程序性细胞凋亡和细胞衰老.ppt
第十三章第十三章 程序性细胞死亡程序性细胞死亡和细胞衰老和细胞衰老 细胞凋亡细胞凋亡(Apoptosis)细胞衰老细胞衰老 (cellular aging或或cell senescence)第一节第一节 细胞凋亡细胞凋亡(Apoptosis)细胞凋亡的概念及其生物学意义细胞凋亡的概念及其生物学意义细胞凋亡的形态学和生物化学特征细胞凋亡的形态学和生物化学特征细胞凋亡的分子调控机理细胞凋亡的分子调控机理细胞程序性死亡l细胞程序性死亡（PCD）是一种基因指导的细胞自我消亡方式。lPCD和细胞凋亡的区别在以下方面：lPCD是功能性概念，凋亡是形态学概念。lPCD的最终结果是凋亡，但凋亡并非都是程序化的。lPCD存在于胚胎发育过程中。一、动物细胞的程序性死亡l凋亡（apoptosis）l坏死（necrosis）l自噬（autophagy）（一）细胞凋亡（一）细胞凋亡概念：细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程，凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。蝌蚪尾的消失；脊椎动物的神经系统的发育；发育过程中手和足的形成过程等。细胞凋亡特点细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体；凋亡小体内有结构完整的细胞器；不引起炎症；线粒体无明显形态变化，溶酶体活性不增加；内切酶活化，DNA有控降解，凝胶电泳图呈梯状；凋亡通常是生理性变化，坏死是病理性变化。/胸腺细胞正常正常凋亡胸腺细胞正常正常凋亡细胞凋亡的生理和病理学意义l（一）生理学意义l1.生长发育：组织与器官的塑造（趾的分化）；动物变态；皮肤角质形成；l2.免疫细胞分化：克隆选择；l3.防御：清除衰老细胞、DNA损伤的细胞、和被病原体感染的细胞。（二）病理学意义l1.病原体侵染；诱导凋亡HIV抑制凋亡Poxvirusl2.细胞凋亡不足肿瘤，自身免疫疾病；l3.细胞凋亡过度神经退行性疾病（AD，帕金森症）、心肌梗塞、再生障碍性贫血、骨组织坏死。细胞凋亡的形态学特征凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布 凋亡小体的形成：核染色质断裂为大小不等的片段，与某 些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或芽状突起，逐渐形成单个的凋亡小体 凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化细胞凋亡的生化特征细胞凋亡的主要特征是形成大小为 180200bp特征性的DNA ladders 凋亡细胞组织转谷氨酰胺酶tTG （tissue Transglutaminase）积累并达 到较高水平细胞凋亡的检测l1.形态学，电镜，光镜；l2.DNA凝胶电泳ladder；l3.流式细胞计；l4.核酸内切酶活力检测；l5.免疫学方法；l6.Annexin V检测细胞膜外表面PS；l7.TUNEL技术。l8.常用检测细胞凋亡的染料：l二乙酸荧光素（FDA），绿色荧光，活细胞染色lHoechst 33342或33258，DAPI，吖啶橙（AO），半通透，凋亡和固定后的细胞荧光较强。l溴化乙啶（EB）、碘化丙啶（PI）、放线菌素D（7-AAD），不通透，正常和凋亡细胞拒染。l可用不同性质的染料对凋亡细胞进行双染色。lHuman embryo at day 4 morula containing 23 nuclei labelled with DAPI(blue),including seven TUNEL-labelled condensed nuclei(pink,arrow)that were excluded from development(Kate Hardy 1999).诱导细胞凋亡的因子物理性因子，包括射线（紫外线，射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA 和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿 瘤坏死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等（二）细胞坏死l细胞受到环境因素伤害，引起细胞死亡的现象。l形态变化的原因：酶性消化、蛋白变性。l细胞坏死初期，胞质内线粒体和内质网肿胀、崩解，结构脂滴游离、空泡化，蛋白质颗粒增多，核发生固缩或断裂。l随坏死进程，细胞质呈强嗜酸性，苏木精/伊红染色呈均一红色。l细胞膜不完整，台盼蓝染色阳性(活细胞不着色)。lDNA随机降解，细胞内容物流出，引起炎症。（三）细胞自噬l如消化酶来源于死亡细胞本身的溶酶体，则称为自溶（autolysis）；若来源于浸润坏死组织内白细胞溶酶体，则为异溶（heterolysis）。细胞凋亡的分子调控机理细胞凋亡的分子调控机理线虫()凋亡研究发现ced3,ced4基因促进 细胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制 细胞凋亡。Ced3哺乳类同源物是ICE(Interleukin-1-converting enzyme)，即Caspase1Caspase家族与凋亡Bcl-2家族、线粒体与细胞凋亡lC.elegans是研究细胞凋亡的理想材料（生命周期短，细胞数量少）。lC.elegans雄虫有1031个体细胞、约1000个生殖细胞。l神经系统由302个细胞组成，来自于407个前体细胞，105个细胞发生了PCD。l控制线虫PCD的基因有：Ced-3、Ced-4和Ced-9。Ced-3和 Ced-4诱发凋亡；Ced-9抑制Ced-3、Ced-4的作用。20022002年年1010月月7 7日英国人日英国人Sydney Sydney、美国人、美国人HorvitzHorvitz和英和英国人国人Sulston Sulston，因在，因在PCDPCD方面的研究获诺贝尔诺贝方面的研究获诺贝尔诺贝尔生理与医学奖。尔生理与医学奖。