生物分离工程第五章层析.ppt

层 析主讲：杨丽芬主讲：杨丽芬起源起源 19031903年，俄国的植物学家年，俄国的植物学家茨维特茨维特（TsweetTsweet）提出。）提出。19011901年的时候开始研究色谱现象。年的时候开始研究色谱现象。19031903年，他将年，他将植物植物叶子叶子的的石油醚提取液石油醚提取液倒入到填装倒入到填装CaCOCaCO3 3的玻璃的玻璃管内，用纯净的管内，用纯净的石油醚淋洗石油醚淋洗，产生了不同的，产生了不同的色带色带，她们分别为胡萝卜素、叶黄素、和叶绿素她们分别为胡萝卜素、叶黄素、和叶绿素A A。所以。所以称之为色谱法（层析）。称之为色谱法（层析）。层析技术的特点层析技术的特点 分离精度高分离精度高、设备简单设备简单、操作方便操作方便，在物质成分，在物质成分的的定量分析定量分析、检测检测、制备分离制备分离与与纯化纯化方面应用广方面应用广泛，是下游技术加工过程中最重要的纯化技术之泛，是下游技术加工过程中最重要的纯化技术之一。一。层析的原理层析的原理据混合物中，溶质在据混合物中，溶质在互不相溶互不相溶的两相之间的两相之间分配行为分配行为的差别，引起的差别，引起移动速度移动速度的不同而进行分离的方法。的不同而进行分离的方法。互不相溶的两相分别称为互不相溶的两相分别称为固定相固定相和和流动相流动相，固定相，固定相填充于柱中，在柱的顶端加入一定量的料液后，连填充于柱中，在柱的顶端加入一定量的料液后，连续输入流动相，料液中的续输入流动相，料液中的溶质溶质在在固定相固定相和和流动相流动相中中发生扩散传质，发生扩散传质，产生分配平衡产生分配平衡。分配系数大的溶质分配系数大的溶质在固定相上存的几率大，随流动相移动的速度小；在固定相上存的几率大，随流动相移动的速度小；分配系数小的溶质在固定相上存的几率小，随流动分配系数小的溶质在固定相上存的几率小，随流动相移动的速度大相移动的速度大。在层析柱出口，各在层析柱出口，各溶质浓度溶质浓度随随时间时间的变化图称作的变化图称作洗洗脱曲线脱曲线。层析的分类层析的分类 按流动相的按流动相的相态相态：气相层析法气相层析法、液相层析法液相层析法、超临界流体层析法超临界流体层析法。固定相可以是。固定相可以是固体固体、液体液体、以固体为载体的以固体为载体的液体薄层液体薄层。生物物质一般在水溶。生物物质一般在水溶液中，故生物分离一般采用液中，故生物分离一般采用液相层析法液相层析法。按按固定相形状固定相形状：液相层析液相层析分为分为纸层析纸层析、薄层层薄层层析析、柱层析柱层析。纸层析和薄层层析主要用于。纸层析和薄层层析主要用于分析分析（定性或定量定性或定量），柱层析主要用于），柱层析主要用于制备分离制备分离。按按操作压力操作压力：以：以固体为固定相固体为固定相的液相层析又分的液相层析又分为为低压低压（）（）、中压中压（4MPa）、高压高压（440MPa）按流动相的按流动相的流向流向：轴向流层析和径向流层析。：轴向流层析和径向流层析。轴向流层析轴向流层析：流动相从固定相的一端输入，沿：流动相从固定相的一端输入，沿轴向轴向流向另一端。应用普遍。流向另一端。应用普遍。径向流层析径向流层析：柱心柱心设一通设一通透性细管透性细管，料液料液及及流动相流动相从柱的从柱的周围周围引入，从引入，从外表面外表面沿沿径向径向流向流向柱心柱心，透过，透过中心管中心管流出。流出。优点优点：规模放大规模放大时时半径不变半径不变，通过，通过增增大柱高大柱高提高处理能力，增加柱高不会增加提高处理能力，增加柱高不会增加压降压降，溶溶质浓度的分布质浓度的分布较轴向流层析较轴向流层析均匀均匀，对固定相的，对固定相的机械机械强度强度要求不大，更适合要求不大，更适合大规模大规模的分离过程。缺点：的分离过程。缺点：设备设备造价高造价高。径径向向流流层层析析操操作作示示意意图图按分离操作方式：洗脱层析、迎头分析、顶替展开。按分离操作方式：洗脱层析、迎头分析、顶替展开。洗脱层析洗脱层析：根据料液中的溶质在固定相和流动相间：根据料液中的溶质在固定相和流动相间 分配行为分配行为的不同，在层析柱的不同，在层析柱出口出口被被展开展开形成相互分离形成相互分离 的的层析峰层析峰。迎头分析迎头分析：与一般的固定床吸附操作相同，：与一般的固定床吸附操作相同，大量料液大量料液 连续连续输入输入到层析柱中，直到在出口处发生到层析柱中，直到在出口处发生溶质穿透溶质穿透，只有只有最先穿透最先穿透的的组分组分能以能以纯粹的状态纯粹的状态得到得到部分回收部分回收，之后之后流出液均为双组分或双组份以上的流出液均为双组分或双组份以上的混合物混合物。