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    分子生物学:基因突变2 研究生课件知识分享.ppt

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    分子生物学:基因突变2 研究生课件知识分享.ppt

    分子生物学:基因突变2 研究生课件Section 1 Basic Concept of Gene Mutation1.Type of Gene Mutation主要根据主要根据DNA一级结构改变情况分类。一级结构改变情况分类。可分为可分为单点突变单点突变(single point mutation)和和多点突变多点突变(multiple point mutation)。)。点突变的形式包括点突变的形式包括转换转换(transition)、)、颠颠换换(transversion)、)、插入插入(insertion)、)、缺失缺失(deletion)等。)等。1.1 Point Mutation基因组基因组DNA中插入了其他的中插入了其他的DNA小片段,导致小片段,导致读码框改变或基因失活。读码框改变或基因失活。1.2 Insertion Mutation of DNA Fragment基因组基因组DNA中丢失了小片段中丢失了小片段DNA,导致读码框,导致读码框改变或基因失活。改变或基因失活。1.3 Deletion Mutation of DNA FragmentDNA碱碱基基改改变变后后,形形成成相相应应的的简简并并密密码码,其其编编码码的的多多肽肽链链氨氨基基酸酸序序列列不不发发生生改改变变,称称为为同同义义突变突变。2.Results of Gene Mutation2.1 Synonymous MutationDNA碱基序列改变导致其编码的多肽链氨基酸序碱基序列改变导致其编码的多肽链氨基酸序列改变,称为列改变,称为错义突变错义突变。错义突变后的编码产物仍然保留部分生物学活性,错义突变后的编码产物仍然保留部分生物学活性,则称为则称为渗漏突变渗漏突变(leaky mutation)。)。错义突变后的编码产物如能全部保留原有生物学错义突变后的编码产物如能全部保留原有生物学活性,则称为活性,则称为中性突变中性突变(neutral mutation)。)。2.2 Missence MutationDNA碱碱基基序序列列改改变变而而产产生生终终止止密密码码,导导致致多多肽肽链非正常终止称为链非正常终止称为无义突变无义突变。2.3 Nonsence MutationDNA碱碱基基序序列列改改变变导导致致读读码码框框的的位位移移,使使翻翻译译的的蛋蛋白白质质成成为为无无生生物物学学活活性性的的分分子子称称为为移移码码突突变变。2.4 Frame-shift Mutation基因突变后,再经二次突变,其生物学功能完基因突变后,再经二次突变,其生物学功能完全恢复,称为全恢复,称为回复突变回复突变(reverse mutation)。)。基因经第二次突变后,产生的突变效应只是对基因经第二次突变后,产生的突变效应只是对第一次突变的补偿,则称为第一次突变的补偿,则称为校正抑制突变校正抑制突变(suppression mutation)。)。3.Reverse of Mutation EffectsSuppression Mutation of arc Gene from Phage P22arc(Am)mutant in a sup0 strain Wild-type arc+in a sup0 strain arc(Am)mutant in a supD strain with a suppressor mutation in tRNAser 基因组基因组DNA分子中各部位发生的突变的机率不分子中各部位发生的突变的机率不同,突变频率明显高于其他部位的突变区被称同,突变频率明显高于其他部位的突变区被称为为突变热点突变热点。许多突变热点源于甲基化修饰的碱基,特别是许多突变热点源于甲基化修饰的碱基,特别是发生于发生于CpG岛。岛。4.Mutation Hotspots对于二倍体生物,决定其表型的某种生物活性对于二倍体生物,决定其表型的某种生物活性物质的合成仅由一对等位基因控制。物质的合成仅由一对等位基因控制。