工业微生物育种诱变剂.ppt

第五章 工业微生物育种诱变剂5.1 5.1 物理诱变剂物理诱变剂5.2 5.2 化学诱变剂化学诱变剂5.3 5.3 生物诱变剂生物诱变剂通过人为的方法，利用物理、化学因素处理微生通过人为的方法，利用物理、化学因素处理微生物以引起突变，这一过程称为物以引起突变，这一过程称为诱发突变诱发突变。诱发突变诱发突变(induced mutation)(induced mutation)的发现的发现 19271927年，年，MullerMuller 用用X X射线诱发果蝇遗传性状变异。射线诱发果蝇遗传性状变异。在第二次世界大战中，又发现化学物质氮芥也能导致细菌性在第二次世界大战中，又发现化学物质氮芥也能导致细菌性状变异，其效应与状变异，其效应与X X射线相类似。射线相类似。陆续发现许多物理因子与化学物质都具有诱发基因突变的作陆续发现许多物理因子与化学物质都具有诱发基因突变的作用。用。近年来，随着基因工程技术的不断发展，蛋白质工程中点突近年来，随着基因工程技术的不断发展，蛋白质工程中点突变的重要技术变的重要技术基因诱变在菌种选育中得以应用，基因诱变在菌种选育中得以应用，使生使生物诱变剂受到了重视，取得了可喜的发展。物诱变剂受到了重视，取得了可喜的发展。诱变诱变：诱变剂种类诱变剂种类物理诱变剂物理诱变剂化学诱变剂化学诱变剂生物诱变剂生物诱变剂诱变剂：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率诱变剂：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学物质远远超过自发突变率的物理因子或化学物质诱变剂的概念与种类诱变剂的概念与种类什么是诱变剂？有哪些分类？什么是诱变剂？有哪些分类？第一节第一节 物理诱变剂物理诱变剂1.1.物理诱变剂种类物理诱变剂种类2.2.物理诱变剂的生物学效应物理诱变剂的生物学效应3.3.辐射引起生物效应的因素辐射引起生物效应的因素4.4.非电离辐射非电离辐射紫外线紫外线5.5.电离辐射电离辐射6.6.近年来发展的新型诱变剂近年来发展的新型诱变剂 物理诱变剂的种类物理诱变剂的种类物理辐射物理辐射电离辐射电离辐射产生正离子产生正离子非电离辐射非电离辐射不产生离子不产生离子X X射线射线0.06136nm0.06136nm 射线射线紫外线紫外线136390nm136390nm物理诱变剂包括：紫外线，物理诱变剂包括：紫外线，X X射线，射线，射线，快中子，射线，快中子，射线，射线，射线，微波，超声波，电磁波，激光射线和宇宙射线等。射线，微波，超声波，电磁波，激光射线和宇宙射线等。指的是指的是能量能量以电磁波或粒子（如阿尔法粒子、贝塔粒子等）以电磁波或粒子（如阿尔法粒子、贝塔粒子等）的形式向外扩散。的形式向外扩散。高能电磁波波长短于紫色光的肉眼不可见“光线”辐射辐射1.2 物理诱变剂的生物学效应物理诱变剂的生物学效应1.辐射作用的时相阶段：物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是辐射作用的时相阶段：物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程，通常可分为的连锁反应过程，通常可分为物理、物理化学、化学和生物学物理、物理化学、化学和生物学四个阶段。四个阶段。2.分子结构变化分子结构变化:由辐射引起由辐射引起DNA分子结构变化中最常发生的是分子结构变化中最常发生的是DNA单链或双链断裂：单链或双链断裂：单链断裂：多于双链断裂，易被修复系统修复。单链断裂：多于双链断裂，易被修复系统修复。双链断裂：一部分也可以通过修复系统修复，但双链断裂易使染色体发双链断裂：一部分也可以通过修复系统修复，但双链断裂易使染色体发生畸变或者使微生物死亡。生畸变或者使微生物死亡。1.2 物理诱变剂的生物学效应物理诱变剂的生物学效应3.生物学效应生物学效应与辐射类型的关系与辐射类型的关系电离辐射：主要引起电离辐射：主要引起DNA上的基因突变和染色体的畸变。上的基因突变和染色体的畸变。非电离辐射：主要导致形成嘧啶二聚体。非电离辐射：主要导致形成嘧啶二聚体。与辐射剂量的关系与辐射剂量的关系引起微生物的变异或死亡与辐射剂量成正比引起微生物的变异或死亡与辐射剂量成正比在相同的总辐射剂量的条件下，不论是一次连续照射还在相同的总辐射剂量的条件下，不论是一次连续照射还是分次累加照射，也不论是高剂量短时间照射还是低剂是分次累加照射，也不论是高剂量短时间照射还是低剂量长时间照射，其诱变效应基本上是相等的。