顶替展开顶替展开：流动相流动相中含有中含有与固定相的亲和力与固定相的亲和力比料液中比料液中 各组分各组分都大都大的的物质物质（顶替剂顶替剂），顶替剂将料液中的所），顶替剂将料液中的所含溶质按其含溶质按其与固定相亲和力的大小不同与固定相亲和力的大小不同从柱中从柱中次序顶次序顶替替（洗脱）出来。顶替展开法可使区带得到（洗脱）出来。顶替展开法可使区带得到浓缩浓缩，适，适于于大量处理稀溶液大量处理稀溶液。据溶质和固定相之间的相互据溶质和固定相之间的相互作用机理作用机理分：凝胶过滤分：凝胶过滤层析、离子交换层析、反相层析、疏水作用层析、层析、离子交换层析、反相层析、疏水作用层析、亲和层析。亲和层析。层析过程的理论基础？层析过程的理论基础？平衡模型平衡模型该模型假定层析柱中该模型假定层析柱中不存在传质阻力不存在传质阻力、纵向扩散纵向扩散，溶质在两相中的溶质在两相中的分配瞬间达到平衡分配瞬间达到平衡。根据根据分配平衡分配平衡和和物料平衡物料平衡对色谱过程进行处理，得对色谱过程进行处理，得出了出了洗脱时间（洗脱时间（t tR R）和和洗脱体积（洗脱体积（V VR R）的公式。的公式。当分配平衡符合线性关系时，当分配平衡符合线性关系时，V Vo o为孔隙体积，为孔隙体积，H H为层析柱内固液体积之比。为层析柱内固液体积之比。该模型很粗略，初步揭示了物质在色谱柱内的迁移该模型很粗略，初步揭示了物质在色谱柱内的迁移过程，过程，非线性分布等温线非线性分布等温线也能比较好的解释也能比较好的解释不对称不对称色谱峰色谱峰，特别是，特别是拖尾色谱的成因拖尾色谱的成因。但其理论假设和。但其理论假设和数学处理都很简单，仅能显示数学处理都很简单，仅能显示线性分配平衡线性分配平衡情况下情况下柱内柱内层析带层析带的的平均移动速度平均移动速度和柱内洗脱峰的和柱内洗脱峰的平均停平均停留时间留时间，不能阐明不能阐明色谱色谱流出曲线方程流出曲线方程，实际应用价，实际应用价值有限。但它为色谱理论的发展提供了有益指导。值有限。但它为色谱理论的发展提供了有益指导。理论板模型（塔板理论）理论板模型（塔板理论）19411941年，年，MartinMartin和和SyngeSynge提出的，他们把色谱柱设提出的，他们把色谱柱设想成许多液想成许多液-液萃取单元。液萃取单元。基本假设基本假设：色谱柱内径和柱内填料填充均匀，色谱柱由色谱柱内径和柱内填料填充均匀，色谱柱由若干若干小段小段组成，这样一小段被称为一个组成，这样一小段被称为一个理论塔板理论塔板。每一。每一小段的高度为小段的高度为理论板当量高度（理论板当量高度（HETPHETP），塔板一部，塔板一部分为固定相占据，另一部分为流动相占据，且分为固定相占据，另一部分为流动相占据，且各塔各塔板的流动相体积相等板的流动相体积相等，称为，称为板体积板体积，以，以表示。表示。层析柱中层析柱中理论板的数目理论板的数目为为N N；层析柱的高度为层析柱的高度为L L。每个塔板内每个塔板内溶质在两相溶质在两相瞬间瞬间达到平衡，纵向分子扩达到平衡，纵向分子扩散可以忽略。散可以忽略。溶质在各塔板上的溶质在各塔板上的分配系数分配系数为一为一常数常数，分子纵向扩，分子纵向扩散可以忽略。散可以忽略。流动相通过色谱柱流动相通过色谱柱不是连续不是连续的，而是的，而是脉冲式脉冲式的间歇的间歇过程。每次进入和从一塔板转移到另一塔板的过程。每次进入和从一塔板转移到另一塔板的流动流动相体积相体积均为均为Vm。VmVmVmdQdQdQdQcm，n-2cm，n-1cm，ncs，n-2cs，n-1cs，nn-2n-1n理论板模型示意图理论板模型示意图对于第对于第n n段理论板：段理论板：C Cs,n s,n=m Cm Cm,n m,n 流动相流入微分体积流动相流入微分体积dQdQ时，溶质在第时，溶质在第n n段的物料横算式：段的物料横算式：（cm，n-1cm,n）dQ=V0Ndcm,nVtV0Ndcs,n系统中只有流动相流动时，达到出口所需的时间：系统中只有流动相流动时，达到出口所需的时间：=L/u将将、代入代入得：得：若进料时间为若进料时间为t0，料液中溶质的浓度为，料液中溶质的浓度为C0，tt0后输入后输入不含溶质的流动相，则式子的初始和边界条件为：不含溶质的流动相，则式子的初始和边界条件为：当料液量很小式，可认为料液为脉冲输入，上式为洗当料液量很小式，可认为料液为脉冲输入，上式为洗脱曲线，呈脱曲线，呈Poisson分布（泊松分布）。若果分布（泊松分布）。若果N值很大值很大，则溶质的洗脱曲线则溶质的洗脱曲线可用可用Gauss分布分布（正态分布）（正态分布）近似近似，即即 其中 或说明，理说明，理论板数越多论板数越多，洗脱峰越窄洗脱峰越窄，溶质之间的分离，溶质之间的分离程度越好，利用程度越好，利用实测的洗脱峰实测的洗脱峰和式子可计算层析柱的和式子可计算层析柱的理论板数理论板数。