5.Relationship of Alleles Mutation with Phenotype5.1 Single Alleles野生型纯合子野生型纯合子 野生表型野生表型突变型纯合子突变型纯合子 突变表型突变表型野生型野生型-突变型杂合子突变型杂合子突变表型突变表型野生表型野生表型在在一一个个基基因因座座位位上上存存在在两两个个及及以以上上的的等等位位基基因因,每每一一对对等等位位基基因因均均有有一一定定程程度度的的变变异异;但但这这种种变变异异对对其其功功能能没没有有影影响响,只只是是产产生生不不同同的的表表型型,如决定某种颜色的等位基因。如决定某种颜色的等位基因。5.2 Multiple Alleles在某一种群基因组的座位上,存在多种不同的在某一种群基因组的座位上,存在多种不同的等位基因,从而决定不同的遗传表型,称为等等位基因,从而决定不同的遗传表型,称为等位基因的遗传多态性,如决定位基因的遗传多态性,如决定ABO血型的等位血型的等位基因。基因。5.3 Alleles Polymorphism6.Dynamic Mutation串联的三核苷酸重复拷贝数可随世代递增而出串联的三核苷酸重复拷贝数可随世代递增而出现累加效应的突变,称为现累加效应的突变,称为动态突变动态突变。在多种神经变性疾病中都存在三核苷酸的不稳在多种神经变性疾病中都存在三核苷酸的不稳定扩展,其中以定扩展,其中以CAG重复扩展导致的疾病较多。重复扩展导致的疾病较多。CAG重复扩展序列在各自的编码基因中产生一重复扩展序列在各自的编码基因中产生一段多聚谷氨酰胺链。段多聚谷氨酰胺链。Repeat Expansion MutationRepeat Expansion Mutation of Dystrophia Myotonica Protein Kinase Gene强直性肌营养不良强直性肌营养不良Section 3 Results of Gene Mutation1.Biological Evolution基因突变是生物进化的源泉。基因突变是生物进化的源泉。通过基因突变,可对现存基因进行改造,也可通过基因突变,可对现存基因进行改造,也可产生新的基因。产生新的基因。2.Genetic Diseases对对于于高高等等生生物物来来说说,有有利利的的基基因因突突变变是是很很少少的的。因因此此,基基因因突突变变的的后后果果常常常常是是引引起起人人类类的的遗遗传传性疾病。性疾病。目目前前已已知知人人类类有有8000多多种种疾疾病病与与基基因因突突变变有有关关,包括镰刀状红细胞贫血、苯丙酮酸尿症等。包括镰刀状红细胞贫血、苯丙酮酸尿症等。3.Cell Canceration与癌症发生直接相关的基因包括癌基因和抑癌与癌症发生直接相关的基因包括癌基因和抑癌基因,各种物理的、化学的或生物的诱变剂可基因,各种物理的、化学的或生物的诱变剂可使这些基因发生突变,从而引起细胞癌变。使这些基因发生突变,从而引起细胞癌变。Section 4 Site-directed Mutagenesis对已克隆基因或对已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱片段中的任何一个特定碱基,在体外条件下人工诱发碱基的取代、插入基,在体外条件下人工诱发碱基的取代、插入或缺失变化的过程称为基因的或缺失变化的过程称为基因的定点诱变技术。定点诱变技术。定点诱变技术定点诱变技术是进行基因工程和蛋白质工程的是进行基因工程和蛋白质工程的重要手段。重要手段。1.Site-directed Mutagenesis Directed by Oligonucleotide 利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷酸利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的相应序列,从而达片段,取代野生型基因中的相应序列,从而达到定点突变的目的,称为到定点突变的目的,称为盒式诱变盒式诱变。实施盒式诱变时,要求靶实施盒式诱变时,要求靶DNA插入点两侧有合插入点两侧有合适的限制酶单一切点。适的限制酶单一切点。1.1 Cassette MutagenesisProcess of Cassette MutagenesisAn Example of Cassette Mutagenesis1.2 Doped Cassette Mutagenesis粘性盒式诱变粘性盒式诱变通常同时设计并合成两套带突变通常同时设计并合成两套带突变碱基的寡核苷酸单链,然后在碱基的寡核苷酸单链,然后在DNA聚合酶的催聚合酶的催化下进行重叠延伸,用限制酶切断后,可获得化下进行重叠延伸,用限制酶切断后,可获得两套双链的寡核苷酸片段,即可用于取代原有两套双链的寡核苷酸片段,即可用于取代原有的目的基因片段。