3、RNA指导的DNA复制(逆转录)及病毒的复制.ppt

RNA replicationReverse transcription=replication逆转录酶（reverse transcription)1964年，Temin发现Rous肉瘤病毒等RNA病毒所造成的感染可被DNA合成抑制剂遏制。表明：RNA肿瘤病毒的RNA复制过程中要合成DNA。Temin又发现放线菌素D能抑制致癌RNA病毒的复制，但不能抑制一般RNA病毒的复制。表明：转录对于RNA病毒增殖是必需的。Temin提出前病毒假说：原病毒DNA是RNA肿瘤病毒在复制和致癌中的中间物。1970年，Temin 在Rouse肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中发现逆转录酶。多功能酶：1、RNA指导的DNA聚合酶活性2、RNA酶H（RNaseH）活性：水解RNA-DNA杂交体上的RNA3、DNA指导的DNA聚合酶活性：合成互补DNA。4、没有35外切酶活性。特点：1.含有Zn2+（是否有锌指结构、DNA结合功能？）2.DNA合成反应要求有模板和引物。3.需适当浓度的二价阳离子（Mg2+、Mn2+）4.5 3合成方向逆转录病毒的基因组复制过程第一阶段：合成负股cDNA的大部分第二阶段：以负股DNA为模板合成一小部分正股DNA链。第三阶段：完成cDNA的全部复制。乙肝病毒基因组的复制其复制需通过逆转录过程经RNA中间体实现，其DNA聚合酶也是一种逆转录酶。逆转录病毒：RNA DNA RNA乙肝病毒：DNARNA DNA试管内cDNA的合成常用于获得或研究真核生物基因的方法。提取某一种特定的mRNA，经逆转录生成的cDNA可代表某一特定基因。常用的逆转录酶有两种：*来自鸟类成髓细胞瘤逆转录病毒称为AMV-RT；*来自鼠白血病毒称为MMLV-RT。病毒RNA复制的主要方式1、病毒含有正链RNA，如灰质炎病毒。RNA（+）蛋白质（酶）RNA复制2、病毒含有负链RNA和复制酶如狂犬病毒。RNA（-）RNA（+）蛋白质、复制病毒RNA（-）。3、病毒含有双链RNA和复制酶。如呼肠孤病毒。双链RNA RNA（+）蛋白质 RNA（-）双链RNA4、逆转录病毒。讨论题如何知道DNA复制中先要有RNA引物的合成？(原料/新合成DNA序列分析/专一核酸酶水解)病毒的复制病毒的复制病毒在活细胞内，以其基因为模板，在酶的作用下，分别合成病毒基因及蛋白质，再组装成完整的病毒颗粒，这种方式称为复制（replication)。从病毒进入宿主细胞开始，经过基因组复制和病毒蛋白合成，至释放出子代病毒的全过程，称为一个复制周期。病毒的复制周期主要包括吸附和穿入、脱壳、生物合成、组装和释放四个连续步骤。复制周期复制周期病毒的一步生长曲线病毒的一步生长曲线病毒的一步生长曲线病毒的一步生长曲线：以感染时间为横坐标，病毒效价为：以感染时间为横坐标，病毒效价为 纵坐标，绘制出的病毒特征曲线。纵坐标，绘制出的病毒特征曲线。一、吸附和穿入（一）吸附（一）吸附(adsorption)分两个阶段：分两个阶段：1.静静电电吸吸附附：病病毒毒体体与与细细胞胞接接触触，进进行行静静电电结结合合。非特异性、可逆。非特异性、可逆。2.真真正正的的吸吸附附：病病毒毒体体表表面面位位点点（蛋蛋白白质质结结构构）与与宿宿主主细细胞胞膜膜上上相相应应的的受受体体结结合合。是是决决定定病病毒毒感感染染的的真真正开始。正开始。裸露病毒的吸附裸露病毒的吸附 囊膜病毒的吸附囊膜病毒的吸附（二）穿入（二）穿入(penetration)病病毒毒体体吸吸附附在在宿宿主主细细胞胞膜膜上上后后，可可通通过过数数种种穿穿入入方式进入细胞：方式进入细胞：1.1.无囊膜的病毒无囊膜的病毒 一一般般经经过过细细胞胞膜膜吞吞入入，称称为为病病毒毒胞胞饮饮,如如腺腺病毒、小病毒、小RNARNA病毒等病毒等病毒胞饮病毒胞饮2.2.