量长时间照射，其诱变效应基本上是相等的。1.2 物理诱变剂的生物学效应物理诱变剂的生物学效应4.辐射作用机制辐射作用机制直接物理作用假说直接物理作用假说间接化学作用间接化学作用2011年3月11日爆发的级特大地震影响，日本福岛核电站反应堆发生氢气爆炸 1.3 辐射引起生物效应的因素辐射引起生物效应的因素 辐射引起生物学效应的强弱既决定于微生物内在遗传因素，也受外界环境条件辐射引起生物学效应的强弱既决定于微生物内在遗传因素，也受外界环境条件的影响。的影响。微生物因素微生物因素:1.微生物的微生物的遗传背景遗传背景:不同菌种由于遗传性状各异，对辐射的敏感性亦各不不同菌种由于遗传性状各异，对辐射的敏感性亦各不相同。如：相同。如：A和和T比例高，对紫外线越敏感，对电离辐射则相反。比例高，对紫外线越敏感，对电离辐射则相反。2.微生物的生理状态：微生物细胞壁结构、修复系统的强弱微生物的生理状态：微生物细胞壁结构、修复系统的强弱环境因素环境因素:1.可见光：能激活光复活酶的活性，分解紫外线引起的嘧啶二聚体可见光：能激活光复活酶的活性，分解紫外线引起的嘧啶二聚体2.水分：含水量影响细胞对辐射的水分：含水量影响细胞对辐射的敏感性，如：含水酵母比干酵母敏感敏感性，如：含水酵母比干酵母敏感3.温度：较高的温度能促进氧气与自由基之间的作用温度：较高的温度能促进氧气与自由基之间的作用,使射线与使射线与DNA接触过接触过程所引起的化学反应加速程所引起的化学反应加速4.空气或氧气：有氧比缺氧时的电离辐射效应更好空气或氧气：有氧比缺氧时的电离辐射效应更好1.4 非电离辐射非电离辐射紫外线紫外线136-390nm1.4 非电离辐射非电离辐射紫外线紫外线紫外线可由紫外灯管产生。要求的设备简单、操作方便、价格低廉。紫外线诱变效果显著。诱变频率高，而且不易发生回复突变。因此紫外线是一种使用最早也是沿用最久的应用效果最明显的物理诱变剂。DNA分子能吸收紫外线光谱。其中嘧啶碱基比嘌呤碱基敏感上百倍。紫外线使DNA分子发生如下几种变化：DNA与蛋白质交联；胞嘧啶和尿嘧啶之间的水合作用；DNA链的断裂；形成嘧啶二聚体。这是紫外线引起的主要变化。1.4 非电离辐射非电离辐射紫外线紫外线1.紫外线的诱变机制紫外线的诱变机制和和DNA损伤修复损伤修复 单单链上的二聚体会影响到复链上的二聚体会影响到复制时的碱基正常配对。制时的碱基正常配对。双双链上的二聚体会阻碍双链链上的二聚体会阻碍双链的分开，复制到这一点就无法的分开，复制到这一点就无法继续进行，造成继续进行，造成DNA链的异常。链的异常。紫外线的诱变机制紫外线的诱变机制 形成嘧啶二聚体形成嘧啶二聚体DNA损伤修复损伤修复 光修复光修复,切补修复（暗修复切补修复（暗修复）1.4 非电离辐射非电离辐射紫外线紫外线2.紫外线诱变紫外线诱变(1)紫外线的有效光谱紫外线的有效光谱DNA吸收的紫外线光谱通常为吸收的紫外线光谱通常为260nm，因此能诱发微生物突变的紫，因此能诱发微生物突变的紫外线的有效波长范围是外线的有效波长范围是200300nm，最有效的波长为，最有效的波长为253.7nm(2537)。一般用来灭菌消毒的一般用来灭菌消毒的30W紫外灯管，光谱分布范围广，诱变效率较紫外灯管，光谱分布范围广，诱变效率较差；而差；而15W紫外灯管产生的紫外线紫外灯管产生的紫外线大约有大约有80波长集中在波长集中在2537，因此诱变效应比因此诱变效应比30W的好。的好。(2)紫外线的辐射剂量紫外线的辐射剂量绝对剂量：单位用绝对剂量：单位用erg/mm2(1 erg=10 7 J)，需要用一种剂量仪来，需要用一种剂量仪来测定，由于操作比较困难，实际工作中应用较少。测定，由于操作比较困难，实际工作中应用较少。相对剂量：单位用照射时间或杀菌率表示相对剂量：单位用照射时间或杀菌率表示剂量决定于紫外灯的功率、灯管与被照射微生物的距离及照射时剂量决定于紫外灯的功率、灯管与被照射微生物的距离及照射时间。在灯的功率和灯管的距离固定的情况下，剂量大小则由照射间。在灯的功率和灯管的距离固定的情况下，剂量大小则由照射时间决定。时间决定。用紫外线的杀菌率表示时，一般认为用紫外线的杀菌率表示时，一般认为90效果较好。效果较好。1.4 非电离辐射非电离辐射紫外线紫外线(3)紫外线照射的策略：最适剂量因微生物而异，紫外照射紫外线照射的策略：最适剂量因微生物而异，紫外照射剂量与杀菌率在一定范围内成正比。剂量与杀菌率在一定范围内成正比。