的目的基因片段。此法可提高基因诱变的效率。此法可提高基因诱变的效率。Doped Cassette Mutagenesis利用一段含有突变序列的寡核苷酸片段作为利用一段含有突变序列的寡核苷酸片段作为引物,经引物,经DNA复制过程合成靶复制过程合成靶DNA片段,使片段,使其子代链发生突变,称为其子代链发生突变,称为引物诱变引物诱变。1.3 Primer Mutagenesis引物诱变的基本操作步骤:引物诱变的基本操作步骤:获得单链目的基因;获得单链目的基因;人工合成带突变序列的引物;人工合成带突变序列的引物;制备异源双链制备异源双链DNA;转染宿主细胞;转染宿主细胞;筛选重组体;筛选重组体;突变基因的鉴定和回收。突变基因的鉴定和回收。Process of Primer Mediated Mutagenesis1.4 QuikChange Primer Mutagenesis这是由这是由Stratagene公司开发的一种引物定点公司开发的一种引物定点诱变法,该法的操作步骤如下:诱变法,该法的操作步骤如下:将带目的基因的重组体在将带目的基因的重组体在dam+菌株中扩增,菌株中扩增,使使DNA序列被序列被dam甲基化酶所修饰;甲基化酶所修饰;使用带突变碱基的寡核苷酸引物,在较高使用带突变碱基的寡核苷酸引物,在较高温度下复制子代链,形成双链突变体;温度下复制子代链,形成双链突变体;用限制酶用限制酶Dpn将带甲基化标记的亲代双将带甲基化标记的亲代双链水解;链水解;将突变体转化宿主细胞。将突变体转化宿主细胞。Process of QuikChange Primer Mutagenesis1.5 The Kunkel Mutagenesis Method这是这是1985年由年由Kunkel等人建立的一种寡核苷等人建立的一种寡核苷酸引物诱变法,该法的操作步骤如下:酸引物诱变法,该法的操作步骤如下:将复制型的将复制型的M13噬菌体转染到噬菌体转染到脱氧尿苷三脱氧尿苷三磷酸酶磷酸酶和和尿嘧啶脱糖苷酶尿嘧啶脱糖苷酶双缺陷的双缺陷的E.coli(dut-,ung-)菌株中生长,使)菌株中生长,使U取代取代T掺入到掺入到DNA链中(一般每个重组体链中(一般每个重组体2030个);个);以此种带以此种带U的的DNA链为模板,用带突变碱链为模板,用带突变碱基的寡核苷酸引物进行复制,产生异源双基的寡核苷酸引物进行复制,产生异源双链;链;将此异源双链转化到将此异源双链转化到ung+(尿嘧啶脱糖苷(尿嘧啶脱糖苷酶阳性)菌株中生长,含酶阳性)菌株中生长,含U的模板链被破的模板链被破坏,从而使子代坏,从而使子代DNA链大部分(链大部分(80%)含突变碱基序列。含突变碱基序列。Process of The Kunkel Mutagenesis1.6 Primer Mutagenesis with Restriction Enzyme Site Elimination限制酶位点消除引物诱变技术限制酶位点消除引物诱变技术是一种利用某些是一种利用某些限制酶不能切割由硫代磷酸核苷酸衍生物取代限制酶不能切割由硫代磷酸核苷酸衍生物取代正常碱基所形成的正常碱基所形成的DNA片段的特性,去除不含片段的特性,去除不含突变碱基的亲代模板链,以提高定点突变效率突变碱基的亲代模板链,以提高定点突变效率的技术方法。的技术方法。限制酶位点消除法的操作步骤是:限制酶位点消除法的操作步骤是:将带突变碱基的寡核苷酸引物与重组体单链将带突变碱基的寡核苷酸引物与重组体单链模板退火后,加入硫代磷酸核苷酸衍生物进模板退火后,加入硫代磷酸核苷酸衍生物进行复制,产生具有行复制,产生具有硫代磷酸核苷酸硫代磷酸核苷酸的异源双的异源双链链DNA;用特定的限制酶在此异源双链用特定的限制酶在此异源双链DNA上作切口,上作切口,此时亲代模板链由于无硫代磷酸核苷酸而被此时亲代模板链由于无硫代磷酸核苷酸而被切开,而新合成的子代链则无法切割。切开,而新合成的子代链则无法切割。使用核酸外切酶将亲代模板链全部水解去使用核酸外切酶将亲代模板链全部水解去除,然后再以含除,然后再以含硫代磷酸核苷酸硫代磷酸核苷酸的子代单的子代单链为模板,经二次复制合成双链。链为模板,经二次复制合成双链。Primer Mutagenesis with RE-Site Elimination2.Site-directed Mutagenesis by PCR将所使用的引物之一进行定点碱基突变后,作将所使用的引物之一进行定点碱基突变后,作第一轮第一轮PCR扩增。