理论板模型仅用一个理论板模型仅用一个理论板数理论板数描述层析柱的描述层析柱的分离性分离性能能，使用方便，使用方便，特别适合于料液浓度很低的分析过特别适合于料液浓度很低的分析过程程。但是，理论板模型。但是，理论板模型不能确定层析柱的分离性能不能确定层析柱的分离性能的影响因素的影响因素，特别对于料液浓度较高的制备分离过，特别对于料液浓度较高的制备分离过程。程。轴向扩散模型轴向扩散模型 考虑到溶质在流动向和固定相间的考虑到溶质在流动向和固定相间的传质速率传质速率及流动及流动向的向的流动状态流动状态。该模型假设固定相为均质球形颗粒，。该模型假设固定相为均质球形颗粒，溶质在固定相内溶质在固定相内无对流运动无对流运动，利用，利用均质固相模型均质固相模型进进行物料衡算，最后求出：行物料衡算，最后求出：从图上可知，从图上可知，存在某一流速使存在某一流速使HETPHETP最小最小，在此流速下塔板理在此流速下塔板理论数最大，分离效果最好论数最大，分离效果最好。在。在液相层析液相层析的操作条件下，一般的操作条件下，一般分子扩散的影响可忽略不计。分子扩散的影响可忽略不计。因此，因此，为提高分离效果为提高分离效果，可通，可通过过降低流速降低流速或或减小固定相粒径减小固定相粒径来降低来降低HETPHETP，提高理论板数提高理论板数。由于减低流速意味着增加分离由于减低流速意味着增加分离时间，故时间，故采用减小粒径的方法采用减小粒径的方法可同时保证分离操作的速度和可同时保证分离操作的速度和高精度高精度，这是高效液相层析的，这是高效液相层析的理论基础。很短的层析柱具有理论基础。很短的层析柱具有很大的理论板数，对高速度和很大的理论板数，对高速度和高精度的分析非常有利。高精度的分析非常有利。分离度？分离度？又称为又称为分别率分别率。表示两个。表示两个相邻相邻的的洗脱峰洗脱峰之间的之间的距离距离与与两个两个缝宽的代数平均值缝宽的代数平均值之之比比。通过通过增大峰间距离增大峰间距离或或降低缝宽降低缝宽可提高溶质之间的分离可提高溶质之间的分离度。度。容量因子容量因子（kk）固定相和流动相间固定相和流动相间溶质分配量之比溶质分配量之比。选择性（选择性（）洗脱峰相邻的两种溶质的洗脱峰相邻的两种溶质的容量因子之比容量因子之比。Rs1时，溶时，溶质的分离已质的分离已经较好。一经较好。一般把般把Rs值应值应在之间在之间假定曲线呈高斯分布，将假定曲线呈高斯分布，将平均洗脱时间平均洗脱时间和和底线处切底线处切线缝宽线缝宽的的公式公式代入分离度的公式得：代入分离度的公式得：对于两个相邻的洗脱组分，假定对于两个相邻的洗脱组分，假定洗脱缝宽洗脱缝宽和和分配系分配系数近似相等数近似相等，即，即W1=W2，m1=m2，上式简化：上式简化：将将塔板数塔板数的公式代入得：的公式代入得：将容量因子的公式代入得：将容量因子的公式代入得：分离度随着理论塔板数的增大而增大分离度随着理论塔板数的增大而增大，当两种溶质的当两种溶质的分配系数（容量因子）相差较小时分配系数（容量因子）相差较小时，需要较多的理论需要较多的理论板数板数才能获得较大的分离度。才能获得较大的分离度。凝胶过滤层析凝胶过滤层析（Gelfiltrationchromatography，GFC）1.1.原理与操作原理与操作用用凝胶粒子凝胶粒子为固定相，根据料液中溶质为固定相，根据料液中溶质相对分子质量相对分子质量的的差别差别进行分离的液相层析法。进行分离的液相层析法。相对分子质量较大相对分子质量较大相对分子质量较大相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔的物质由于直径大于凝胶网孔的物质由于直径大于凝胶网孔的物质由于直径大于凝胶网孔被完被完被完被完全排阻全排阻全排阻全排阻在孔外，在孔外，在孔外，在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以因此流程较短，移动速度快；所以因此流程较短，移动速度快；所以因此流程较短，移动速度快；所以首先流出首先流出首先流出首先流出。相对分子质量较小相对分子质量较小相对分子质量较小相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可的物质由于直径小于凝胶网孔，可的物质由于直径小于凝胶网孔，可的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透完全渗透完全渗透完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以因此流程较长，移动速率慢；所以因此流程较长，移动速率慢；所以因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出最后流出最后流出最后流出。