毛细管电泳和超临界流体色谱法.ppt
第六章 毛细管电泳和超临界流体色谱法毛细管电泳毛细管电泳的概述；毛细管电泳的理论；毛细管电泳的仪器系统；毛细管电泳的应用。第六章 毛细管电泳和超临界流体色谱法超临界流体色谱法；超临界流体色谱法的概述；超临界流体色谱法的速率理论；超临界流体色谱法的仪器；超临界流体色谱法的应用。第一节 毛细管电泳一、概述1、毛细管电泳(Capillary electrophoresis,CE)的历史：1981年Jorgenson&Lukacs 用75 m的毛细管柱分离了丹酰化氨基酸，40万理论塔板数/m。2、电泳是指电介质中带电粒子在电场作用下以不同速度向电荷相反方向迁移的现象，利用这种现象对物质进行分离分析的方法称之电泳法。第一节 毛细管电泳HPECHPEC高效毛细管电泳高效毛细管电泳第一节 毛细管电泳四色荧光标记毛细管电泳四色荧光标记毛细管电泳DNADNA测序测序第一节 毛细管电泳3、特点：1）柱效高，可达105106理论塔板数/m；高效2）分离速度快；快速3）几乎不消耗溶剂，样品用量少，仅为几十纳升，仪器成本也低；低耗4）选择性大，可根据不同的分子性质对生物大分子、药物等极广泛的分离对象进行有效的分离。灵敏第一节 毛细管电泳4、分类名称缩写管内填充物说明毛细管区带电泳CZEpH缓冲的自由电解质溶液，可含有一定功能的添加剂。属自由溶液电泳型，但可通过加添加剂引入色谱机理。胶束电动毛细管色谱MECCCZE载体带电荷的胶束CZE扩展的色谱型微乳液电动毛细管色谱MEECC由缓冲液、不溶于水的有机溶剂和乳化剂构成的微乳液。CZE扩展的色谱型毛细管凝胶电泳CGE各种电泳用凝胶或其他筛分介质。属非自由溶液电泳，含有“分子筛”效应。毛细管等电聚焦CIEF建立pH梯度的两性电解质按等电点分离，属电泳型，要求完全抑制电渗流动。毛细管电动色谱CECCEZ载体液相色谱固定相属非自由溶液色谱型非水毛细管电泳NACE含有电解质的非水体系属自由溶液电泳型第一节 毛细管电泳二、毛细管电泳的理论基础1、电泳和电泳淌度 E为电场强度；mep为溶质的淌度（溶质在给予缓冲液中单位时间和单位电场强度下移动的距离）。e和h分别为介质的介电常数和黏度，zi是粒子的Zeta电势，Zeta电势和粒子的表面电荷成正比，和粒子分子量成反比。第一节 毛细管电泳2、电渗和电渗率 mos为电渗率；uos为电渗速度；zos为管壁的Zeta电势3、表观淌度和权均淌度 uap为表观迁移速度，分离后出峰次序为：正离子中性分子负离子。第一节 毛细管电泳 kp为容量因子；np和ns分别为样品在P相（在毛细管中引入另一相，如胶束、高分子团等准固定相或色谱固定相等，称为P相）和溶剂中的分子数；mp为P相的表观淌度。第一节 毛细管电泳4、分离效率与谱带展宽柱效和塔板高度，Ld为进样口到检测器的距离。毛细管电泳只有纵向扩散项，时电驱动的扁平流型系统自 热：扩散与吸附：E为电场强度，kV/m；c为介质浓度，mol/l；d为管径，mm。第一节 毛细管电泳5、分离度：将淌度相近的组分分开的能力。与外加电压V；有效柱长与总长度之比（Ld/L）；电泳有效淌度差（mef）；电渗淌度（mos）有关。第一节 毛细管电泳三、毛细管电泳仪器设备1、高压电源2、毛细管柱3、进样（电动/压力/扩散）4、检测器四、应用蛋白质第二节 超临界流体色谱法一、概述1958年，James Lovelock首次提出设想。1962年，Klesper第一篇关于用超临界流体二氯二氟甲烷和二氯二氟甲烷作的流动相，分离镍卟啉异构体。1966年正戊烷为流动相，分析多环芳烃、染料和环氧树脂。