扩增。将第一轮扩增产物作为第二轮将第一轮扩增产物作为第二轮PCR扩增的引物扩增的引物来使用,从而使第二轮扩增的产物带突变的碱来使用,从而使第二轮扩增的产物带突变的碱基。基。2.1.1 Megaprimer Extension PCR Mutagenesis2.1 Base Substitution MutagenesisMegaprimer Extension PCR Mutagenesis2.1.2 Overlap Extension PCR Mutagenesis使用带突变碱基的互补引物对两段目的基因序使用带突变碱基的互补引物对两段目的基因序列分别进行第一轮列分别进行第一轮PCR扩增;扩增;将扩增产物进行重叠退火延伸,获得带突变碱将扩增产物进行重叠退火延伸,获得带突变碱基的完整序列;基的完整序列;使用该完整序列的两端引物进行第二轮使用该完整序列的两端引物进行第二轮PCR扩扩增。增。Overlap Extension PCR Mutagenesis2.2 Deletion PCR Mutagenesis用于用于PCR扩增的引物中存在人为的扩增的引物中存在人为的DNA片段的片段的缺失,这样就会在缺失,这样就会在PCR扩增后的产物中引入此扩增后的产物中引入此缺失。缺失。此法适用于在扩增此法适用于在扩增DNA序列的末端制造缺失序序列的末端制造缺失序列的情况。列的情况。2.2.1 Deletion Mutagenesis Using Mismatch PrimerDeletion Mutagenesis Using Mismatch Primer2.2.2 Deletion Mutagenesis by PCR Fusion使用两套引物分别扩增欲缺失片段两侧的序列使用两套引物分别扩增欲缺失片段两侧的序列(此两套引物的(此两套引物的5-端序列互补);端序列互补);利用两套扩增产物利用两套扩增产物5-端的互补序列进行退火重端的互补序列进行退火重叠并进行第二轮叠并进行第二轮PCR延伸,获得完整的突变体。延伸,获得完整的突变体。Deletion Mutagenesis by PCR Fusion2.2.3 Deletion Mutagenesis by Inverted PCR将带目的基因的将带目的基因的DNA重组体作为模板进行重组体作为模板进行PCR扩增,所设计的一对引物与目的基因的两侧序扩增,所设计的一对引物与目的基因的两侧序列互补(不包括需缺失的序列)并向载体列互补(不包括需缺失的序列)并向载体DNA方向进行扩增;方向进行扩增;扩增后的线性产物依靠两侧的互补序列重新退扩增后的线性产物依靠两侧的互补序列重新退火并连接成环状的双链火并连接成环状的双链DNA。Deletion Mutagenesis by Inverted PCR2.3 Insertion PCR Mutagenesis使使用用5-端端带带有有与与目目的的基基因因互互补补的的一一对对引引物物来来对对欲插入的欲插入的DNA片段进行片段进行PCR扩增;扩增;将将扩扩增增产产物物与与单单链链的的目目的的基基因因重重组组体体进进行行退退火火、延伸并连接,生成异源双链的重组体;延伸并连接,生成异源双链的重组体;转转化化宿宿主主细细胞胞以以获获得得带带有有新新插插入入序序列列的的双双链链重重组体。组体。2.3.1 Insertion Mutagenesis by PCR Recombination Insertion Mutagenesis by PCR Recombination 3.3.2 Insertion Mutagenesis by PCR Overlap Extension 设计并合成两套用于设计并合成两套用于PCR扩增的引物,分别用扩增的引物,分别用于目的基因两侧半序列的扩增,但在这两套引于目的基因两侧半序列的扩增,但在这两套引物的物的5-端均添加了欲插入的互补序列;端均添加了欲插入的互补序列;经经PCR扩增后的产物,通过此互补序列进行重扩增后的产物,通过此互补序列进行重叠延伸,生成完整的双链叠延伸,生成完整的双链DNA,即可将新的序,即可将新的序列引入目的基因中。列引入目的基因中。Insertion Mutagenesis by PCR Overlap Extension2.4 Error Prone(Sloppy)PCR Mutagenesis错误倾向错误倾向PCR诱变诱变是是通过增加通过增加Mg2+和和Taq DNA聚合酶的浓度,聚合酶的浓度,使使PCR扩增过程中复扩增过程中复制错配率增加而随机制错配率增加而随机产生碱基突变。