使用使用15W紫外灯紫外灯2支，安装于镀铬灯罩内，使支，安装于镀铬灯罩内，使2537 光波集中于光波集中于被处理的微生物细胞，可以提高变异率。被处理的微生物细胞，可以提高变异率。将照射剂量提高到超致死量的程度，与可见光交替进行，利用将照射剂量提高到超致死量的程度，与可见光交替进行，利用光修复使损伤的细胞恢复，光修复使损伤的细胞恢复，减少死亡率，增加变异幅度。减少死亡率，增加变异幅度。一般采一般采用用30W紫外灯管，光复活的效果较好，或者在预培养基中增加一紫外灯管，光复活的效果较好，或者在预培养基中增加一定量的咖啡因或蛋白胨，也可以降低死亡率。定量的咖啡因或蛋白胨，也可以降低死亡率。2.2.紫外线诱变紫外线诱变1.4 非电离辐射非电离辐射紫外线紫外线(4)紫外线诱变的步骤与方法紫外线诱变的步骤与方法 出发菌株：把细菌斜面培养到对数期，霉菌或放线菌则培养到孢子出发菌株：把细菌斜面培养到对数期，霉菌或放线菌则培养到孢子刚成熟。刚成熟。前培养：营养丰富的培养基前培养：营养丰富的培养基+抑制修复物质，如咖啡碱或异烟肼等。抑制修复物质，如咖啡碱或异烟肼等。霉菌、放线菌培养到绝大部分孢子刚刚萌发。霉菌、放线菌培养到绝大部分孢子刚刚萌发。制备菌悬液：离心去除培养基，用生理盐水制备菌悬液，分散程度制备菌悬液：离心去除培养基，用生理盐水制备菌悬液，分散程度达达9095%。要求菌悬液浓度：细菌约。要求菌悬液浓度：细菌约1108个个/毫升，放线菌毫升，放线菌107108个个/毫升，霉菌约毫升，霉菌约106107个个/毫升。毫升。2.2.紫外线诱变紫外线诱变1.4 非电离辐射非电离辐射紫外线紫外线2.2.紫外线诱变紫外线诱变 紫外线照射：紫外线照射：紫外灯预热紫外灯预热20min20min，以稳定光波，边搅拌边照射，细，以稳定光波，边搅拌边照射，细胞均匀吸收紫外线胞均匀吸收紫外线。为避免光修复，在照射的过程中要在。为避免光修复，在照射的过程中要在暗室完成，暗室完成，仅可打开黄色或红色灯仅可打开黄色或红色灯。另据国外报道，经过紫外线诱变后的菌体。另据国外报道，经过紫外线诱变后的菌体可以转入到无菌试管内，并立即浸入冰水中可以转入到无菌试管内，并立即浸入冰水中12h12h，在，在低温的条件下低温的条件下，细胞内参与突变修复的各种酶类的活性受到抑制，细胞内参与突变修复的各种酶类的活性受到抑制，使修复难以进行使修复难以进行。后培养：照射完毕的菌悬液加入到适合于正突变体增殖的培养基后培养：照射完毕的菌悬液加入到适合于正突变体增殖的培养基中，在适宜温度下培养中，在适宜温度下培养1.52h1.52h。有些微生物在此阶段还可加入酪素水。有些微生物在此阶段还可加入酪素水解物、色氨酸或异烟肼等物质来抑制修复。解物、色氨酸或异烟肼等物质来抑制修复。稀释涂皿：后培养物，作不同程度的稀释，进行涂板培养和筛选。稀释涂皿：后培养物，作不同程度的稀释，进行涂板培养和筛选。1.5 电离辐射电离辐射1.电离辐射的种类、特性与来源电离辐射的种类、特性与来源X射线波长是0.06136纳米，X射线一般由X光机产生。射线的波长是纳米，射线来自放射性元素钴、镭或氡等。中子可以从回旋加速器、静电加速器或原子反应堆中产生 快中子具有的能量最高，为0.210MeV电离辐射诱变机理电离辐射诱变机理 直接作用：打断化学键 间接作用：通过自由基打断化学键，引起缺失和损伤 效应：染色体畸变，碱基置换，移码突变 1.5 电离辐射电离辐射2.电离辐射的诱变机理电离辐射的诱变机理1.5 电离辐射电离辐射3.电离辐射剂量电离辐射剂量X射线和射线和射线射线剂量常用伦琴剂量常用伦琴(R)表示，即表示，即1cm3干燥空气在干燥空气在0，1.013105 Pa产生产生2.08109离子时所需的能量。离子时所需的能量。其作用机理是使原子中的电子被击出而变成正离子。由于其作用机理是使原子中的电子被击出而变成正离子。由于具有很强的穿透能力，所以对细胞的杀死作用比紫外线和具有很强的穿透能力，所以对细胞的杀死作用比紫外线和一般化学试剂更强。在实践中不用象紫外线那样进行反复一般化学试剂更强。在实践中不用象紫外线那样进行反复多次照射。多次照射。常用剂量掌握在杀菌率常用剂量掌握在杀菌率90为宜，大约为宜，大约1万万20万万R。1.5 电离辐射电离辐射3.电离辐射剂量电离辐射剂量快中子快中子剂量常用拉德剂量常用拉德(rad)表示表示，指，指1g被照射物质吸收被照射物质吸收100erg辐辐射能量的射线剂量；可转换为伦琴射能量的射线剂量；可转换为伦琴(R)。