兽药残留--聚醚类残留检测讲解学习.ppt
兽药残留兽药残留-聚醚类残留检聚醚类残留检测测聚醚类药物残留检测l 理化性质l 药用机理l 代谢与残留l 毒理特性l 前处理l 检测方法聚醚类药物残留检测聚醚类药物残留检测莫能菌素（Monensin）莫能菌素莫能菌素是从肉桂链的发酵产是从肉桂链的发酵产物中分离而得，为聚醚类离子物中分离而得，为聚醚类离子载体抗生素的代表药，一般用载体抗生素的代表药，一般用其钠盐其钠盐。分子式分子式:C36H61NaO11:C36H61NaO11 分子量分子量:692.85:692.85 结构特点：具有结构特点：具有5 5个环醚环和个环醚环和1 1个螺缩酮体系。个螺缩酮体系。熔点：熔点：103103105105，钠盐，钠盐267267269269。旋光度：旋光度：+47.7+47.7 溶解度：在甲醇、乙醇、氯仿中易溶，在苯、丙酮、四氯化碳中可以溶解度：在甲醇、乙醇、氯仿中易溶，在苯、丙酮、四氯化碳中可以溶解，微溶于水。溶解，微溶于水。对温度不敏感对温度不敏感 在饲料样品中稳定性较高。在饲料样品中稳定性较高。聚醚类药物残留检测沙拉菌素（Lasalocid）钠盐钠盐性状：性状：白色至棕色粉末，有特异臭，白色至棕色粉末，有特异臭，熔点熔点191191192(192(分解分解)。旋光度旋光度-30(c=1-30(c=1，甲醇，甲醇)。紫外吸收光谱：紫外吸收光谱：308nm(4 100)308nm(4 100)。溶解度：溶解度：微溶于水，可溶于大部分有机溶剂。微溶于水，可溶于大部分有机溶剂。性能稳定，性能稳定，3737下可保存下可保存6 6个月不变，个月不变，2525下保存下保存1818月不变月不变。分子式分子式C43H72O11C43H72O11分子量分子量765.05765.05聚醚类药物残留检测盐霉素(salinomycin)分子式分子式:C42H69NaO11:C42H69NaO11 分子量分子量:772.98:772.98 钠盐性状：白色或淡黄色结晶性粉末。钠盐性状：白色或淡黄色结晶性粉末。熔点：熔点：140140142142 溶解性：易溶于丙酮、三氯甲烷、苯、乙酸乙酯、乙醚和甲醇，微溶于溶解性：易溶于丙酮、三氯甲烷、苯、乙酸乙酯、乙醚和甲醇，微溶于正己烷，几乎不溶于水。制成的沙利霉素钠，稍有特异臭味，易溶于丙酮、正己烷，几乎不溶于水。制成的沙利霉素钠，稍有特异臭味，易溶于丙酮、乙醚、氯仿几乎不溶于水。乙醚、氯仿几乎不溶于水。盐霉素盐霉素白色链霉菌发酵产生，白色链霉菌发酵产生，具有特殊的环状构，是典型具有特殊的环状构，是典型的离子载体抗生素的离子载体抗生素。聚醚类药物残留检测马杜霉素（Maduramicin）性状：白色结晶粉末，性状：白色结晶粉末，有特殊臭味有特殊臭味，溶解情况：不溶于水，可溶于大部分有机溶剂。溶解情况：不溶于水，可溶于大部分有机溶剂。熔点：熔点：305-310305-310聚醚类药物残留检测1.抗菌药离子载体类抗生素，化学结构上含有许多醚基和一个一元有机酸，其结构能强烈地与球虫细胞中的阳离子紧密结合，从而改变细胞膜上脂质屏障的渗透性，抑制了胞子体和裂殖体正常的离子平衡，终致杀死球虫。2.饲料添加剂 提高瘤胃丙酸产量，促进畜禽生长发育和提高饲料利用率。药用机理聚醚类药物残留检测代谢与残留v 主要代谢方式是O一脱甲基，其他包括羟化、脱羧、氧化(成酮)及葡萄糖醛酸结合等。马杜霉素在火鸡中的主要代谢途径是脱一个或多个甲氧基，其次是羟化或与葡萄糖醛酸结合。v 聚醚类离子抗生素在动物体内分布广泛，绝大部分药物及其代谢产物经胆管排泄，最终随粪便排出体外。其中，肝脏和脂肪残留物浓度最高，其次为肾脏、肌肉和血浆。v 一般肝脏中主要以代谢物形式存在，脂肪中主要以原形药物形式存在。绝大部分被吸收的PEs在肝组织内被迅速代谢并失去活性，随胆汁排泄。