产生碱基突变。4.Application of Site-directed Mutagenesis研究基因的结构与功能之间的关系;研究基因的结构与功能之间的关系;研究研究DNA-蛋白质,蛋白质蛋白质,蛋白质-蛋白质的相互作蛋白质的相互作用关系;用关系;蛋白质工程。蛋白质工程。Chapter 13 Tumor-associated Genes肿瘤细胞是一种不受体内生长调控系统的控制肿瘤细胞是一种不受体内生长调控系统的控制而自主生长增殖,并可发生侵袭和转移的恶性而自主生长增殖,并可发生侵袭和转移的恶性细胞。细胞。目前已知,肿瘤的发生、发展与目前已知,肿瘤的发生、发展与癌基因(癌基因(on-cogene)和和抑癌基因(抑癌基因(tumor suppressor gene)的结构和功能改变密切相关。的结构和功能改变密切相关。Section 1 Oncogene and Proto-oncogene1.Discovery and Concept of Oncogene1911年年 Reyton Rous 将将鸡鸡肉肉瘤瘤的的无无细细胞胞滤滤液液注注射射给给鸡鸡后后,可可诱诱导导发发生生肉肉瘤瘤,说说明明无无细细胞胞滤滤液液中中的的感感染染颗颗粒粒是是引引起起 Rous鸡鸡肉肉瘤瘤的的原原因因,这种感染性颗粒后来被证实是逆转录病毒。这种感染性颗粒后来被证实是逆转录病毒。追追踪踪研研究究逆逆转转录录病病毒毒致致癌癌的的线线索索,Bishop等等人于人于1980年提出了年提出了癌基因假说癌基因假说。根根据据这这一一假假说说,引引起起Rous鸡鸡肉肉瘤瘤等等的的逆逆转转录录病病毒毒的的基基因因组组中中存存在在有有致致癌癌基基因因(即即病病毒毒癌癌基基因,因,v-onc)。)。存存在在于于正正常常细细胞胞中中与与病病毒毒癌癌基基因因具具有有同同源源顺顺序序的基因则被称为的基因则被称为细胞癌基因(细胞癌基因(c-onc)。c-onc在在正正常常细细胞胞中中一一般般以以非非激激活活形形式式存存在在,参参与与细细胞胞的的生生长长、分分化化与与凋凋亡亡的的调调控控,故故又又称称为为原癌基因(原癌基因(proto-oncogene)。因因此此,癌癌基基因因(oncogene)就就是是存存在在于于正正常常细细胞胞中中,能能够够编编码码生生长长因因子子、生生长长因因子子受受体体、细细胞胞内内信信息息分分子子及及转转录录因因子子的的基基因因,即即编编码码关关键性调控蛋白的正常细胞基因。键性调控蛋白的正常细胞基因。2.Classification and Function of Oncogene目前发现的癌基因已超过目前发现的癌基因已超过100种,主要根据癌基因种,主要根据癌基因表达产物的结构、功能和亚细胞定位进行分类:表达产物的结构、功能和亚细胞定位进行分类:生长因子类;生长因子类;生长因子受体类;生长因子受体类;酪氨酸蛋白激酶类;酪氨酸蛋白激酶类;丝氨酸苏氨酸蛋白激酶类;丝氨酸苏氨酸蛋白激酶类;GTP结合蛋白(结合蛋白(G蛋白)类;蛋白)类;核内转录因子类。核内转录因子类。2.1 The Class Related with Growth FactorPDGF-related Oncogenesv-sis和和c-sis癌基因的编码产物癌基因的编码产物p28sis,为,为分泌型蛋白质,由两条相同的多肽链组成,分泌型蛋白质,由两条相同的多肽链组成,与与PDGF的的 链同源,在功能上与链同源,在功能上与PDGF有有相同的效应。相同的效应。EGF-related OncogenesTGF-A癌基因编码分泌型转化因子(癌基因编码分泌型转化因子(TGF-),与,与EGF属同一家族,其作用的受体属同一家族,其作用的受体为癌基因为癌基因erbB编码的蛋白质。编码的蛋白质。FGF Family-related Oncogenes包括包括c-int-2、c-hst-1、FGF-5、FGF-6等等癌基因,其编码产物与癌基因,其编码产物与FGF同源。同源。EGFR-related Oncogenes包包括括c-erbB-1、c-erbB-2(neu)等等癌癌基基因因,其其编编码码产产物物与与EGF受受体体同同源源,但但有有结结构构上上的的改改变变,如如丢丢失失了了受受体体N-端端的的配配体体结结合合结结构构域域,使使受受体体蛋蛋白白无无需需配配体体的的刺刺激激即即具有持续的活性。