在诱变育种中快中子照射的致死率为在诱变育种中快中子照射的致死率为5085较合适，较合适，产生的正突变率可达产生的正突变率可达50%，采用的诱变剂量大约在，采用的诱变剂量大约在1530krad。其作用机理是由中子穿过物质时把原子核中的质子撞击其作用机理是由中子穿过物质时把原子核中的质子撞击出来。由于快中子产生较大的电离密度，能有效地导致出来。由于快中子产生较大的电离密度，能有效地导致基因突变和染色体畸变，所以快中子对微生物诱变育种基因突变和染色体畸变，所以快中子对微生物诱变育种是较理想的。是较理想的。1.5 电离辐射电离辐射4.电离辐射的照射方法电离辐射的照射方法直接对平皿上生长的菌落进行照直接对平皿上生长的菌落进行照射；射；用打孔器将菌落连琼脂一同取出，用打孔器将菌落连琼脂一同取出，置于灭菌平皿内进行照射；置于灭菌平皿内进行照射；制成菌悬液，取制成菌悬液，取12ml置于试管置于试管内，浸入冰水中，从上、侧或下内，浸入冰水中，从上、侧或下面进行短时间照射。面进行短时间照射。低温可以降低或抑制修复酶的活低温可以降低或抑制修复酶的活性，防止突变体因修复酶的修复性，防止突变体因修复酶的修复而还原为正常细胞。而还原为正常细胞。1.5 近年来发展的新型诱变剂近年来发展的新型诱变剂1.微波：热和非热效应，分散低温干燥法消除微波热效应。微波：热和非热效应，分散低温干燥法消除微波热效应。2.红外射线红外射线3.激光：光量子流，光微粒。激光：光量子流，光微粒。4.高能电子流：较强的电离辐射线，剂量一般为杀菌率高能电子流：较强的电离辐射线，剂量一般为杀菌率90-99.9%5.离子注入离子注入优点优点1：离子束与生物体作用，不仅有能量沉积，而且同时有质量沉积。：离子束与生物体作用，不仅有能量沉积，而且同时有质量沉积。能量沉积：注入的离子与生物大分子发生一系列碰撞，大分子生物获得能量能量沉积：注入的离子与生物大分子发生一系列碰撞，大分子生物获得能量时，键断裂，分子击出原子位，留下断键或缺陷，而注入离子逐步损失能量，时，键断裂，分子击出原子位，留下断键或缺陷，而注入离子逐步损失能量，直到能量低于直到能量低于100 eV为止。为止。质量沉积：注入的离子与生物大分子结合成新分子。质量沉积：注入的离子与生物大分子结合成新分子。优点优点2：由于注入离子的不同电荷数、质量数、能量、剂量的组合，可提：由于注入离子的不同电荷数、质量数、能量、剂量的组合，可提供众多的诱变条件。供众多的诱变条件。优点优点3：离子注入具有作用区域的选择性、种类的多样性，其作用是局部：离子注入具有作用区域的选择性、种类的多样性，其作用是局部的、可控的、可对生物体进行定点区域诱变。的、可控的、可对生物体进行定点区域诱变。化学诱变剂也可借用电离辐射的方法。化学诱变剂也可借用电离辐射的方法。试管中所盛液体不能过多，否则氧气供应不足，试管中所盛液体不能过多，否则氧气供应不足，诱变效应和诱变效应和重复性重复性都比较差。都比较差。电离辐射的穿透能力比较强，可以穿透玻璃等材电离辐射的穿透能力比较强，可以穿透玻璃等材料，而紫外线则不能穿透普通的玻璃，诱变时必料，而紫外线则不能穿透普通的玻璃，诱变时必须打开盖子。须打开盖子。值得注意的事值得注意的事第二节第二节 化学诱变剂化学诱变剂5.2.1 5.2.1 化学诱变剂的一般特点化学诱变剂的一般特点5.2.2 5.2.2 化学诱变剂的类型化学诱变剂的类型:碱基类似物碱基类似物 烷化剂烷化剂 脱氨剂脱氨剂 移码诱变剂移码诱变剂 羟化剂羟化剂 金属盐类金属盐类 其他化学诱变剂其他化学诱变剂2.1 化学诱变剂的一般特点化学诱变剂的一般特点化学诱变剂往往具有专一性，对基因的某部位发生作用，对其化学诱变剂往往具有专一性，对基因的某部位发生作用，对其余部位则无影响。余部位则无影响。化学诱变剂的剂量主要决定于其浓度和处理时间。化学诱变剂的剂量主要决定于其浓度和处理时间。绝大多数化学诱变剂都具有毒性。绝大多数化学诱变剂都具有毒性。定义：一类能对定义：一类能对DNADNA起作用，改变起作用，改变DNADNA结构，并引起遗传变异的化学物质。结构，并引起遗传变异的化学物质。在在DNADNA复制过程中取代正常碱基，整合进复制过程中取代正常碱基，整合进DNADNA分子分子 它们产生异构体的频率高，出现碱基错配的它们产生异构体的频率高，出现碱基错配的概率也高概率也高碱基类似物是如何提高突变频率的碱基类似物是如何提高突变频率的?2.2 碱基类似物碱基类似物2.2 碱基类似物碱基类似物1.