中等大小的分子中等大小的分子中等大小的分子中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外，它们在凝胶颗粒内外，它们在凝胶颗粒内外，它们在凝胶颗粒内外部分渗透部分渗透部分渗透部分渗透，渗，渗，渗，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样间介于二者之间，这样间介于二者之间，这样间介于二者之间，这样分子大的组分先流出分子大的组分先流出分子大的组分先流出分子大的组分先流出，分子小分子小分子小分子小的组分后流出的组分后流出的组分后流出的组分后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分。这样样品经过凝胶层析后，各个组分。这样样品经过凝胶层析后，各个组分。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按便按便按便按分子从大到小分子从大到小分子从大到小分子从大到小的的的的顺序依次流出顺序依次流出顺序依次流出顺序依次流出，从而达到了分离，从而达到了分离，从而达到了分离，从而达到了分离的目的。的目的。的目的。的目的。图图图图3-1 3-1 3-1 3-1 凝胶层析分离原理示意图凝胶层析分离原理示意图凝胶层析分离原理示意图凝胶层析分离原理示意图 基本概念基本概念外水体积、内水体积、外水体积、内水体积、外水体积、内水体积、外水体积、内水体积、柱床体积柱床体积柱床体积柱床体积 、洗脱体积洗脱体积 外水体积（外水体积（外水体积（外水体积（V V V Vo o o o）是指凝胶柱中是指凝胶柱中是指凝胶柱中是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的积。凝胶颗粒周围空间的积。凝胶颗粒周围空间的积。凝胶颗粒周围空间的积。内水体积内水体积内水体积内水体积（V V V Vi i i i）是指凝胶颗粒中是指凝胶颗粒中是指凝胶颗粒中是指凝胶颗粒中孔穴孔穴孔穴孔穴的体积。的体积。的体积。的体积。柱床体积柱床体积柱床体积柱床体积 是（是（是（是（V V V Vt t t t）凝胶柱所能容纳的总体积。凝胶柱所能容纳的总体积。凝胶柱所能容纳的总体积。凝胶柱所能容纳的总体积。GFC的洗脱曲线的洗脱曲线洗脱体积洗脱体积（V Ve e）是指将样品中某一组分洗脱下来所是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。需洗脱液的体积。它包括自它包括自加入样品加入样品时算起，到组时算起，到组分分最大浓度出现最大浓度出现时所流出的体积。时所流出的体积。V Ve e一般是介于一般是介于V Vo o 和和V V V Vt t t t之间的。之间的。对于对于完全排阻完全排阻的大分子由于其不进入凝胶颗粒内，的大分子由于其不进入凝胶颗粒内，故其洗脱体积：故其洗脱体积：V Ve e V Vo o 对于对于完全渗透完全渗透的小分子由于它可以存在于凝胶柱整的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积内，故其洗脱体积：个体积内，故其洗脱体积：V Ve e V V V Vt t t t分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。于二者之间。洗脱体积的测定？洗脱体积的测定？F外水体积（外水体积（外水体积（外水体积（V V V Vo o o o）：可以通过测定可以通过测定完全排阻完全排阻的大分子物的大分子物质的洗脱体积来测定，一般常用质的洗脱体积来测定，一般常用蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖-2000-2000-2000-2000作作为为测定测定外水体积的物质外水体积的物质外水体积的物质外水体积的物质。