酶免疫组化实验讲稿.ppt
关于酶免疫组化实验关于酶免疫组化实验第一页，讲稿共二十二页哦实验目的实验目的1 1、掌握免疫组化技术的基本原理。、掌握免疫组化技术的基本原理。2 2、掌握检测、掌握检测T T细胞表面分子细胞表面分子CD3CD3的实验原理的实验原理及检测方法。及检测方法。3 3、掌握、掌握SABCSABC免疫放大技术原理。免疫放大技术原理。第二页，讲稿共二十二页哦l免疫组织化学技术（免疫组织化学技术（immunohistochemistry immunohistochemistry technique,IHCTtechnique,IHCT）是指在组织细胞原位通过抗原）是指在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，借助可见的标抗体反应和组织化学的呈色反应，借助可见的标记物，对抗原抗体进行记物，对抗原抗体进行定位、定性和定量定位、定性和定量检测的一检测的一种免疫检测方法。种免疫检测方法。抗原抗体反应的特异性抗原抗体反应的特异性 组织化学的可见性组织化学的可见性第三页，讲稿共二十二页哦分类分类酶免疫组化技术酶免疫组化技术荧光免疫组化技术荧光免疫组化技术亲和免疫细胞组化技术亲和免疫细胞组化技术免疫金（银）细胞染色组化技术免疫金（银）细胞染色组化技术免疫标记电镜技术免疫标记电镜技术杂交免疫细胞组化技术杂交免疫细胞组化技术第四页，讲稿共二十二页哦酶免疫组化技术酶免疫组化技术l酶免疫组化技术是直接以细胞或组织切片为抗酶免疫组化技术是直接以细胞或组织切片为抗原相，以酶联免疫技术检测抗原或抗体的存在原相，以酶联免疫技术检测抗原或抗体的存在与否或定位的一类酶免疫技术。与否或定位的一类酶免疫技术。l本实验以酶免疫组化技术检测本实验以酶免疫组化技术检测CD3CD3为例。以亲为例。以亲和素和素-生物素生物素-过氧化物酶（过氧化物酶（ABCABC或或SABCSABC）技术技术检测检测T T淋巴细胞亚群为例验证酶免疫组织化学淋巴细胞亚群为例验证酶免疫组织化学技术检测组织抗原的方法。技术检测组织抗原的方法。第五页，讲稿共二十二页哦酶免疫组化染色中常用的酶及显示底物酶免疫组化染色中常用的酶及显示底物l最常用的酶是最常用的酶是辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRPHRP）l常用的供氢体：常用的供氢体：二氨基联苯胺（二氨基联苯胺（DABDAB）反应产物呈棕色反应产物呈棕色 氨基乙基卡巴唑（氨基乙基卡巴唑（AECAEC）反应产物呈橘红色反应产物呈橘红色 4-4-氯氯-1-1-萘酚萘酚反应产物呈灰蓝色反应产物呈灰蓝色第六页，讲稿共二十二页哦生物素生物素-亲和素放大技术亲和素放大技术l是一种以生物素是一种以生物素(biotin，B)和亲和素和亲和素(avidin，AV)具有的具有的多级放大结合多级放大结合特性为基础的实验技术，特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记，与标记免疫技术的有机结合，极大提高了分析与标记免疫技术的有机结合，极大提高了分析测定的灵敏度。测定的灵敏度。l特点：灵敏度、特异性、稳定性、适用性特点：灵敏度、特异性、稳定性、适用性l常见类型：常见类型：BAB法和法和ABC法法第七页，讲稿共二十二页哦ABCABC法原理法原理1 1、预先按一定比例将亲和素（或链霉亲和素）与酶标生预先按一定比例将亲和素（或链霉亲和素）与酶标生物结合，形成可溶的亲和素（或链霉亲和素）物结合，形成可溶的亲和素（或链霉亲和素）-生物素生物素-过氧化物酶复合物（过氧化物酶复合物（ABCABC或或SABCSABC）。）