具有持续的活性。2.2 The Class Related with Growth Factor ReceptorNGFR-related Oncogenesc-trk癌基因编码产物与癌基因编码产物与NGF受体同源,其受体同源,其膜外区被其他基因的编码序列所替代后产膜外区被其他基因的编码序列所替代后产生转化活性。生转化活性。CSFR-related Oncogenesc-fms癌基因编码产物与集落刺激因子受癌基因编码产物与集落刺激因子受体(体(CSF-1R)同源。)同源。Molecular Structure of Growth Factor Receptor Related with Oncoproteins此类癌基因的编码产物为具有酪氨酸蛋白激酶此类癌基因的编码产物为具有酪氨酸蛋白激酶(TPK)活性的细胞生长信号转导蛋白,通常)活性的细胞生长信号转导蛋白,通常存在于胞浆或细胞核中。存在于胞浆或细胞核中。2.3 The Class Related with Tyrosine Protein KinaseSrc Family Oncogens包括包括c-src、c-yes、c-fgr、c-fyn等癌基等癌基因,其编码产物具有因,其编码产物具有TPK活性,一般借助活性,一般借助于于N-端的豆蔻酸而挂于细胞质膜上,可被端的豆蔻酸而挂于细胞质膜上,可被生长因子受体或细胞因子受体激活。生长因子受体或细胞因子受体激活。Inhibition of Phosphorylated Tyr527 for src Kinase Activityv-src is Missing a C-terminal Regulatory DomainAbl Family Oncogenes包括包括c-abl、c-fes等癌基因,也具有等癌基因,也具有TPK活性,但游离存在于细胞核内,传递生长活性,但游离存在于细胞核内,传递生长刺激信号。刺激信号。癌基因的编码产物具有癌基因的编码产物具有Ser/Thr蛋白激酶活性,蛋白激酶活性,并在生长信号传递过程中起作用。并在生长信号传递过程中起作用。Raf Family Oncogenes包括包括c-Raf-1、A-Raf、B-Raf、c-mos等癌基因,在等癌基因,在MAPK级联信号转导途径级联信号转导途径中起作用。中起作用。2.4 The Class Related with Ser/Thr Protein KinasePKC Family Oncogenes编码编码12种不同的同工酶,可经磷酸化修饰种不同的同工酶,可经磷酸化修饰而激活而激活c-Raf-1,从而传递生长刺激信号。,从而传递生长刺激信号。此类癌基因主要是此类癌基因主要是ras家族癌基因,包括家族癌基因,包括H-ras-1/2、K-ras-1/2、N-ras等。等。此类癌基因编码小分子此类癌基因编码小分子G蛋白,具有蛋白,具有GTPase活性。其活性受到活性。其活性受到鸟苷酸交换因子(鸟苷酸交换因子(GEF)的的正调控和正调控和GTP酶激活蛋白(酶激活蛋白(GAP)的负调控。的负调控。2.5 The Class Related with GTP Binding Protein小分子小分子G蛋白,如蛋白,如Ras激活后可将生长刺激信激活后可将生长刺激信号传递给号传递给c-Raf-1。如癌基因发生突变而使如癌基因发生突变而使G蛋白的蛋白的GTPase活性活性降低,则可导致该蛋白持续激活。降低,则可导致该蛋白持续激活。此此类类癌癌基基因因的的编编码码产产物物位位于于细细胞胞核核内内,具具有有转转录因子的结构与功能,参与细胞增殖的调控。录因子的结构与功能,参与细胞增殖的调控。2.6 The Class Related with Nuclear Transcription FactorMyc Family Oncogenes包包括括c-myc、N-myc、L-myc等等癌癌基基因因,其其编编码码产产物物为为转转录录因因子子,形形成成myc-max异异源二聚体时具有激活基因表达的功能。源二聚体时具有激活基因表达的功能。Fos and Jun Oncogenes编编码码产产物物为为转转录录激激活活因因子子-1(AP-1)的的两两个个亚亚基基,二二者者结结合合形形成成异异二二聚聚体体后后具具有有激活基因转录的功能。激活基因转录的功能。ErbA Oncogene编码产物为甲状腺激素受体。当该受体结编码产物为甲状腺激素受体。当该受体结合激素结构域缺失后,受体即具有持续激合激素结构域缺失后,受体即具有持续激活基因表达的作用。