碱基类似物的诱变机制碱基类似物的诱变机制以以5溴尿嘧啶溴尿嘧啶(5-BU)为例为例碱基类似物：是指其分子结构同碱基类似物：是指其分子结构同DNADNA分子中的碱基非常类分子中的碱基非常类似，因此能取代碱基掺入到似，因此能取代碱基掺入到DNADNA分子中的一类化合物。分子中的一类化合物。主要诱变剂：主要诱变剂：5-5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5-BU5-BU）/T/T 2-2-氨基嘌呤（氨基嘌呤（2-AP2-AP）/A/A 3535 G G C CG G BU BUe eG G C CG G BU BUe eG G C CA=TA=TA=BUA=BUk k A:TA:TA:BUA:BUk k A:TA:TG G BU BUe eA:TA:TG G C CG G BU BUe e G G CA=T CA=T5-BU5-BU掺入错误掺入错误A:T G A:T G C C从上可知，由于从上可知，由于5-BU5-BU分子结构上的分子结构上的5 5位位BrBr原子的存在，改变原子的存在，改变了电荷的分布，影响酮式和烯醇式的平衡。了电荷的分布，影响酮式和烯醇式的平衡。2.2 碱基类似物碱基类似物2.碱基类似物的诱变处理方法碱基类似物的诱变处理方法(以以5-BU为例为例)(1)单独处理单独处理(2)与辐射线复合处理与辐射线复合处理斜面细菌斜面细菌液体培养液体培养至对数期至对数期饥饿培养饥饿培养8-10h8-10h琼脂平板琼脂平板涂布培养涂布培养移接移接去培养液去培养液加生理盐水加生理盐水加加5-BU5-BU25-40g/ml25-40g/ml 据报道，如果菌体先用据报道，如果菌体先用5-BU等碱基类似物进行处理，使它们首先渗入等碱基类似物进行处理，使它们首先渗入到到DNA分子中，然后用辐射线照射，诱变效果会比单独使用辐射线更好。分子中，然后用辐射线照射，诱变效果会比单独使用辐射线更好。因此，碱基类似物也是一种辐射诱变的增敏剂。因此，碱基类似物也是一种辐射诱变的增敏剂。真菌、放线菌孢子，则要提高真菌、放线菌孢子，则要提高5-BU5-BU的浓度（的浓度（0.11mg/ml0.11mg/ml），加到孢子悬液后，进行振），加到孢子悬液后，进行振荡培养数小时荡培养数小时(一般一般612h)612h)分离于平皿分离于平皿适温培养适温培养挑取单菌落，进行筛选。挑取单菌落，进行筛选。37（a）亚硝酸（b）羟胺（c）甲基磺酸乙酯（d）N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍 改变碱基结构的化学修饰剂：脱氨剂、羟化剂、烷化剂 常见的碱基修饰剂2.3 烷化剂烷化剂烷化剂是诱发突变中一类相当有效的化学诱变剂，具有一个或烷化剂是诱发突变中一类相当有效的化学诱变剂，具有一个或多个活性烷基，易取代多个活性烷基，易取代DNADNA分子中活泼的氢原子，与一个或多分子中活泼的氢原子，与一个或多个碱基起烷化反应，改变个碱基起烷化反应，改变DNADNA分子结构，引起突变。分子结构，引起突变。双功能烷化剂双功能烷化剂单功能烷化剂单功能烷化剂多功能烷化剂多功能烷化剂根根据据烷烷化化剂剂中中活活性性烷烷基基的的数数目目亚硝基类、磺酸酯类、硫酸酯类、亚硝基类、磺酸酯类、硫酸酯类、重氮烷类、乙烯亚胺类化合物重氮烷类、乙烯亚胺类化合物硫芥子、氮芥子类等硫芥子、氮芥子类等1.烷化剂定义与种类烷化剂定义与种类烷化碱基烷化碱基部分烷化剂部分烷化剂2.部分烷化剂部分烷化剂 和和 烷化碱基烷化碱基 甲基磺酸甲酯甲基磺酸甲酯亚硝基乙基脲亚硝基乙基脲7-7-甲基鸟嘌呤甲基鸟嘌呤3-3-甲基腺嘌呤甲基腺嘌呤O O6 6-甲基鸟嘌呤甲基鸟嘌呤2.3 2.3 烷化剂烷化剂2.3.1 烷化剂烷化剂1.烷化剂的作用机制烷化剂的作用机制(1)烷化剂主要通过烷化基团使烷化剂主要通过烷化基团使DNA分分子上的碱基及磷酸部分被烷化，子上的碱基及磷酸部分被烷化，DNA复复制时导致碱基配对错误而引起突变。制时导致碱基配对错误而引起突变。易发生烷化的位点：鸟嘌呤易发生烷化的位点：鸟嘌呤O6、胸腺、胸腺嘧啶嘧啶O4。其它位点：鸟嘌呤其它位点：鸟嘌呤N3、腺嘌呤、腺嘌呤N2和和N7、胞嘧啶、胞嘧啶N3。(2)烷化剂还可引起烷化剂还可引起DNA分子中磷酸和分子中磷酸和糖之间的共价键断裂，而造成突变。糖之间的共价键断裂，而造成突变。2.3.1 烷化剂烷化剂(3)烷化剂还可能使两个烷化剂还可能使两个鸟嘌呤鸟嘌呤N7位点形成共价位点形成共价键。键。