。2 2、当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）、当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，或生物素化二抗（间接法）相遇时，ABCABC（或（或SABCSABC）中）中未饱和的亲和素结合部位就可与抗体上的生物素结合，未饱和的亲和素结合部位就可与抗体上的生物素结合，使抗原使抗原-抗体反应与抗体反应与ABC ABC（或（或SABCSABC）标记体系连成一体进）标记体系连成一体进行检测。行检测。第八页，讲稿共二十二页哦优点优点 一个亲和素（一个亲和素（A）有）有4个生物素结合位点，个生物素结合位点，一个过氧化物酶可结合多个生物素分子，一个过氧化物酶可结合多个生物素分子，ABC法法将亲和素作为将亲和素作为“桥桥”把生物素化的抗体把生物素化的抗体与生物素结合的酶连接起来，形成一个与生物素结合的酶连接起来，形成一个网络状网络状复合物复合物，其中网络了大量，其中网络了大量酶分子酶分子，因此应用于，因此应用于检测体系时，极大提高酶在抗原检测体系时，极大提高酶在抗原-抗体反应中抗体反应中的浓度，提高检测敏感性。的浓度，提高检测敏感性。第九页，讲稿共二十二页哦实验原理实验原理l将分离得到的淋巴细胞制成涂片，加入的将分离得到的淋巴细胞制成涂片，加入的CD3CD3单克隆抗单克隆抗体与待检单个核细胞涂片作用。体与待检单个核细胞涂片作用。l CD3CD3阳性的细胞就会与阳性的细胞就会与CD3CD3单克隆抗体特异性结合，再单克隆抗体特异性结合，再用生物素化抗鼠用生物素化抗鼠IgGIgG检测检测CD3CD3单抗与待检细胞结合的情单抗与待检细胞结合的情况。况。l最后加入链霉亲和素最后加入链霉亲和素-生物素生物素-过氧化物酶过氧化物酶 (ABC(ABC桥联桥联法法)，与生物素化抗鼠，与生物素化抗鼠IgGIgG结合，酶遇到底物时，能催化结合，酶遇到底物时，能催化底物产生有色不溶性产物。底物产生有色不溶性产物。l根据细胞被底物着色的情况可以判定根据细胞被底物着色的情况可以判定CD3CD3阴性和阳性的阴性和阳性的细胞，测定其阳性百分率。细胞，测定其阳性百分率。第十页，讲稿共二十二页哦SABCB-B-山山羊羊抗抗鼠鼠IgGIgG抗体抗体鼠抗鼠抗CD3CD3单抗单抗CD3CD3T淋巴细胞间接间接ABCABC法：法：CD3CD3鼠抗鼠抗CD3CD3单抗单抗B-B-山羊抗鼠山羊抗鼠IgGIgG抗体抗体SABCSABC第十一页，讲稿共二十二页哦实验器材与试剂实验器材与试剂1 1、5%BSA5%BSA 2 2、抗、抗CD3CD3单克隆抗体单克隆抗体3 3、生物素化羊抗鼠、生物素化羊抗鼠IgG(IgG(二抗二抗)4 4、链霉亲和素、链霉亲和素-生物素生物素-过氧化物酶过氧化物酶(SABC)(SABC)5 5、3,3,-3,3,-二氨基联苯胺二氨基联苯胺(DAB)(DAB)6 6、0.0lmol/L pH7.2PBS0.0lmol/L pH7.2PBS7 7、淋巴细胞分离液、淋巴细胞分离液8 8、丙酮、丙酮9 9、玻片、吸水纸、显微镜等、玻片、吸水纸、显微镜等第十二页，讲稿共二十二页哦实验步骤实验步骤1 1、无菌采集静脉血、无菌采集静脉血3ml/23ml/2人，注入盛有肝素的人，注入盛有肝素的无菌试管中（肝素浓度为无菌试管中（肝素浓度为20U/ml20U/ml全血），立全血），立即轻轻摇匀，使血液抗凝。