响反应特异性。Mg2+Mg2+可与负离子结合可与负离子结合,所以反应体系中所以反应体系中dNTPdNTP、EDTAEDTA等的浓度影响反应中游离的等的浓度影响反应中游离的Mg2+Mg2+浓度。浓度。农业生物学实验教学中心2 2 2 2）循环参数）循环参数）循环参数）循环参数(1)(1)变性变性变性变性 (2)使双链使双链DNADNA解链为单链解链为单链 94 94，20-30 20-30秒秒(2)(2)(2)(2)退火退火退火退火 温度由引物长度和温度由引物长度和GCGC含量决定。含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降降低温度可增加反应的灵敏性。低温度可增加反应的灵敏性。农业生物学实验教学中心（3 3 3 3）延伸）延伸）延伸）延伸 70-75,70-75,一般为一般为7272 延伸时间由扩增片段长度决定延伸时间由扩增片段长度决定（4 4 4 4）循环次数）循环次数）循环次数）循环次数 主要取决于模版主要取决于模版DNADNA的浓度的浓度 一般为一般为25-3525-35次次 次数过多：扩增效率降低次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加错误掺入率增加农业生物学实验教学中心PCR技术的特点1 1 1 1）高度的灵敏性）高度的灵敏性）高度的灵敏性）高度的灵敏性30303030轮循环轮循环轮循环轮循环扩增量达扩增量达230230个拷贝（个拷贝（109109拷贝）拷贝）PCRPCR产物每轮循环增加一倍产物每轮循环增加一倍农业生物学实验教学中心2 2 2 2）特异性）特异性）特异性）特异性引物引物引物引物引物引物引物引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCRPCR反反 应结果的关键。应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和 特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。农业生物学实验教学中心引物设计：引物设计：（1)1)序列应位于高度保守区序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源与非扩增区无同源 序列。序列。（2 2）引物长度以）引物长度以15-40 bp15-40 bp为宜。为宜。（3 3）碱基尽可能随机分布碱基尽可能随机分布,G+C,G+C占占40-60%40-60%。（4 4）引物内部避免形成二级结构。）引物内部避免形成二级结构。（5 5）两引物间避免有互补序列。）两引物间避免有互补序列。（6 6）引物）引物33端为关键碱基；端为关键碱基；5 5端端无严格限制。无严格限制。农业生物学实验教学中心3 3 3 3）操作简便易行）操作简便易行）操作简便易行）操作简便易行 利用利用PCRPCR扩增扩增,只需要数小时只需要数小时,就可以扩增出就可以扩增出 可用可用电泳法检出的电泳法检出的DNADNA，可用于检测基因组中仅含数个拷，可用于检测基因组中仅含数个拷贝的模板序列。贝的模板序列。农业生物学实验教学中心1 1 1 1）不对称）不对称）不对称）不对称PCRPCRPCRPCR 目的：扩增产生特异长度的单链目的：扩增产生特异长度的单链DNADNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物引物和非限制性引物,其最佳比例一般是其最佳比例一般是0.010.5M,0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针；用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针；基因组基因组DNADNA结构功能的研究结构功能的研究 PCRPCR的类型 高浓度引物高浓度引物低浓度引物低浓度引物农业生物学实验教学中心2)2)2)2)反向反向反向反向PCR(reverse PCR)PCR(reverse PCR)PCR(reverse PCR)PCR(reverse PCR)用反向的互补引物来扩增两引物以外的用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNADNA片段，片段，对某个已知对某个已知DNADNA片段两侧的未知序列进行扩增。片段两侧的未知序列进行扩增。未知序列未知序列未知序列未知序列已知序列已知序列农业生物学实验教学中心已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶农业生物学实验教学中心3 3 3 3）多重）多重）多重）多重PCRPCRPCRPCR（复合（复合（复合（复合PCRPCRPCRPCR）用于检测特定基因序列的存在或缺失。用于检测特定基因序列的存在或缺失。农业生物学实验教学中心电电电电泳泳泳泳引物引物12341234农业生物学实验教学中心4 4 4 4）LP-PCRLP-PCRLP-PCRLP-PCR（Labelled primers)Labelled primers)Labelled primers)Labelled primers)利用同位素、荧光素等对引物进行标记利用同位素、荧光素等对引物进行标记,用以直观地检测目的基因。