(4)一般双功能烷化剂容一般双功能烷化剂容易引起易引起DNA双链间的交双链间的交联，造成变异或死亡。联，造成变异或死亡。1.1.烷化剂的作用机制烷化剂的作用机制2.3.1 烷化剂烷化剂2.烷化剂的性质烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶液中容易发生水解。比较活泼，不太稳定，在水溶液中容易发生水解。见光容易发生光化学反应，保藏时要注意避光。见光容易发生光化学反应，保藏时要注意避光。杀菌率低而诱变效应高，如亚硝基类、磺酸酯类等。杀菌率低而诱变效应高，如亚硝基类、磺酸酯类等。2.3.1 烷化剂烷化剂3.常用的烷化剂常用的烷化剂(1)1-甲基甲基-3-硝基硝基-1-亚硝基胍亚硝基胍(NTG)超诱变剂之称，能使细胞发生一次或多次突变，诱变效果好，尤其适超诱变剂之称，能使细胞发生一次或多次突变，诱变效果好，尤其适合于诱发营养缺陷型突变株。合于诱发营养缺陷型突变株。酸碱条件影响酸碱条件影响NTG的诱变效果，配制的诱变效果，配制NTG溶液和菌悬液都要用适宜的溶液和菌悬液都要用适宜的缓冲液，如磷酸或缓冲液，如磷酸或Tris缓冲液。缓冲液。，NTG分解成分解成HNO2；，NTG分解产生重氮甲烷；分解产生重氮甲烷；，NTG本身和本身和DNA起烷化作用。起烷化作用。1.取新鲜的斜面，用一定取新鲜的斜面，用一定pH值的缓冲液或值的缓冲液或Tris缓冲液洗下细菌制缓冲液洗下细菌制成菌悬液。如果采用细菌细胞或丝状菌孢子（真菌或放线菌）须成菌悬液。如果采用细菌细胞或丝状菌孢子（真菌或放线菌）须进行前培养，可用有关培养基代替以上缓冲液，孢子培养时间控进行前培养，可用有关培养基代替以上缓冲液，孢子培养时间控制在大部分孢子处在萌动阶段，经离心、洗涤，用缓冲液制成悬制在大部分孢子处在萌动阶段，经离心、洗涤，用缓冲液制成悬液，浓度约在液，浓度约在106-107mL-1；NTG的诱变处理方法：的诱变处理方法：2.3.1 烷化剂烷化剂3.常用的烷化剂常用的烷化剂(1)1-甲基甲基-3-硝基硝基-1-亚硝基胍亚硝基胍(NTG)2.配制NTG母液：由于NTG不溶于水，配制需加助溶剂甲酰胺或丙酮少许，然后加缓冲溶液，其比例为9：1（缓冲溶液9ml：NTG丙酮溶液1ml），一般NTG母液浓度配成1mg/ml。使用时取母液，加菌悬液，NTG最后处理浓度为100g/ml。一般处理浓度随菌种不同而异，通常细菌为1001000g/ml，而放线菌、真菌孢子为10003000 g/ml。3.将以上菌悬液和NTG溶液混合于一试管内，置该菌生长适宜的温度下保温处理若干时间。2.3.1 烷化剂烷化剂3.常用的烷化剂常用的烷化剂(1)1-甲基甲基-3-硝基硝基-1-亚硝基胍亚硝基胍(NTG)4.终止反应。用冷的生理盐水稀释到50倍以上或在低温下进行离心洗涤，除去药液，加无菌水使沉淀悬浮并作成一定稀释度分离于平皿。处理完毕后，马上把接触过NTG的器皿用NaOH或Na2S2O3浸泡处理。除以上直接以溶液处理外，也可以进行如下方法诱变处理：1.摇瓶振荡处理2.在平皿上生长过程处理2.3.1 2.3.1 烷化剂烷化剂3.3.常用的烷化剂常用的烷化剂(1)1-(1)1-甲基甲基-3-3-硝基硝基-1-1-亚硝基胍亚硝基胍(NTG)(NTG)NTG是一种强烈的致癌物质，操作时要带橡皮手套，穿工作服，带口罩，用称量瓶称量，最好在通风橱中进行。凡接触过NTG的器皿必须及时、单独处理，例如用自来水大量冲洗或用12mol/L的NaOH或2%的Na2S2O3浸泡过夜，洗净。2.3.1 2.3.1 烷化剂烷化剂3.3.常用的烷化剂常用的烷化剂(1)1-(1)1-甲基甲基-3-3-硝基硝基-1-1-亚硝基胍亚硝基胍(NTG)(NTG)2.3.1 烷化剂烷化剂(2)甲基磺酸乙酯甲基磺酸乙酯(EMS)水溶液中水解半衰期短，应现用现配；需低温、干燥保存；水溶液中水解半衰期短，应现用现配；需低温、干燥保存；诱变效应最佳的酸碱条件为；配制诱变效应最佳的酸碱条件为；配制EMS和菌悬液需缓冲液，不仅影响和菌悬液需缓冲液，不仅影响诱变剂渗透到细胞内的速度，还影响诱变剂的稳定性。诱变剂渗透到细胞内的速度，还影响诱变剂的稳定性。(3)硫酸二乙酯硫酸二乙酯(DES)不溶于水，溶于乙醇，很不稳定；不溶于水，溶于乙醇，很不稳定；水溶液中半衰期很短，随用随配，需低温、干燥、避光保存；水溶液中半衰期很短，随用随配，需低温、干燥、避光保存；DES诱变效应在诱变效应在pH中性时效应最好。中性时效应最好。