NK活性测定.ppt

NK细胞活性测定（MTT比色法）NK细胞NKNK细胞属于固有免疫细胞。细胞属于固有免疫细胞。NKNK杀伤靶细胞时既不需要特异性抗体参与，杀伤靶细胞时既不需要特异性抗体参与，也不需要抗原预先致敏的淋巴细胞。在抗也不需要抗原预先致敏的淋巴细胞。在抗肿瘤和抗感染免疫中发挥重要作用。肿瘤和抗感染免疫中发挥重要作用。MTT法检测NK细胞活性原理：原理：将将NKNK细胞和靶细胞共同培养，细胞和靶细胞共同培养，NKNK细胞可杀伤靶细胞可杀伤靶细胞，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶使外源性细胞，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶使外源性黄色的黄色的MTTMTT还原成蓝紫色的还原成蓝紫色的FormazanFormazan结晶，并沉结晶，并沉积在细胞里。而死细胞无此功能，通过比色检测积在细胞里。而死细胞无此功能，通过比色检测可以检测培养物中活细胞的数量，从而计算可以检测培养物中活细胞的数量，从而计算NKNK细细胞杀伤靶细胞的能力。胞杀伤靶细胞的能力。NK活性检测效应细胞：NK细胞（小鼠脾脏细胞）靶细胞：Yac-1细胞（实验员准备）NK细胞制备：小鼠脾细胞分离脱臼法处死小鼠，酒精棉球消毒皮肤，取脾，放入滤网，置于平皿中，脱臼法处死小鼠，酒精棉球消毒皮肤，取脾，放入滤网，置于平皿中，在滤网脾脏处加入在滤网脾脏处加入3ml Hanks3ml Hanks液液;用试管底部碾磨脾脏，制成脾细胞悬液，用试管底部碾磨脾脏，制成脾细胞悬液，200200目滤网制成单细胞悬液目滤网制成单细胞悬液;离心（离心（15001500转转/分分 5min5min），弃去上清），弃去上清;加入加入HanksHanks液液3ml 3ml，重悬细胞，重悬细胞，15001500转转/分分 5min5min，去上清，加入，去上清，加入1ml 1ml 16401640培养液，混匀细胞；培养液，混匀细胞；细胞计数：取细胞悬液细胞计数：取细胞悬液1010微升，加到含有微升，加到含有390390微升白细胞稀释液的微升白细胞稀释液的EppendorfEppendorf管中，混匀，取适量细胞悬液（约管中，混匀，取适量细胞悬液（约15ul15ul），加入计数板中。），加入计数板中。在显微镜下计数，计算细胞数量。在显微镜下计数，计算细胞数量。根据细胞数量，用根据细胞数量，用16401640完全培养基配成完全培养基配成2102106 6/ml/ml浓度的细胞悬液。浓度的细胞悬液。2、靶细胞的制备（实验员准备）：取对数生长期取对数生长期YAC-1YAC-1细胞，细胞，HanksHanks液洗涤液洗涤2 2次，计数，调次，计数，调整至整至2102105 5/ml/ml。实验组实验组实验组实验组靶细胞对照靶细胞对照靶细胞对照靶细胞对照组组组组效应细胞对效应细胞对效应细胞对效应细胞对照组照组照组照组靶细胞靶细胞靶细胞靶细胞100100 l l100100 l l效应细胞效应细胞效应细胞效应细胞100100 l l100100 l l16401640培养基培养基培养基培养基100100 l l100100 l l3、细胞毒试验（、细胞毒试验（96培养板）：每组做培养板）：每组做3个复孔个复孔 4 4、孵育、孵育 二氧化碳培养箱孵育二氧化碳培养箱孵育2 2小时；小时；加加1010l MTTMTT，继续孵育，继续孵育2 2小时。小时。5 5、测、测ODOD值值 吸取上清约吸取上清约150ul150ul，加，加150150l 二甲亚砜，振荡二甲亚砜，振荡10min10min，测，测ODOD值。值。（1-实验组实验组OD值值 -效应细胞对照组效应细胞对照组OD值值靶细胞对照组靶细胞对照组OD值值 ）100%NK细胞活性（细胞活性（%）=6 6、结果分析、结果分析、结果分析、结果分析DBCA A BCD细胞计数计算公式一大格细胞数10440（稀释倍数）举例：10010440=4 107 稀释：取0.1ml细胞原液，加入1.9ml培养液，即为2 106/ml；或在原液中加入1ml培养液，混匀，取0.1ml细胞，加入0.9ml培养液，即为2 106/ml