1968年，Gidding等以CO2和氨为流动相，分析核苷、糖、氨基酸、甾醇、类固醇、类胡萝卜素等。1981年Novotay&Lee毛细管柱超临界流体色谱（Supercritical fluid chromatography,SFC）。才完善技术。1、超临界流体（Supercritical fluid,SF）传质阻力小，可得到快速高效的分离；在较低温度下，可分析热不稳定性和分子量大的物质，同时还能增加柱子的选择性；流体的密度可改变流体的性质。特点：1）与GC比，溶解度增大，分离难挥发样品效果好。2）与HPLC相比，扩散系数大，分离度增加。3）黏度低于液体，柱压降低，每米理论板数提高。4）密度：溶解度、扩散系数和黏度都是密度的函数，可改变密度来实现，如程序升压等。第二节 超临界流体色谱法第二节 超临界流体色谱法2、SFC与GC、LC的比较SFCSFCGCGCLCLC流动相选择性流动相选择性流动相和固定相的函数固定相的函数流动相的函数总柱效总柱效最高，毛细管SFC为106最低其次分析时间分析时间分析时间短分析时间较长分析时间短工作温度工作温度室温至200精确的高温室温检测器检测器可接各种类型只接FID,ECD,FPD,TID,PID,TCD等不能用FID，不能直接接入MS第二节 超临界流体色谱法2、超临界流体色谱法的速率理论1）相对变数（reduced variable），某一参数与其临界变数之比值。Pc、Vc、Tc、rc分别为临界压力、临界体积、临界温度和临界密度2）SF的溶剂力，以溶度参数（d，cal/cm3）表示a为分子间引力；V为摩尔体积。第二节 超临界流体色谱法3）Golay速率理论方程B/u纵向扩散；Cmu流动相传质；CSu固定相传质4）影响板高的因素流动相线速u、柱径、固定相液膜厚度和流动相密度。第二节 超临界流体色谱法第二节 超临界流体色谱法3、操作条件的选择1）固定相：抗溶剂冲刷；化学稳定性好，选择性高；热稳定性好。选用化学键合固定相，最多是甲基聚硅氧烷，如：OV-1OV-101DB-1;苯基聚硅氧烷，如DB-5SB-phenyL-5;二苯基聚硅氧烷，如：SB-biphenyL-25;等 Pirkle型手性固定相：母体为3,5-二硝基苯甲酰，接上苯基甘氨酸或亮氨酸基团，分离氨基酸、亚砜、内酰胺等对映体。环糊精（cyclodextrin,CD）6-12个葡萄糖单元手性环状低聚糖，分离不同管能团手性物。聚糖类手性固定相：内酰胺、芳基酰胺对映体拆分。氨基酸和酰胺类手性固定相：手性药物拆分。2）流动相：选择原则。考虑溶剂强度、选择性、化学活性；又要考虑其在操作条件下的稳定性。SFC流动相分二类：第一类TC190 CO2、乙烷、丙烯等，分离热稳定性差的物质第二节 超临界流体色谱法第二类TC190 正戊烷、正己烷、异丙醇等，分离挥发性低、分子量大的物质。（P250）目前在SFC用的：二氧化碳、正戊烷、正己烷、异丙醇。二氧化碳最常用，分离热敏性物质，但不利极性物质分离；极性化合物可用N2O或NH3作流动相；但也可在二氧化碳中加入改性剂（极性并与二氧化碳相溶），如甲醇（常用）、乙腈等。第二节 超临界流体色谱法第二节 超临界流体色谱法3）温度：柱温：100125 高压GC区，75；6070 SFC区，20。检测器温度：250450；室温或柱温。4）压力和密度：K0位0时的k，k0是温度的函数，S是比例常数，r是流动相密度5）柱径、柱长和阻力器的选择：反比；正比；控制线速。4、超临界流体色谱法仪器流动相输送系统、进样系统、色谱炉和流量限制器、检测系统。第二节 超临界流体色谱法色谱炉5、SFC联用技术SFC/MS联用、SFC/NMR联用第二节 超临界流体色谱法第二节 超临界流体色谱法