(4)乙烯亚氨乙烯亚氨溶于水，不稳定易分解，易挥发，有强烈腐蚀作用，易燃易爆，需避光、溶于水，不稳定易分解，易挥发，有强烈腐蚀作用，易燃易爆，需避光、密封、低温保存；密封、低温保存；能与一个或多个碱基起化学反应，引起能与一个或多个碱基起化学反应，引起DNA复制时碱基错配而发生变异；复制时碱基错配而发生变异；在水溶液中易产生无诱变作用物质，最好采用高浓度短时间处理。在水溶液中易产生无诱变作用物质，最好采用高浓度短时间处理。3.3.常用的烷化剂常用的烷化剂2.3.2 脱氨剂脱氨剂(以亚硝酸为例以亚硝酸为例)1.诱变机制诱变机制脱氨基作用脱氨基作用引起引起DNA两条单链之间的交联作用两条单链之间的交联作用亚硝酸（亚硝酸（nitrous acidnitrous acid）是典型的脱氨剂）是典型的脱氨剂 亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的DNADNA分子，脱去碱基中的氨基变成酮基，分子，脱去碱基中的氨基变成酮基，改变碱基氢键的电位，引起碱基转换而发生变异。改变碱基氢键的电位，引起碱基转换而发生变异。2.3.2 脱氨剂脱氨剂(以亚硝酸为例以亚硝酸为例)2.亚硝酸的处理方法亚硝酸的处理方法(1)试剂配制试剂配制1mol/L pH4.5 醋酸缓冲液醋酸缓冲液0.1 mol/L 亚硝酸钠溶液亚硝酸钠溶液磷酸氢二钠溶液磷酸氢二钠溶液(2)处理方法处理方法处理对象处理对象亚硝酸钠溶亚硝酸钠溶液处理浓度液处理浓度温度温度处理时间处理时间终止反应终止反应(加入磷酸氢二钠溶液加入磷酸氢二钠溶液)孢子悬液孢子悬液0.025 mol/L0.025 mol/L25252626101020 min20 minpHpH降至降至6.86.8细菌悬液细菌悬液0.05 mol/L0.05 mol/L353537375 510 min10 minpHpH降至降至6.86.82.4 移码诱变剂移码诱变剂移码诱变剂与移码诱变剂与DNA相互结合引起相互结合引起碱基增添或缺失而造成突变。碱基增添或缺失而造成突变。对噬菌体有较强的诱变作用；对噬菌体有较强的诱变作用；诱发细菌、放线菌的质粒脱落比诱发细菌、放线菌的质粒脱落比其他诱变剂效果更显著。其他诱变剂效果更显著。吖啶化合物的诱变机制：与吖啶化合物的诱变机制：与DNA结合后，结合后，DNA链拉长，两碱基距链拉长，两碱基距离拉宽，使碱基插入或缺失。离拉宽，使碱基插入或缺失。吖啶黄的性质和使用方法吖啶黄的性质和使用方法微溶于热水，溶于乙醇和乙醚，不稳微溶于热水，溶于乙醇和乙醚，不稳定，需避光保存。定，需避光保存。2.5 羟化剂羟化剂羟胺（羟胺（hydroxylaminehydroxylamine）是典型的羟化剂）是典型的羟化剂 羟胺的分子式为羟胺的分子式为NHNH2 2OHOH（简称（简称HAHA）,常以盐酸羟胺形常以盐酸羟胺形式存在（分子式为式存在（分子式为NHNH2 2OHHClOHHCl），为白色晶体，溶于），为白色晶体，溶于水，不稳定易分解，具腐蚀性，容易吸湿，故要密封、水，不稳定易分解，具腐蚀性，容易吸湿，故要密封、干燥保存。干燥保存。羟胺是具有特异效应的诱变剂，专一地诱发羟胺是具有特异效应的诱变剂，专一地诱发G:C A:TG:C A:T的的转换。转换。2.5 羟化剂羟化剂羟胺的诱变机制羟胺的诱变机制改变了结构的改变了结构的胞嘧啶胞嘧啶2.5 羟化剂羟化剂 根据诱变机制，羟胺不能使突变回复，即不能使根据诱变机制，羟胺不能使突变回复，即不能使A:T A:T G:CG:C转换，进行逆向突变。转换，进行逆向突变。由于羟胺是诱发由于羟胺是诱发G:C A:TG:C A:T的专一性诱变剂，因此，可的专一性诱变剂，因此，可以用来鉴别突变体是以用来鉴别突变体是A:T G:CA:T G:C还是还是G:C A:TG:C A:T转换。转换。羟胺的处理方法：羟胺的处理方法：常用浓度为常用浓度为0.15%0.15%，可直接在溶液中，可直接在溶液中处理，时间处理，时间12h12h，然后分离培养。但一般都加到琼脂平板或，然后分离培养。但一般都加到琼脂平板或振荡培养基中，然后接入孢子或细菌，在适温下培养，生长振荡培养基中，然后接入孢子或细菌，在适温下培养，生长过程中处理，所用浓度比直接处理时低些。过程中处理，所用浓度比直接处理时低些。2.6 金属盐类金属盐类用于诱变育种的金属盐类主要有氯化锂、硫酸锰等。用于诱变育种的金属盐类主要有氯化锂、硫酸锰等。