F内水体积内水体积内水体积内水体积（V V V Vi i i i）：）：）：）：可以通过测定可以通过测定完全渗透完全渗透完全渗透完全渗透的小分子溶的小分子溶质质（如（如（如（如重铬酸钾重铬酸钾重铬酸钾重铬酸钾）的洗脱体积来测定的洗脱体积来测定 即即 V Ve eV Vo oV Vi i 推出推出 V Vi i V Ve e V Vo oF柱床体积（柱床体积（柱床体积（柱床体积（V V V Vt t t t）：）：）：）：1)1)1)1)可用下式计算：可用下式计算：VtVt（D/2D/2）2 2hh 2 2）根据）根据 VtVtV Vo oV Vi i V Vs s 可以得到可以得到 3 3）加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量）加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积水的体积。对某物质在凝胶柱内洗脱体积对某物质在凝胶柱内洗脱体积VeVe、V Vo o和和ViVi之间的关之间的关系可用下式表示：系可用下式表示：VeVomVi m m为每个溶质分子在流动相和固定相之间的一个特定为每个溶质分子在流动相和固定相之间的一个特定的的分配系数分配系数。m m可通过实验由可通过实验由VeVe、VoVo和和ViVi求得。求得。V V0 0 VomVi V Vt t 推出推出0m0m1 1，所以，所以GFCGFC的分离的分离精度有限。精度有限。对于对于完全排阻完全排阻完全排阻完全排阻的大分子的大分子 V Ve e V Vo o 故故 m m m m 0 0 0 0 对于对于完全渗透完全渗透完全渗透完全渗透的小分子的小分子 V Ve e V Vt t 故故 m m 1 1mVeV0Vi但实际上，约有但实际上，约有1/51/5的内水因溶剂化作用而呈水合状的内水因溶剂化作用而呈水合状态，妨碍小分子的自由扩散。故实际上态，妨碍小分子的自由扩散。故实际上VeVe小分子小分子 VoVo；当当0 0m ml l时时，意味着溶质分子只有，意味着溶质分子只有部分向凝部分向凝胶颗粒内扩散胶颗粒内扩散，m m愈大，进入凝胶颗粒内的程度愈大；愈大，进入凝胶颗粒内的程度愈大；m m时，其洗脱体积时，其洗脱体积VeVeVoVo十十。GFCGFC中溶质的分配系数中溶质的分配系数m m只是只是相对分子质量相对分子质量、分子形分子形状状、和、和凝胶结构凝胶结构的函数，与洗脱液的的函数，与洗脱液的pHpH和和离子强度离子强度等物性等物性无关无关，即在一般的层析操作条件下，即在一般的层析操作条件下，相对分相对分子质量一定的溶质的分配系数为一常数子质量一定的溶质的分配系数为一常数。GFCGFC一般采一般采用组成一定的洗脱液进行洗脱即用组成一定的洗脱液进行洗脱即恒定洗脱法恒定洗脱法。2.凝胶过滤介质凝胶过滤介质良好凝胶过滤介质的要求：良好凝胶过滤介质的要求：亲水性高、表面惰性（不存在相互作用）；亲水性高、表面惰性（不存在相互作用）；稳定性强，在较宽的稳定性强，在较宽的pHpH范围及化学试剂中保持稳定；范围及化学试剂中保持稳定；具有一定的孔径分布范围；具有一定的孔径分布范围；机械强度高，允许较高的操作压力；机械强度高，允许较高的操作压力；常用的凝胶介质常用的凝胶介质名称名称基质基质制造商制造商Sephadex G(10-200)Sephadex G(10-200)交联葡聚糖交联葡聚糖PharmaciaPharmaciaSepharose 2BSepharose 2B、4B4B、6B6B琼脂糖琼脂糖PharmaciaPharmaciaSepharose CL 4BSepharose CL 4B、6B 6B 交联琼脂糖交联琼脂糖PharmaciaPharmaciaSephacryl S Sephacryl S 系列系列聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺-葡聚糖葡聚糖PharmaciaPharmaciaSuperdex Superdex 系列系列高交联琼脂糖高交联琼脂糖-葡聚糖葡聚糖PharmaciaPharmaciaSuperose Superose 系列系列高交联琼脂糖（二次交联）高交联琼脂糖（二次交联）PharmaciaPharmaciaBio-Beads S-XBio-Beads S-X系列系列苯乙烯苯乙烯-二乙烯苯二乙烯苯BioRadBioRadBio-GelP Bio-GelP 系列系列聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺BioRadBioRadBio-GelA Bio-GelA 系列系列琼脂糖琼脂糖BioRadBioRadTSKgel SW TSKgel SW 系列系列硅胶硅胶ToyoSodaToyoSodaTSKgel Toyopearl HW TSKgel Toyopearl HW 系列系列亲水性聚乙烯醇亲水性聚乙烯醇ToyoSodaToyoSodaTSKgel PW TSKgel PW 系列系列亲水性聚乙烯亲水性聚乙烯ToyoSodaToyoSodaTSKgel CW-35 TSKgel CW-35 系列系列纤维素纤维素ToyoSodaToyoSodaCellulofineCellulofine纤维素纤维素ChissoChisso机械强度高半刚性凝胶，中压液相层析用高压液相层析用两者均具刚性结构凝胶的特性参数凝胶的特性参数排阻极限排阻极限：不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。