用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分可同时检测多种基因成分农业生物学实验教学中心标记引物标记引物标记引物标记引物观察观察PCRPCR产物产物农业生物学实验教学中心5 5 5 5）锚定）锚定）锚定）锚定PCRPCRPCRPCR（anchored PCR,A-PCRanchored PCR,A-PCRanchored PCR,A-PCRanchored PCR,A-PCR）锚定锚定PCRPCR首先合成第一链首先合成第一链cDNA,cDNA,然后再添加一同聚然后再添加一同聚物尾（物尾（polydG),polydG),与同聚物尾配对的与同聚物尾配对的33锚定引物（带锚定引物（带有限制性内切位点有限制性内切位点polydC)polydC)一起作一起作PCRPCR扩增扩增农业生物学实验教学中心cDNAcDNA末端核酸转移酶末端核酸转移酶3GGGG3GGGG55CCCC CCCC 锚定引物锚定引物锚定引物锚定引物3GGGG3GGGG55CCCCCCCC3GGGG3GGGGCCCCCCCC农业生物学实验教学中心6 6 6 6）PCRPCRPCRPCR固相分析法固相分析法固相分析法固相分析法模模板板生物素生物素化引物化引物PCRPCR扩增扩增探探针针亲和固亲和固相介质相介质检测探检测探针信号针信号可用于基因芯片的制作可用于基因芯片的制作农业生物学实验教学中心7 7 7 7）原位）原位）原位）原位 原位聚合酶链式反应（原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsIn Still PCR,IsPCRPCR）是）是由由HaaseHaase等于等于19901990年首创。它是利用完整的细胞作为一年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏在不破坏细胞的前提下细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中进行扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少的靶序列。含量较少的靶序列。农业生物学实验教学中心操作步骤操作步骤1.1.细细胞胞或或组组织织固固定定：细细胞胞经经固固定定和和乙乙醇醇通通透透化化处处理理后后便便适于一般适于一般PCRPCR试剂（包括引物和试剂（包括引物和TaqTaq酶）进入酶）进入2.PCR2.PCR扩增细胞内目的片段扩增细胞内目的片段3.3.原位杂交检测扩增产物原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达农业生物学实验教学中心8 8 8 8）逆转录酶逆转录酶聚合酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCRPCR扩增扩增农业生物学实验教学中心9)9)9)9)荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量 PCRPCRPCRPCR（real-time PCR)real-time PCR)real-time PCR)real-time PCR)通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对对PCRPCR产物进行标产物进行标 记跟踪记跟踪,实时在线监控反应过程实时在线监控反应过程,结结合相应的软件可以对结果进行分析合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的计算待测样品的初始模板量。初始模板量。内掺式染料内掺式染料SYBR GreenSYBR Green I序列特异性探针序列特异性探针Taqman Taqman Molecular BeaconsMolecular Beacons Dual Probes(Dual Probes(FRET)FRET)引物特异性探针引物特异性探针 Amplifluor(Intergen)Amplifluor(Intergen)农业生物学实验教学中心5353SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-Green ISYBR-Green I 农业生物学实验教学中心 实时荧光定量实时荧光定量PCR仪仪梯度梯度PCR仪仪普通普通PCR仪仪农业生物学实验教学中心PCR示例示例一、实验目的一、实验目的学习学习PCRPCR分析的原理与技术。分析的原理与技术。农业生物学实验教学中心1 1、材料：含、材料：含1Kb1Kb插入片段的克隆载体插入片段的克隆载体Pmd18-TPmd18-T 质粒质粒DNADNA2 2、仪器：微量移液器及吸头、仪器：微量移液器及吸头、PCRPCR仪及仪及PCRPCR管管 琼脂糖凝胶电泳设备琼脂糖凝胶电泳设备3 3、试剂：、试剂：1010X XPCRPCR 反应缓冲液反应缓冲液 25mmol/L MgCl 25mmol/L MgCl2 2 10mmol/L dNTP10mmol/L dNTP 10 10mol/L mol/L 引物引物1 1和引物和引物2 2二、实验材料、仪器和二、实验材料、仪器和试剂试剂农业生物学实验教学中心1.1.按照如下体积向按照如下体积向PCRPCR管中按顺序加入各试剂管中按顺序加入各试剂 并混匀：并混匀：10 X PCR反应缓冲液 2.5 L 25mmol/L MgCl2 2.0L 10mmol/L dNTP 1.0 L 10mol/L 引物1 1.0 L 10mol/L引物2 1.0L 质粒DNA 1.0 L Taq 0.1 L(5U)水补充至 25.0 L三、操作步骤三、操作步骤农业生物学实验教学中心2.2.按照如下体积向按照如下体积向PCRPCR管中按顺序加入各试剂管中按顺序加入各试剂 并混匀：并混匀：10 X PCR反应缓冲液 2.5 L 25mmol/L MgCl2 2.0L 10mmol/L dNTP 1.0 L 10mol/L 引物1 1.0 L 10mol/L引物2 1.0L 质粒DNA 1.0 L Taq 0.1 L(5U)水补充至 25.0 L三、操作步骤三、操作步骤农业生物学实验教学中心农业生物学实验教学中心3.3.反应完成后反应完成后,将反应液与凝胶电泳缓冲液按将反应液与凝胶电泳缓冲液按比例混匀比例混匀,上样电泳。上样电泳。三、操作步骤三、操作步骤琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳农业生物学实验教学中心