氯化锂单独使用没有明显的诱变效果，几乎都要与氯化锂单独使用没有明显的诱变效果，几乎都要与其他诱变剂配合处理，因此也称为其他诱变剂配合处理，因此也称为助诱变剂助诱变剂。它在。它在高产菌种选育史上发挥了极其显著的作用。高产菌种选育史上发挥了极其显著的作用。2.7 其他化学诱变剂其他化学诱变剂1.秋水仙碱：是诱发细胞染色体多倍体的诱变剂。自秋水仙碱：是诱发细胞染色体多倍体的诱变剂。自1937年年美国学者布莱克斯利（）等，用秋水仙素加倍曼陀罗等植物美国学者布莱克斯利（）等，用秋水仙素加倍曼陀罗等植物的染色体数获得成功以后，秋水仙素就被广泛应用于细胞学、的染色体数获得成功以后，秋水仙素就被广泛应用于细胞学、遗传学的研究和植物育种。遗传学的研究和植物育种。秋水仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分秋水仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期，使具备两套染色体的母细胞无法分裂，导致多倍体裂中期，使具备两套染色体的母细胞无法分裂，导致多倍体产生。产生。2.抗生素抗生素：作为诱变剂的抗生素主要有链黑霉素，争光霉：作为诱变剂的抗生素主要有链黑霉素，争光霉素，丝裂霉素，放线菌素，正定霉素，光辉霉素和阿霉素等。素，丝裂霉素，放线菌素，正定霉素，光辉霉素和阿霉素等。都是抗癌药物，效果不如烷化剂，应用不广泛。都是抗癌药物，效果不如烷化剂，应用不广泛。2.8 重视化学诱变剂的操作安全重视化学诱变剂的操作安全诱变剂诱变剂 在在DNADNA上的初级效应上的初级效应 遗传反应遗传反应 碱基类似物碱基类似物 掺入作用掺入作用 ATGCATGC转换转换 羟胺羟胺 同胞嘧啶起羟化反应同胞嘧啶起羟化反应 GCATGCAT转换转换 亚硝酸亚硝酸 A A、C C的脱氧基作用的脱氧基作用 DNADNA交联交联 ATGCATGC转换转换 缺失缺失 烷化剂烷化剂 烷化碱基（主要是烷化碱基（主要是G G）而导致：）而导致：脱嘌呤作用；烷化碱基的互变异构作用；脱嘌呤作用；烷化碱基的互变异构作用；DNADNA链的交联作用；糖链的交联作用；糖-磷酸骨架的断裂磷酸骨架的断裂 碱基置换（碱基置换（ATGCATGC转换、转换、ATTAATTA颠换、颠换、GCCGGCCG颠换）颠换）及染色体畸变及染色体畸变 吖啶类吖啶类 个别碱基的插入或缺失个别碱基的插入或缺失 移码突变移码突变 紫外线照射紫外线照射 形成嘧啶二聚体；形成嘧啶的水合物；形成嘧啶二聚体；形成嘧啶的水合物；DNADNA交联；交联；DNADNA断裂断裂 ATGCATGC转换、转换、ATGCATGC颠换、颠换、及移码突变及移码突变 电离辐射电离辐射 脱氧核糖脱氧核糖-碱基之间化学键及脱氧核糖碱基之间化学键及脱氧核糖-磷磷酸之间化学键的断裂；通过自由基对酸之间化学键的断裂；通过自由基对DNADNA的作用的作用 ATGCATGC转换、移码突变及染转换、移码突变及染色体畸变色体畸变 2.9 小结小结第三节第三节 生物诱变剂生物诱变剂噬菌体噬菌体基因定点诱变剂基因定点诱变剂生物诱变剂的主要诱变方式生物诱变剂的主要诱变方式3.1 噬菌体噬菌体采用某些噬菌体来筛选抗噬菌体突变菌株采用某些噬菌体来筛选抗噬菌体突变菌株时，常常发现伴随着出现抗生素产量明显时，常常发现伴随着出现抗生素产量明显提高的抗性突变株。因此，可以认为这些提高的抗性突变株。因此，可以认为这些溶源性噬菌体是一种生物诱变剂。溶源性噬菌体是一种生物诱变剂。3.2 基因定点诱变基因定点诱变 随着基因工程技术的发展，随着基因工程技术的发展，点突变技术在蛋白质工程中正点突变技术在蛋白质工程中正得到广泛应用，特定寡核苷酸得到广泛应用，特定寡核苷酸在突变技术中起着介导作用，在突变技术中起着介导作用，使基因成为一种新的分子水平使基因成为一种新的分子水平生物诱变剂。生物诱变剂。寡核苷酸介导的寡核苷酸介导的定点诱变定点诱变3.3 生物诱变剂的主要诱变方式生物诱变剂的主要诱变方式 1.转导诱发突变转导诱发突变概念：概念：经完全或部分缺馅噬菌体的媒介，将供体菌的小片段经完全或部分缺馅噬菌体的媒介，将供体菌的小片段DNA携带至受体菌中，经配对、双交换后整合至供体菌内而获携带至受体菌中，经配对、双交换后整合至供体菌内而获新的遗传性状之现象。新的遗传性状之现象。烈性噬菌体：烈性噬菌体：随机转导，宿主细菌的基因型发生改变；随机转导，宿主细菌的基因型发生改变；温和噬菌体：温和噬菌体：特定转导，使供体菌和受体菌都产生基因突变。特定转导，使供体菌和受体菌都产生基因突变。3.3