如：相对分子质量。如：SephadexG50的排阻极限为的排阻极限为30KD。分级范围分级范围：能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分：能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。离的溶质的相对分子质量范围。SephadexG50：30KD。溶胀率溶胀率：每克干凝胶所吸收的水分的百分数。：每克干凝胶所吸收的水分的百分数。溶胀率溶胀率=100%（溶胀处理平衡后的重量）（溶胀处理平衡后的重量）/干燥重量干燥重量床体积床体积：1g干燥凝胶溶胀后所占的体积。凝胶的床干燥凝胶溶胀后所占的体积。凝胶的床体积可用于体积可用于估算估算装满一定体积的层析柱所需要的装满一定体积的层析柱所需要的干凝干凝胶量胶量。凝胶粒径凝胶粒径：多用筛目或微米表示。：多用筛目或微米表示。孔隙体积孔隙体积：层析柱中凝胶之间孔隙的体积，用：层析柱中凝胶之间孔隙的体积，用V0表表示。用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定。示。用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定。3.影响分离特性的因素影响分离特性的因素HETP影响溶质的分离度，影响影响溶质的分离度，影响HETP的因素：的因素：线速度：流动相在轴向上的流动速度。线速度：流动相在轴向上的流动速度。料液体积料液体积料液浓度料液浓度根据分离原理来说，根据分离原理来说，溶质的洗脱时间溶质的洗脱时间tR和和HETP与料与料液的浓度无关。液的浓度无关。实际操作中发现，当料实际操作中发现，当料液浓度较高液浓度较高时，洗脱曲线不对称，出现时，洗脱曲线不对称，出现吐舌吐舌和和拖尾拖尾，甚至出现，甚至出现分裂的两个峰分裂的两个峰，原因使料液和流动相的，原因使料液和流动相的粘度差粘度差引起引起的。经验表明料液和流动相的的。经验表明料液和流动相的粘度比粘度比需要需要小于小于2。排阻极限极小排阻极限很大分子扩散引起急速下降 用无因此进料时间表示料液体积相对分子质量与分配系数的关系相对分子质量与分配系数的关系m m是判断是判断分离效果分离效果的一个重要参数，同时也是的一个重要参数，同时也是测定蛋测定蛋白质分子质量白质分子质量的一个依据。的一个依据。对于某一型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，各对于某一型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，各个组分的个组分的m m与其与其分子质量的对数分子质量的对数成成线性线性关系：关系：m m b blgMr+lgMr+c c 由于由于V Ve e 和和m m也成线性关系所以同样有：也成线性关系所以同样有：V Ve e bblglgM Mr+r+cc通过将一些已知分子质量的通过将一些已知分子质量的标准蛋白质标准蛋白质在同一凝胶柱在同一凝胶柱上以上以相同条件相同条件进行进行洗脱洗脱，分别测定，分别测定V Ve e 或或m m，并根据上并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后述的线性关系绘出标准曲线，然后在相同条件下测定在相同条件下测定在相同条件下测定在相同条件下测定未知样品的未知样品的未知样品的未知样品的V Ve e 或或m m，通过标准曲线即可求出其分子质通过标准曲线即可求出其分子质量。量。凝胶粒径凝胶粒径通过通过减小粒径减小粒径，不仅可以，不仅可以降低降低HETP，还可以，还可以提高提高分离速度分离速度。的应用、特点的应用、特点生物大分子的纯化生物大分子的纯化分子量测定分子量测定脱盐及去除小分子杂质脱盐及去除小分子杂质去热源物质去热源物质 溶液的浓缩溶液的浓缩A.凝凝胶胶层层析析操操作作简简便便，所所需需设设备备简简单单。