聚醚类药物残留检测毒理特性v PEs的中毒剂量与安全剂量非常接近在生产实际中，添加过量或拌料不均引起鸡中毒现象时有发生。v Laczay 报道，饲料中高剂量的PEs主要通过干扰动物细胞的离子平衡和能量代谢而产生细胞毒性作用，细胞出现变性或坏死。一些对ATP依赖性强的组织最敏感，如心肌、膈肌等。v 食入残留有PEs的食物可引起人血管舒张，特别是诱发心脏冠状动脉扩张和血流量增加；当患有冠状动脉疾病的人群，食入过多残留有PEs的食物后，可引起冠状动脉扩张，心脏局部缺氧加重，使病情恶化。聚醚类药物残留检测聚醚类抗生素在毒理学上属于高毒或剧毒物质，具有强细胞毒性，安全范围 小。过量使用聚醚类抗生素会导致动物产品中药物残留，严重危害人体健康。加拿大、中国、欧盟和美国等许多国家或国际组织制定了聚醚类抗生素残留限量。各国对动物源性产品中聚醚类抗生素的残留 限量要求均低于 1.0mgkg。欧盟规定牛奶中莫能菌霉素限量为0.002 mgkg。毒理特性聚醚类药物残留检测检测方法如何如何检测检测？微生物法色谱法 薄层色谱法 高效液相色谱法免疫分析法毛细管电泳一电导分离分析联用法 高效液相色谱一质谱(HPLC-MS)高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）聚醚类药物残留检测v检测物质原型。v结构特征是在直链碳骨架上连成含氧杂环。v分子一端有1个羧基，在中性或碱性环境中稳定，其游离酸稳定性较差。v微溶或不溶于水，易溶于低级醇、丙酮、氯仿、苯、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、四氯化碳及正己烷等。前处理溶 剂提 取固 相萃 取C18C18柱柱Oasis HLBOasis HLB柱柱硅胶柱硅胶柱氧化铝柱氧化铝柱聚醚类药物残留检测1.称取5.0g肌肉、肝脏或脂肪组织剪碎样品，置于25mL聚四氟乙烯离心管中，加入10mL重蒸馏水，高速匀浆1min。2.加入10mL异辛烷，旋涡搅拌3min，1500r/min离心5min，上清液备用。3.向沉淀物中再分别加入10mL异辛烷，重复萃取两次，合并三次离心后的上清液。4.称取0.5g含水5%的硅胶装入底部带有玻璃砂垫的层析柱中，轻轻敲匀，上部放约0.5cm高度的无水硫酸钠。5.用5mL异辛烷预洗硅胶柱，不使流干，加入离心所得的上清液。6.用10mL二氯甲烷洗涤杂质，用6mL二氯甲烷甲醇（体积比9010)）洗脱，洗脱液收集于15mL玻璃鸡心瓶中。7.洗脱液于40C旋转蒸发近干，用1mL甲醇水（体积比90 10)溶解，0.45um微孔有机滤膜过滤，滤液备HPLC检测之用。高效液相色谱检测鸡肉中聚醚类抗生素前处理聚醚类药物残留检测前处理1.提取液态奶类样品：量取100 mL液态奶试样于50 mL聚丙烯离心管中，加无水Na：SO。约10 g和乙腈20 mL，涡旋混匀1 min，振荡10 min，以3000 rmin离心3 min，取出上层清液。用20 mL乙腈重复提取一次，合并上清液。加10 mL乙腈饱和的正己烷，涡旋1 min，弃去正己烷，减压浓缩至近干。用4 mL V(甲醇)：V(水)=50：50混合液溶解残渣，待净化。2.奶粉类样品：取125 g奶粉于烧杯中，加适量3550水溶解，待冷却至室温后，用水定容至100 mL，充分混匀。取100 mL样品溶液于50 mL聚丙烯离心管中，按液态奶类样品提取步骤处理。3.将样品溶液加载到固相萃取小柱中，并用3 mL V(甲醇)：V(水)=50：50混合液淋洗至浓缩瓶，并入小柱。依次用5 mL水和3 mL V(甲醇)：V(水)=50：50混合液淋洗小柱。4.用氮气吹干仪将洗脱液吹干，并迅速用流动相定容至10 mL，滤膜过滤，用于UPLCMSMS测定。