活基因表达的作用。其他还包括其他还包括myb、ets、rel、evi、spi等癌基等癌基因。因。3.Mechanisms of Proto-oncogene Activation即原癌基因的结构发生改变,从而影响其功能即原癌基因的结构发生改变,从而影响其功能或生理活性,常见的有或生理活性,常见的有点突变点突变、缺失突变缺失突变和和插插入突变入突变等。等。3.1 Proto-oncogene Mutation3.1.1 Point Mutation点突变常见于点突变常见于ras癌基因,点突变主要发生在癌基因,点突变主要发生在12、13、61或或63位氨基酸残基处。位氨基酸残基处。发生点突变后的发生点突变后的Ras蛋白与蛋白与GTPase激活蛋白激活蛋白(GAP)的亲和力降低,从而使其的亲和力降低,从而使其GTPase活活性降低而处于持续激活状态(性降低而处于持续激活状态(Ras-GTP)。)。缺失突变的典型例子是缺失突变的典型例子是c-erbB-1原癌基因和原癌基因和c-erbA原癌基因。原癌基因。c-erbB-1原癌基因的编码产物与原癌基因的编码产物与EGFR同源,同源,其细胞外配体结合区发生缺失突变后,使受体其细胞外配体结合区发生缺失突变后,使受体处于持续激活状态。处于持续激活状态。3.1.2 Deletion Mutationc-erbA原癌基因的编码产物与甲状腺激素受体原癌基因的编码产物与甲状腺激素受体同源,其配体结合区发生缺失突变后,受体的同源,其配体结合区发生缺失突变后,受体的转录活性和转录活性和DNA结合活性失去控制,从而持续结合活性失去控制,从而持续刺激基因表达。刺激基因表达。此此外外,在在逆逆转转录录病病毒毒所所携携带带的的病病毒毒癌癌基基因因中中,也可见到因原癌基因缺失突变而激活的例子。也可见到因原癌基因缺失突变而激活的例子。如如v-src病病毒毒癌癌基基因因,是是逆逆转转录录病病毒毒在在长长期期进进化化过过程程中中,将将宿宿主主细细胞胞中中的的c-src原原癌癌基基因因转转导导并并整整合合到到其其基基因因组组中中,并并使使其其C-端端发发生生缺缺失失突突变变而而激激活活为为病病毒毒癌癌基基因因,其其编编码码产产物物具具有有持持续续TPK活性。活性。由于顺式作用元件,如启动子、增强子等插入由于顺式作用元件,如启动子、增强子等插入到原癌基因上游或附近而导致其激活并异常表到原癌基因上游或附近而导致其激活并异常表达;或由于其他基因片段的插入产生了新的融达;或由于其他基因片段的插入产生了新的融合基因,使其编码产物的生理功能发生异常改合基因,使其编码产物的生理功能发生异常改变而导致细胞转化。变而导致细胞转化。3.1.3 Insertion Mutation逆转录病毒逆转录病毒的强启动子或强增强子序列常常插的强启动子或强增强子序列常常插入到某些原癌基因上游或附近,从而使该基因入到某些原癌基因上游或附近,从而使该基因异常表达而被激活。异常表达而被激活。常见的有常见的有c-myc、c-sis、c-erbB、c-ras、c-myb等原癌基因。等原癌基因。Insertion Activation of c-myc Proto-oncogene染染色色体体的的重重排排常常常常也也会会造造成成原原癌癌基基因因易易位位到到其其他他基基因因的的强强启启动动子子下下游游或或强强增增强强子子附附近近而而被被激激活。活。在在人人类类巴巴基基特特淋淋巴巴瘤瘤的的细细胞胞系系中中,发发现现带带c-myc原原癌癌基基因因的的第第8号号染染色色体体长长臂臂远远端端片片段段易易位位至至第第2,22和和14号号染染色色体体的的一一定定部部位位,并并位位于于免免疫疫球球蛋蛋白白轻轻链链或或重重链链基基因因强强启启动动子子的的下下游游而被激活。而被激活。除此之外,染色体重排也会使原癌基因易位并除此之外,染色体重排也会使原癌基因易位并插入到其他基因中,形成新的插入到其他基因中,形成新的融合基因融合基因,从而,从而引起该原癌基因表达的融合蛋白产物的功能改引起该原癌基因表达的融合蛋白产物的功能改变而被激活。变而被激活。在慢性粒细胞性白血病细胞中,常常可见到的在慢性粒细胞性白血病细胞中,常常可见到的Ph1染色体,就是由于染色体,就是由于9号染色体与号染色体与22号染色体号染色体重排所致。重排后,重排所致。重排后,c-abl原癌基因与原癌基因与bcr基因基因融合而被激活,其编码的融合而被激活,其编码的abl-bcr融合蛋白具有融合蛋白具有持续的持续的TPK活性。活性。