有有时时只只要要有有一一根根层层析析柱柱便便可可进进行行工工作作。分分离离介介质质凝凝胶胶完完全全不不需需要要像像离离子子交交换换剂剂那那样样复复杂杂的的再再生生过过程程便可重复使用。便可重复使用。B.B.分分离离效效果果较较好好，重重复复性性高高。最最突突出出的的是是样样品品回回收率高收率高，接近，接近100100。C.分分离离条条件件缓缓和和。凝凝胶胶骨骨架架亲亲水水，分分离离过过程程又又不不涉涉及及化化学学键键的的变变化化，所所以以对对分分离离物物的的活活性性没没有有不良影响。不良影响。D.D.应应用用广广泛泛。适适用用于于各各种种生生化化物物质质，如如肽肽类类、激激素素、蛋蛋白白质质、多多糖糖、核核酸酸的的分分离离纯纯化化、脱脱盐盐、浓浓缩缩以以及及分分析析测测定定等等。分分离离的的分分子子量量范范围围也也很很宽宽，如如SephadexSephadex G G类类为为10102 210105 5d d；SepharoseSepharose类类为为10105 510108 8d d。离子交换层析离子交换层析利用利用离子交换剂离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间的换剂之间的静电相互作用力的差别静电相互作用力的差别进行溶质分离的进行溶质分离的洗脱层析方法。洗脱层析方法。1.原理与操作原理与操作荷电溶质在离子交换剂上的分配系数可用下式：荷电溶质在离子交换剂上的分配系数可用下式：I为流动相的离子强度，为流动相的离子强度，A和和B为常数，为常数，m为离子强为离子强度无限大时溶质的分配系数度无限大时溶质的分配系数，是，是静电相互作用以为静电相互作用以为的非特异性吸附引起的溶质在离子交换剂上的分配的非特异性吸附引起的溶质在离子交换剂上的分配。蛋白质的蛋白质的分配系数对离子强度非常敏感分配系数对离子强度非常敏感，即离子强，即离子强度的微小变化，会引起分配系数的很大变化。度的微小变化，会引起分配系数的很大变化。同一离子强度下不同的蛋白质的分配系数可能相差同一离子强度下不同的蛋白质的分配系数可能相差很大很大。如果采用离子强度不变的流动相进行洗脱，。如果采用离子强度不变的流动相进行洗脱，两种蛋白质的洗脱体积相差很大，甚至分配系数大两种蛋白质的洗脱体积相差很大，甚至分配系数大的蛋白质很难得到洗脱，造成的蛋白质很难得到洗脱，造成洗脱剂的大量消耗和洗脱剂的大量消耗和洗脱时间的大幅度增加洗脱时间的大幅度增加。所以，。所以，IECIEC很少采用恒定洗很少采用恒定洗脱，多采用流动相离子强度线性增大的脱，多采用流动相离子强度线性增大的线性梯度洗线性梯度洗脱法脱法和离子强度阶段改变的和离子强度阶段改变的逐次洗脱法逐次洗脱法。线性洗脱过程中，流动相的离子强度线性增大，溶线性洗脱过程中，流动相的离子强度线性增大，溶质的分配系数连续降低，移动速度逐渐增大。线性质的分配系数连续降低，移动速度逐渐增大。线性洗脱可通过洗脱可通过改变离子强度的增大速度改变离子强度的增大速度（浓度梯度），（浓度梯度），调整溶质的洗脱体积调整溶质的洗脱体积，即溶质洗脱峰间的距离即溶质洗脱峰间的距离，改改变分离度的同时缩短洗脱时间变分离度的同时缩短洗脱时间。洗脱体积相差很大，消耗大量的洗脱液及洗脱时间 逐次洗脱过程逐次洗脱过程，流动相的，流动相的离子强度阶段性增大离子强度阶段性增大，溶，溶质质分配系数的降低分配系数的降低和和移动速度的增大移动速度的增大也是也是阶段性阶段性。如果流动相的阶跃速度很快，在每种离子强度下的如果流动相的阶跃速度很快，在每种离子强度下的洗脱时间都很短，逐次洗脱接近线性梯度洗脱，反洗脱时间都很短，逐次洗脱接近线性梯度洗脱，反之接近恒定洗脱。之接近恒定洗脱。逐次洗脱介于恒定洗脱和线性洗逐次洗脱介于恒定洗脱和线性洗脱之间。脱之间。线性洗脱法线性洗脱法优点：流动相离子强度连续增大，优点：流动相离子强度连续增大，不出现干扰峰不出现干扰峰，操作范围广。操作范围广。缺点：需要特殊缺点：需要特殊设备调配浓度梯度设备调配浓度梯度。逐次洗脱法逐次洗脱法优点：切换不同盐浓度的流动相溶液进行洗脱，优点：切换不同盐浓度的流动相溶液进行洗脱，不不许特殊设备，操作简单许特殊设备，操作简单缺点：流动相不连续变化，缺点：流动相不连续变化，容易出现干扰峰容易出现干扰峰。线性洗脱过程线性洗脱过程线性洗脱条件下，线性洗脱条件下，IEC柱内溶质区带的柱内溶质区带的后部移动速度后部移动速度高于前部高于前部，即线性洗脱具有，即线性洗脱具有区带浓缩区带浓缩作用。作用。由于由于轴向返混轴向返混和和传质阻力传质阻力的影响，溶质区带在洗脱的影响，溶质区带在洗脱过程中不短的过程中不短的分散分散。