H.Robert HorvitzJohn E.Sulston Sydney BrennerCaspase家族与凋亡Caspase家族Caspase活性位点是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键，因此称为Cysteine aspartic acic specific protease，即CaspaseCaspase活化胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径Caspase活化 Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依赖于其他的Caspase在它的天冬氨酸位点裂解活化或自身活化胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径凋亡信号通路 当细胞接受凋亡信号分子(Fas,TNF等)后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接蛋白(Adaptor protein)结合，这些衔接蛋白又募集Procaspases聚集在受体部位，Procaspase相互活化并产生级联反应，使细胞凋亡下游Caspases活化后，作用底物：裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；裂解DNase结合蛋白，使DNase释放，降解DNA形成DNA Ladder;裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；导致膜脂PS重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。Bcl-2家族、线粒体与细胞凋亡Bcl-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物，能抑制细胞凋亡；与线粒体及内质网膜相结合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的结构域；Bcl-2家族成员的基因中，常常含有三个保守的Bcl-2同源区，即BH1，BH2和BH3Bcl-2、线粒体与细胞凋亡哺乳动物细胞中发现的Apaf2即是CytCBcl-2、线粒体与细胞凋亡当Caspase8活化后，它一方面作用于Procaspase3，另 一方面使Bid裂解成2个片段，其中含BH3结构域的C-端 片段被运送到线粒体，与Bcl-2/Bax的BH3结构域形成 复合物，导致细胞色素C释放。CytC与胞质中Ced4同源 物Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子apoptosis protease activating factor)结合并活化Apaf-1，活化的Apaf-1再活 化Procaspase9，最后引起细胞凋亡 a 正常T细胞杂交瘤细胞 b 凋亡细胞(扫描电镜)c 凋亡细胞(透射电镜)caspase 超家族成员及其相应底物BCL-2家族成员家族成员第二节第二节 细胞衰老细胞衰老(cellular aging或或cell senescence)Hayflick界限界限(Hayflick Limitation）细胞在体内条件下的衰老细胞在体内条件下的衰老衰老细胞结构的变化衰老细胞结构的变化细胞衰老的分子机理细胞衰老的分子机理一、一、Hayflick界限界限(Hayflick Limitation）概念：关于细胞增殖能力和寿命是有限的观点。细胞，至少是培养的二倍体细胞，不是不死的，而是有一定的 寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就 是 Hayflick界限 癌细胞或培养的细胞系是不正常细胞，其染色体数目或形态 已经不同于原先的细胞 细胞的增殖能力与供体年龄有关 物种寿命与培养细胞寿命之间存在着一定的关系二倍体细胞的衰老是由细胞本身决定的 决定细胞衰老的因素在细胞内部，而不是外部的环境 是细胞核而不是细胞质决定了细胞衰老细胞来源人胚肺成纤维细胞中年人成纤维细胞老年人成纤维细胞可增殖代数 40-60 20 2-4不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数二、细胞在体内条件下的衰老二、细胞在体内条件下的衰老在机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在 个体发育的早期也会发生;正常情况下终生保持分裂的细胞，其分裂能力是否随 着有机体年龄的增高而下降？它们 会不会衰老？衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要 是G1期明显延长;衰老个体内的环境因素影响了细胞的增殖和衰老;骨髓干细胞移植实验说明随着年龄的增加，干细胞 增殖速度也趋缓慢.三、衰老细胞结构的变化三、衰老细胞结构的变化 细胞核的变化 内质网的变化:衰老动物内质网成分弥散性地分散于核 周胞质中，粗面内质网的总量似乎是减少了 线粒体的变化:通常，细胞中线粒体的数量随龄减少，而其体积则随龄增大 致密体的生成 膜系统的变化 细胞核的变化体外培养的二倍体细胞，细胞核 随着细胞分裂次数的增加不断增大细胞核的核膜内折（invagination）、染色质固缩化 膜系统的变化衰老的细胞，其膜流动性降低、韧性减小衰老细胞间间隙连接;细胞膜内（P面）颗粒的分布也发生变化四、细胞衰老的分子机理四、细胞衰老的分子机理氧氧化化性性损损伤伤学学说说：代谢过程中产生的活性氧基团或分子（ROS-O2-，OH-，H2O2），引发的氧化性损伤的积累，最终导致衰老。端粒与衰老端粒与衰老：发现端粒长度确实与衰老有着密切的关系，提出细胞衰老的 “有丝分裂钟”学说（Harley,1990）rDNArDNA与衰老与衰老:酵母染色体外rDNA 环（ERC）的积累，导致细胞衰老。沉沉默默信信息息调调节节蛋蛋白白复复合合物物（Sir Sir complexcomplex）与与衰衰老老：Sir complex 存在于异染色质区，其作用在于阻断所在位点DNA转录。SGS1SGS1基因和基因和WRNWRN基因与衰老：基因与衰老：SGS1基因和WRN基因同源,编码解旋酶;酵母sgs1突变体寿命明显短于野生型（平均代代）;wrn突变 引发早老症.发育程序与衰老发育程序与衰老:线粒体线粒体DNADNA与衰老与衰老:Sen-DNA(80年代);mtDNA突变积累与细胞衰老有关.坏死细胞凋亡细胞细胞色素细胞色素c诱导的凋亡细胞诱导的凋亡细胞DNA电泳图电泳图1细胞色素c诱导0 h2细胞色素c诱导1 h3细胞色素c诱导2 h4细胞色素c诱导3 h5细胞色素c诱导4 h6阴性对照7Marker （自赵允、翟中和）