Ph1 Chromosome in CML Cells3.2 Proto-oncogene Amplification基因扩增引起原癌基因基因扩增引起原癌基因拷贝数目增加,导致染拷贝数目增加,导致染色体结构异常,常形成色体结构异常,常形成双微染色体(双微染色体(DM)或染)或染色体均染区(色体均染区(HSR),),其机制不明。其机制不明。DM and HSRB.homogeneous staining region(HSR)A.double minute chromosome(DM)基因扩增常常导致原癌基因表达增强而被激活,基因扩增常常导致原癌基因表达增强而被激活,常见于常见于myc家族原癌基因。家族原癌基因。3.3 Alternation of Proto-oncogene Methylation在在肿肿瘤瘤细细胞胞中中可可发发现现原原癌癌基基因因的的甲甲基基化化修修饰饰改改变变,表表现现为为原原癌癌基基因因的的低低甲甲基基化化或或去去甲甲基基化化而而被激活。被激活。如如在在胃胃癌癌细细胞胞中中发发现现了了c-Ha-ras癌癌基基因因的的低低甲甲基基化化修修饰饰,而而低低甲甲基基化化可可导导致致c-Ha-ras癌癌基基因因的过度表达。的过度表达。Section 2 Tumor Suppressor Gene1.Discovery and Concept of Tumor Suppressor Gene20世纪世纪70年代初,在研究体细胞杂交时发现:年代初,在研究体细胞杂交时发现:肿瘤细胞与正常细胞进行融合,结果产生正常肿瘤细胞与正常细胞进行融合,结果产生正常的杂交细胞。的杂交细胞。这种现象表明,在正常细胞中含有抑制肿瘤生这种现象表明,在正常细胞中含有抑制肿瘤生长,调节细胞正常生长的物质。长,调节细胞正常生长的物质。1.1 Discovery of Tumor Suppressor Gene1985年年,Cavence等等从从两两个个患患遗遗传传性性视视网网膜膜母母细细胞胞瘤瘤家家族族中中,发发现现肿肿瘤瘤细细胞胞缺缺失失了了位位于于13q14区区的的Rb基基因因,且且当当Rb基基因因为为纯纯合合子子时时就就会会诱诱发发肿肿瘤瘤,从从而而首首次次发发现现并并证证实实了了抑抑癌癌基基因。因。抑癌基因抑癌基因(tumor suppressor gene),又称),又称抗癌基因抗癌基因(anti-oncogene)、)、肿瘤易感基因肿瘤易感基因或或隐性癌基因隐性癌基因,是一类存在于正常细胞中,其,是一类存在于正常细胞中,其编码产物能抑制细胞生长增殖的基因。编码产物能抑制细胞生长增殖的基因。由于这类基因的缺失、突变或甲基化引起的失由于这类基因的缺失、突变或甲基化引起的失活,最终导致肿瘤的发生。活,最终导致肿瘤的发生。1.2 Concept of Tumor Suppressor Gene目前已被人们认识和克隆的抑癌基因有目前已被人们认识和克隆的抑癌基因有40多种,多种,可分为两大类:可分为两大类:抑制细胞增殖的抑癌基因;抑制细胞增殖的抑癌基因;参与参与DNA损伤修复的抑癌基因。损伤修复的抑癌基因。抑制细胞增殖的抑癌基因抑制细胞增殖的抑癌基因uRb retinoblastoma gene;up53 P53 gene;up21Waf1/Cip1 wild type p53-activated fragment 1CDK-interacting protein 1;up27Kip1 kinase inhibition protein 1;uDCC deleted in colorectal cancer;uNF1/2 neurofibromatosis gene;uINK4 inhibitor of CDK4 and CDK6;uPTEN phosphatase and tensin homolog;unm23 non-metastasis 23;uFHIT fragile histidine triad;uDPC4 deleted in pancreatic cancer locus 4;u。参与参与DNA损伤修复的抑癌基因损伤修复的抑癌基因uMSH2 E.coli MutS homolog 2;uMLH1 E.coli MutL homolog 1;uPMS1/2 DNA mismatch repair protein 1/2;uGTBP G/T-binding protein;uB

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