超高效液相色谱一串联质谱法检测牛奶中聚醚类抗生素聚醚类药物残留检测检测方法微生物法色谱法 薄层色谱法 高效液相色谱法免疫分析法毛细管电泳一电导分离分析联用法 高效液相色谱一质谱(HPLC-MS)高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）聚醚类药物残留检测微生物法原理：抗生素抑制微生物生长，根据对抗生素敏感的实验菌，在适当条件下所产生的抑菌圈大小与抗生素浓度成正相关的关系而设计的。管碟琼脂扩散法管碟琼脂扩散法1.1.试料的制备试料的制备 2.2.样品处理样品处理3.3.双碟的制备双碟的制备：将检定培养基融化,置水浴中冷却至 5564,加入菌悬液(每100 mL培养基加0.60.8 mL枯草芽孢杆菌（CMCC63202）)，摇匀，吸取6.0 mL置平皿中，使其均匀摊布，待凝固15 min后备用。聚醚类药物残留检测4.4.测定测定 ：每个双碟中放置5个圆滤纸片，每个滤纸片间距 10 mm 以上,用微量移液器分别在5个滤纸片上加空白添加试料、空白试料、磷酸盐缓冲液(pH6.0)、判定试验试料、供试试料各90L。每个试料至少重复2个双碟，置(55 2)培养箱中培养56 h。5 5.结果判定结果判定 ：采用微生物效价法测定，培养后采用多功能微生物自动测量分析仪进行测量并统计其抑菌圈直径的大小。根据供试试料中供试试料中有无抑菌圈、抑菌圈大小和空白添加剂抑菌圈大小比较，判断阴性或阳性。微生物法v有良好的剂量关系，微生物筛选方法抑菌圈与实际药物含量的相关性好。v具有很大的广泛性，因为任何抗菌药物及活性抑菌成分都能抑制微生物的生长。v用微生物法检测动物性组织中的兽药残留时，前处理简单、不需特殊设备，可用于快速筛选大量的样品。聚醚类药物残留检测薄层色谱法（TLCTLC）原理：马杜霉素没有明显的紫外吸收和电化学特性，不能直接采用紫外或电化学的手段来测定其含量。用香草醛一浓硫酸一甲醇溶液显色，在薄层扫描仪上对斑点进行扫描定量，样品经过丙酮简单提取后测定。薄层扫描法1 1.薄层板的清洁薄层板的清洁：以氯仿：甲醇(8：2)为展开剂，反复展开23次，去除潜在的杂质污染。干燥。2 2.展开剂：展开剂：乙酸乙酯：氯仿(2：1)3 3.显色剂的配制：显色剂的配制：香草醛39ml，浓硫酸1ml，甲醇100ml，混合溶解配成溶液，临用时新配。4 4.对照品溶液的配制对照品溶液的配制：分别称取马杜霉素对照品适量，用丙酮溶解并稀释，配成一系列浓度的对照品溶液。聚醚类药物残留检测薄层色谱法5 5.样品溶液的配制：样品溶液的配制：取己均质或匀浆后的样品适量，用丙酮提取过滤，取滤液，必要时进行浓缩并定容，溶剂仍然是丙酮，即得。6 6.点样：点样：用定量毛细管或平头微量注射器吸取样品，于薄层板离边缘25cm处的直线上，每隔1cm，点一个点。7 7.展开：展开：将薄层板置于展开槽中，当溶剂前沿到达距点样原点10cm时，取出晾干。8 8.显色：显色：驱尽薄层板上的残余溶剂，用香草醛溶液，在距离3050cm处。向薄层板均匀喷雾，不宜过多，然后置干燥箱中，在90加热510分钟，取出，再补喷，至斑点尽显。以斑点附近无污染为度。9.9.薄层扫描：薄层扫描：将显色后的层析板置于双波长薄层扫描仪上，扫描斑点，测定反射光吸收度。TLC无需衍生化，可以简化前处理过程，成本低，本方法可试用于饲料和动物组织中马杜霉素残留的快速测定。聚醚类药物残留检测高效液相色谱法(HPLC)v 因莫能菌素和盐霉素缺乏紫外、荧光和电化学特性，需要用HPLC柱后衍生法将其衍生化后被紫外可见检测器检测，故用甲醇-水分别分离提取试样中的莫能菌素和盐霉素，以甲醇-冰乙酸-水做流动相，香草醛做衍生物，用高效液相色谱-柱后衍生化-紫外检测法分离测定。