有囊膜的病毒有囊膜的病毒 囊膜与宿主细胞膜融合，病毒的核衣壳直接囊膜与宿主细胞膜融合，病毒的核衣壳直接 进入细胞浆内进入细胞浆内 病毒胞饮病毒胞饮:细胞膜吞入细胞膜吞入(1)膜融合后进入膜融合后进入(2)病毒胞饮病毒胞饮二、脱壳二、脱壳(uncoating)(uncoating)不不同同病病毒毒脱脱壳壳方方式式不不一一，多多数数在在宿宿主主细细胞胞溶溶酶酶体体酶酶作作用下脱壳，释放出基因组核酸。用下脱壳，释放出基因组核酸。三、生物合成三、生物合成(biosynthesis)病病毒毒基基因因组组一一旦旦从从衣衣壳壳中中释释放放后后，就就利利用用宿宿主主细细胞胞提提供的低分子物质合成大量的供的低分子物质合成大量的病毒核酸和结构蛋白病毒核酸和结构蛋白。早早期期，根根据据病病毒毒基基因因组组转转录录成成mRNA、指指令令合合成成转转录录合成所必需的合成所必需的复制酶复制酶和一些和一些抑制蛋白；抑制蛋白；生物合成阶段，病毒处于生物合成阶段，病毒处于隐蔽期隐蔽期病毒的生物合成过程可基本归为病毒的生物合成过程可基本归为6大类：大类：双股双股DNA病病毒、单股毒、单股DNA病毒、单正股病毒、单正股RNA病毒、单负股病毒、单负股RNA病毒、逆转录病毒和双股病毒、逆转录病毒和双股RNA病毒病毒。病毒病毒DNA早期早期mRNA早期蛋白（酶等）早期蛋白（酶等）子代病毒子代病毒DNA晚期晚期mRNA病毒结构蛋白病毒结构蛋白子代病毒子子代病毒子双股双股DNA病毒病毒复制复制宿主细胞宿主细胞转录酶转录酶单链正股单链正股RNARNA病毒病毒（-）ssRNA亲代病毒（亲代病毒（+）ssRNA早期蛋白早期蛋白（+）ssRNAdsRNA复制中间型复制中间型（-）ssRNA（+）ssRNA大量子代（大量子代（+）ssRNA晚期蛋白晚期蛋白装配子代病毒装配子代病毒单股负股单股负股RNA病毒病毒病毒自身携带依赖病毒自身携带依赖RNA的的RNA多聚酶。多聚酶。亲代（亲代（-ssRNA）（+）mRNA蛋白质蛋白质（+）ssRNA子代（子代（-）sRNA子代病毒子代病毒多聚酶多聚酶逆转录病毒逆转录病毒病毒病毒RNA逆转录酶逆转录酶双股双股DNA整合至宿主细胞（前病毒）整合至宿主细胞（前病毒）mRNA病毒病毒RNA结构蛋白结构蛋白装配子代病毒装配子代病毒RNA:DNA转录酶转录酶聚合酶聚合酶四、组装四、组装病毒核酸与衣壳装配在一起，形成病毒子。病毒核酸与衣壳装配在一起，形成病毒子。绝大多数绝大多数DNADNA病毒均在细胞核病毒均在细胞核内组装内组装;RNARNA病毒和痘病毒在细胞浆病毒和痘病毒在细胞浆内组装。内组装。绝大多数绝大多数无囊膜病毒无囊膜病毒释放，一次同步，破坏宿主细释放，一次同步，破坏宿主细胞膜，细胞裂解释放病毒颗粒，细胞迅速死亡。胞膜，细胞裂解释放病毒颗粒，细胞迅速死亡。绝大多数绝大多数有囊膜病毒有囊膜病毒以以出芽方式出芽方式释出时包上释出时包上细胞核细胞核膜或细胞膜膜或细胞膜而成为成熟病毒。逐个释出，非一次同而成为成熟病毒。逐个释出，非一次同步，细胞死亡缓慢。步，细胞死亡缓慢。五、释放五、释放Virus Obtaining Its Envelope from Host Cell Membrane by Budding 复制周期复制周期思考题1某种病毒DNA的碱基组成（摩尔百分比）如下：A=32；G=16；T=40；C=12 该病毒DNA的特点如何？思考题2简要说明怎样进行构建cDNA文库？思考题3组织培养的哺乳动物细胞S期长达5 小时，经放射自显影测定DNA复制的速度是0.5微米/分，已知哺乳动物细胞DNA全长1.2米，计算染色体复制时共有多少复制叉在复制？8103（如何分析？）思考题4已知抹香鲸和猪的胰岛素具有相同的氨基酸序列，然而某些抗血清却能将它们区别开来，这岂不与“蛋白质的一级结构决定其高级结构”的理论相矛盾吗？你如何解释？思考题5将某种纯蛋白1mg进行氨基酸分析，得19.5ug的异亮氨酸（分子量=131.2），那么该蛋白质的最小分子量是多少？