即轻轻摇匀，使血液抗凝。2 2、用无菌吸管加入等体积即、用无菌吸管加入等体积即3ml3ml的室温的室温PBSPBS液，液，使血液等倍稀释。使血液等倍稀释。第十三页，讲稿共二十二页哦3 3、取、取10ml10ml试管试管2 2支，分别加入支，分别加入1.5ml1.5ml淋巴细胞分淋巴细胞分离液（离液（FicollFicoll），将离心管倾斜），将离心管倾斜4545 角，在距角，在距分层液界面上分层液界面上1cm1cm处将稀释血液沿试管壁缓慢处将稀释血液沿试管壁缓慢加至分层液上面，每管加至分层液上面，每管3ml3ml，注意保持两者界，注意保持两者界面清晰，勿使血液混入分层液内。面清晰，勿使血液混入分层液内。第十四页，讲稿共二十二页哦4 4、20002000转转/分离心分离心30min30min，离心后另取，离心后另取1 1只只10ml10ml试管，加入试管，加入6ml PBS6ml PBS液，用毛细吸管轻轻插液，用毛细吸管轻轻插到到白膜层白膜层，取吸淋巴细胞层至此试管中，取吸淋巴细胞层至此试管中，15001500转转/分离心分离心10min10min洗涤洗涤2 2次。次。5 5、第、第2 2次洗涤后弃去上清，用移液器将沉淀细次洗涤后弃去上清，用移液器将沉淀细胞和试管壁所剩胞和试管壁所剩PBSPBS液（约液（约200ul200ul）混匀，吸）混匀，吸取取20ul20ul细胞悬液于洁净载玻片上，制成涂片，细胞悬液于洁净载玻片上，制成涂片，自然干燥。自然干燥。第十五页，讲稿共二十二页哦6 6、纯丙酮、纯丙酮固定固定20min20min，双蒸水洗去多余丙酮，双蒸水洗去多余丙酮，自然干燥。自然干燥。7 7、在标本处滴加、在标本处滴加5%BSA5%BSA封闭液封闭液50ul50ul，室温封闭，室温封闭10min10min，甩去多余液体，不洗。，甩去多余液体，不洗。8 8、滴加鼠抗人、滴加鼠抗人CD3CD3单抗单抗50ul50ul，置湿盒中，置湿盒中3737作用作用1h1h。第十六页，讲稿共二十二页哦9 9、PBSPBS洗洗3 3次，每次次，每次2min2min，用吸水纸将细胞周围，用吸水纸将细胞周围擦干。擦干。1010、加、加B-B-山羊抗小鼠山羊抗小鼠IgGIgG抗体抗体50ul50ul，置湿盒中，置湿盒中3737作用作用20min20min。1111、重复、重复9 9。1212、加、加SABC 50ulSABC 50ul，置湿盒中，置湿盒中3737作用作用20min20min。1313、重复、重复9 9。第十八页，讲稿共二十二页哦1414、加、加DAB 50ulDAB 50ul，室温，室温10101313分钟，双蒸水洗。分钟，双蒸水洗。（DABDAB需现配现用，即将需现配现用，即将A A、B B、C C液各液各1 1滴加滴加入入1ml1ml双蒸水中混合）双蒸水中混合）1515、加苏木素染液复染、加苏木素染液复染30s30s。1616、加盖玻片镜检。、加盖玻片镜检。第十九页，讲稿共二十二页哦五、实验结果判定五、实验结果判定l阳性细胞染成棕黄色，阴性细胞为淡蓝紫阳性细胞染成棕黄色，阴性细胞为淡蓝紫色，计数色，计数100100个细胞，并计算出阳性细胞百个细胞，并计算出阳性细胞百分率。分率。l（流式参考：（流式参考：56567272）第二十页，讲稿共二十二页哦第二十一页，讲稿共二十二页哦感感谢谢大大家家观观看看第二十二页，讲稿共二十二页哦