区带浓缩作用和分散作用达到一平衡时，区带浓缩作用和分散作用达到一平衡时，区带将以区带将以一定的宽度向下移动一定的宽度向下移动，即达到，即达到准稳态准稳态。影响分离度的因素影响分离度的因素当离子强度梯度当离子强度梯度I I/V一定时，一定时，分离度与柱高无关分离度与柱高无关。柱高一定时分离度随离子强度梯度的降低而增大柱高一定时分离度随离子强度梯度的降低而增大。分离度与分离度与介质粒径成反比介质粒径成反比，与，与流速的平方根成反比流速的平方根成反比。料液量对分离料液量对分离度的影响度的影响利用利用浓缩料液浓缩料液有利于在不影有利于在不影响分离度的前响分离度的前提下提高提下提高IEC柱柱的处理能力的处理能力。（蛋白）（蛋白）逐次洗脱过程逐次洗脱过程如果如果盐浓度的阶跃合理盐浓度的阶跃合理，可以，可以使目标溶质得到高度使目标溶质得到高度浓缩浓缩。不合理，盐浓度太高，会使许多溶质同时洗。不合理，盐浓度太高，会使许多溶质同时洗脱，造成分离失败。脱，造成分离失败。A吸附B完全脱附相当于梯度非常大的线性梯度浓缩，溶质高度浓缩相当于恒定洗脱，区带宽度增大。IECIEC的应用及特点的应用及特点GFCGFC主要用于生物产物的初步纯化和中后期的脱盐，主要用于生物产物的初步纯化和中后期的脱盐，IECIEC则是蛋白质、肽、核酸等生物产物的主要纯化则是蛋白质、肽、核酸等生物产物的主要纯化手段手段。料液处理量大，具有浓缩作用，可以在较高的流速料液处理量大，具有浓缩作用，可以在较高的流速下操作；下操作；应用范围广，优化操作条件可大幅度的提高分离的应用范围广，优化操作条件可大幅度的提高分离的选择性，所需柱长较短；选择性，所需柱长较短；产品回收率高；产品回收率高；商品化的离子交换剂种类多，选择余地大，价格远商品化的离子交换剂种类多，选择余地大，价格远低于亲和吸附剂。低于亲和吸附剂。IECIEC的操作变量远多用的操作变量远多用GFCGFC，影响分离特性的因素非，影响分离特性的因素非常的复杂，增加了常的复杂，增加了过程设计和规模放大过程设计和规模放大的的难度难度。小。小型层析柱的实验数据一般不能用于规模放大。型层析柱的实验数据一般不能用于规模放大。聚焦层析聚焦层析(focusingchromatography)利用两性电解质分子间利用两性电解质分子间等电点的不同等电点的不同进行分离纯化的进行分离纯化的洗脱层析方法洗脱层析方法。利用在较宽。利用在较宽pH范围内具有缓冲作用范围内具有缓冲作用的的多缓冲离子交换剂多缓冲离子交换剂为固定相，同时，利用在较宽为固定相，同时，利用在较宽pH范围内具有缓冲作用的范围内具有缓冲作用的多缓冲剂多缓冲剂做流动相。当在做流动相。当在层析柱内通入与柱内初始层析柱内通入与柱内初始pH不同的多缓冲剂时，柱不同的多缓冲剂时，柱内内pH缓慢改变，在缓慢改变，在轴向形成连续的轴向形成连续的pH梯度梯度，使料液，使料液中的溶质依据各自的等电点或者吸附，或者洗脱，逐中的溶质依据各自的等电点或者吸附，或者洗脱，逐次向下移动，彼此间得到分离，该方法称之为次向下移动，彼此间得到分离，该方法称之为聚焦层聚焦层析析。层析聚焦过程示意图层析聚焦过程示意图柱内pH为pH0用pHe的多缓存液洗脱由于溶质区带由于溶质区带后部的后部的pH总是总是低于前部低于前部，所以区带后，所以区带后部总是先于前部移动，区带部总是先于前部移动，区带受到压缩受到压缩，因此，层析聚，因此，层析聚焦有焦有浓缩溶质浓缩溶质的作用。的作用。多缓冲剂和多离子交换剂多缓冲剂和多离子交换剂多缓冲剂是多缓冲剂是两性电解质缓冲剂两性电解质缓冲剂，由相对分子质量大小，由相对分子质量大小不一的各种组分构成，每种构成成分均为不一的各种组分构成，每种构成成分均为多羧基多羧基和和多多氨基氨基化合物，存在各自的等电点。化合物，存在各自的等电点。Pollybuffer96pH96Pollybuffer74pH74PharmalytepH10.58多缓冲离子交换剂多缓冲离子交换剂可用普通的可用普通的凝胶凝胶过滤介质偶联过滤介质偶联特殊的特殊的离子交换基离子交换基制备。制备。PBE118、94是以是以Sepharose6B为载体阴离子交为载体阴离子交换剂。换剂。PBE118配配PharmalytePBE94配配Pollybuffer96、Pollybuffer74MonoP是一种弱碱性的阳离子交换剂，可与上是一种弱碱性的阳离子交换剂，可与上述三种缓冲液相配。述三种缓冲液相配。层析聚焦的应用层析聚焦的应用生化生化实验室规模实验室规模的样品制备或成分分析。的样品制备或成分分析。疏水作用层析疏水作用层析(hydrophobicchromatogra