v 陈明等建立的饲料中聚醚类抗生素的柱后衍生方法可同时检测饲料中的莫能菌素和盐霉素，试验采用两个柱后衍生反应器，使莫能菌素和盐霉素在柱后分离后与衍生试剂1（硫酸）和衍生试剂2（香草醛）在不同的反应器中先后分别发生反应，其特异性强，样品峰分离效果好，基本无杂质干扰，分析结果稳定。vHPLC方法的灵敏度、特异性都非常高，速度快，样品需量少，容易回收，色谱柱可反复使用，并可以准确的定性、定量。聚醚类药物残留检测原理：在熔融石英毛细管 中，以 T r i s醋酸柠橄酸为电泳运行介质，分离电 压+1 2.0 k V，采用毛细管电泳电导法建立盐霉素的分离检测方法。实验方法：毛细管柱在使用前用蒸馏水和电泳运行液各冲洗约5 分钟。检测电极用超声波进行冲洗。电泳运行液为1 O m m o l/L T r i s +2 m m o l/L H A c +0.2 m m o l/L C i t。采用重力进样方式，进样时间2 0 s，分离电压+1 2 k V.实验在室温(2 5)，湿度 7 0%的实验条件下进行。该方法快速、简便、灵敏。毛细管电泳一电导分离检测聚醚类药物残留检测免疫分析法v Kleiner等用建立的放射免疫测定法（RIA）检测动物组织中的马杜霉素残留，灵敏度极高，检测限在0.025/一下，完全可以满足动物组织中马杜霉素残留检测的要求，但是RIA法需要专门的检测仪器，且需合成其放射降解物，较为繁琐和危险，目前应用不广。v IAC/ELISA法测定肉鸡组织中的马杜霉素残留，用混合酸酐法和活化酯法合成种马杜霉素结合抗原。用其中一种作免疫原，免疫家兔产生抗体；用其余三种作包被原，探讨不同包被原用于ELISA检测马杜霉素残留时，对其灵敏度(I50)和方法回收率的影响。试验结果表明，马杜霉素结合抗原免疫家兔制备的抗体对马杜霉素具有很高的特异性、亲合性和选择性。lELISA方法尽管能满足检测限的要求但由于抗原抗体反应受环境影响因素较大，且抗体活性随时间推移下降很快，在实际应用中该方法一般仅作为快速筛选的方法。聚醚类药物残留检测2006年国家质量监督检验检疫总局发布的动物源产品中聚醚残留量测定方法也是液相色谱-串联质谱法（适用于禽、兔等动物源产品中莫能菌素、盐霉素、甲基盐霉素残留的确证和定量测定）原理：试样中的聚醚类残留，采用异辛烷提取，提取液用硅胶柱净化，再在液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。HPLC-MS/MS聚醚类药物残留检测色谱分析条件Acquity BEH C18色谱柱(50 mm2.1 mm,i.d.,1.7 m,Waters公司);柱温40;流动相：0.1%甲酸(含5 mmol/L乙酸铵)甲醇(1090,V/V)，流速：0.25 mL/min;进样量：5.0 L。质谱分析条件电喷雾离子源;正离子扫描(ESI+);检测方式：多反应监测(MRM);毛细管电压：2.8 kV;离子源温度：110;去溶剂气温度：380;去溶剂气(N2)流量：600 L/h;锥孔气(N2)流量：50 L/h;碰撞气(高纯Ar)流量：0.1 L/h;聚醚类药物残留检测2008年国家质量监督检验检疫总局发布的牛奶和奶粉中6中聚醚类抗生素残留检测方法是HPLC-MS。原理：采用乙腈提取试样中的聚醚类抗生素，固相萃取柱上净化，高效液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量，可使牛奶中沙拉洛菌素、莫能菌素、尼尔利亚菌素、盐霉素、甲基盐霉素、马杜霉素铵的检出限为0.2ug/L,奶粉中六中聚醚类抗生素检出限为1.6ug/kg。HPLC-MSl采用液相色谱质谱法则不需要衍生化，且避免了繁琐的衍生化步骤带来的目标物损失，方法回收率和灵敏度大幅提高。聚醚类药物残留检测结束结束
