核酸的提取学习.pptx

第1页/共136页第一节基因组DNA的提取制备基因组DNA是研究基因结构和功能的重要步骤Southern分析基因文库.大分子量DNA通常要求达到片段的分子量100-200kb第2页/共136页高纯度且完整的RNA用途：Northern分析mRNA纯化cDNA合成体外转录.研究基因在转录水平上的调控的重要环节第3页/共136页1.核酸的含量第4页/共136页一、基本原理基本原理RNA在组织重含量：动物组织：1mg RNA/g 组织植物材料：含量低一些mRNA：15%rRNA：80%tRNA：7%第5页/共136页2.核酸的理化性质核酸的理化性质RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。第6页/共136页天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA及无机离子等，从中分离DNA。DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。第7页/共136页3、核酸制备的一般原则、核酸制备的一般原则分离纯化核酸总的原则：分离纯化核酸总的原则：应保证核酸一级结构的完整性；应保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。排除其它分子的污染。核酸纯化应达到的要求：核酸纯化应达到的要求：核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；有机溶剂和过高浓度的金属离子；其它生物大分子的污染应降低到最低程其它生物大分子的污染应降低到最低程度；度；排除其它核酸分子的污染。排除其它核酸分子的污染。第8页/共136页核酸制备的关键核酸制备的关键:1保持低温（04），缩短提取过程缩短提取过程2防止化学（过酸、过碱），避免机械（剧烈搅拌）降解。3防止核酸酶的作用。第9页/共136页4.核酸酶的抑制和抑制剂核酸酶的抑制和抑制剂降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。第10页/共136页DNase抑制加入少量金属离子螯合剂，如0.01mol/LEDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。第11页/共136页抑制RNase：（1）实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用具用0.1%二乙基焦碳酸盐（diethylpyrocarbonate,DEPC）处理。（2）加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。（3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等RNase的抑制剂。第12页/共136页核酸制备中常用的去垢剂核酸制备中常用的去垢剂核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：1溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；3对RNase、DNase有一定的抑制作用。如：如：SDS、脱氧胆酸钠、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、氨基水杨酸钠、萘萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠第13页/共136页核酸制备中常用的蛋白质变性剂核酸制备中常用的蛋白质变性剂 蛋白质变性剂的作用：蛋白质变性剂的作用：1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。分离除去，以防造成蛋白污染。2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。出核酸。3.某些蛋白质变性剂也有抑制某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性活性和破裂细胞的作用。和破裂细胞的作用。如：苯酚、氯仿、盐酸胍、如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC第14页/共136页核酸制备中常用的酶核酸制备中常用的酶 DNase RNase 蛋白酶蛋白酶K 溶菌酶溶菌酶 第15页/共136页5.核酸提取的一般过程核酸提取的一般过程破碎细胞破碎细胞破碎细胞破碎细胞提取提取提取提取纯化纯化纯化纯化I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中第16页/共136页1）材料的选择动物动物DNA的来源的来源（核（核DNA、线粒体、线粒体DNA、质粒质粒DNA）动植物中，小牛胸腺动植物中，小牛胸腺动物肝脏动物肝脏鱼类精子，鱼类精子，植物种子的胚中都含有丰富的植物种子的胚中都含有丰富的DNA RNA来源：来源：新鲜组织或细胞新鲜组织或细胞第17页/共136页2）破碎细胞）破碎细胞（防止核酸酶的作用）（防止核酸酶的作用）机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；化学试剂法：用化学试剂法：用SDS处理细胞；处理细胞；酶酶解解法法：加加入入溶溶菌菌酶酶或或蜗蜗牛牛酶酶，都都可可 使细胞壁破碎。使细胞壁破碎。微生物微生物：溶菌酶、：溶菌酶、SDS裂解。裂解。高等植物高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。：捣碎器破碎、液氮研磨。酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。动物动物：液氮处理后用匀浆器破碎。：液氮处理后用匀浆器破碎。细胞器细胞器DNA：首先纯化细胞器。：首先纯化细胞器。以上处理时均要同时加入核酸酶抑制以上处理时均要同时加入核酸酶抑制第18页/共136页3）破碎抽提核酸除去杂质）破碎抽提核酸除去杂质 1首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白、与其它成分分离病毒的核蛋白、与其它成分分离 2使核酸与蛋白质分离使核酸与蛋白质分离 3除去脂类除去脂类 4多糖的除去多糖的除去第19页/共136页4）核酸的纯化）核酸的纯化根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染染,并除去提取过程中的系列试剂并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。第20页/共136页5）核酸样品的保存）核酸样品的保存核酸保存的主要条件是核酸保存的主要条件是温度温度和和介质介质 温度温度：4（5）最佳和最简单）最佳和最简单 -70是长期保存的良好温度，为一次性保存是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20保存保存 保存介质保存介质：TE缓冲溶液缓冲溶液(最常用最常用)10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 水水第21页/共136页6.基因组DNA的常用提取方法CTAB法SDS法其他第22页/共136页一、基因组DNA-CTAB法（1）CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液（Nacl0.7mol/L）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。第23页/共136页CTAB提取缓冲液的经典配方（2）试剂的作用Tris-Hcl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；Nacl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离第24页/共136页第25页/共136页氯仿还可加速有机相与水相的分层。异戊醇：抑制界面泡沫的形成。交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，更有效去除蛋白质。标准程序：酚酚-氯仿氯仿。第26页/共136页PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效地去除多酚，减少DNA中酚的污染，同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。第27页/共136页（3）CTAB法流程图第28页/共136页二、基因组DNA-SDS法（1）原理SDS是一种阴离子蛋白质变性剂，在高温(55-65）条件下能裂解细胞细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸。第29页/共136页提高盐(KAc或NH4Ac）浓度并降低温度(冰浴)，使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀。上清液用酚/氯仿反复抽提除去蛋白质，再用乙醇沉淀水相中的DNA。然后用RNase酶除去RNA即可得到较纯的DNA.第30页/共136页 rRNA tRNARnaseProteinase K酚/氯仿mRNA protein 异硫氰酸胍 SDSDNADnaseMg2+1）防止和抑制内源Dnase对DNA的降解；只需加入一定浓度的螯合剂如EDTAEDTA，因为几乎所有Dnase 都需要Mg2+或Mn2+为辅助因子。DNA提取方法很多，实验采用酚抽提法。其基本原理是超低温粉碎，通过蛋白酶K和SDS消化，破碎细胞，再用酚/氯仿去除蛋白质。2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。在操作过程中尽量减弱溶液的涡旋，动作要轻柔，进行DNA溶液转移时用大口吸管。第31页/共136页SDS法DNA提取缓冲液第32页/共136页（2）SDS法流程图（以动物组织为例）第33页/共136页三、基因组DNA-其他方法根据细胞裂解方式的不同有：物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法。化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法。生物方式：酶法。第34页/共136页根据核酸分离纯化方式的不同有：吸附材料结合法：硅质材料高盐低PH值结合膜，低盐高PH值洗脱。快速高效。阴离子交换树脂低盐高PH值结合核酸，高盐低PH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。磁珠磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。第35页/共136页浓盐法利用RNP和DNP在盐溶液（1M氯化纳中溶解度不同，将二者分离。有机溶剂抽提法：有机溶剂（苯酚）作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用，蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。密度梯度离心法利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物DNP在NaCl中的溶解度第36页/共136页质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法第37页/共136页细胞器DNA-差速离心法线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，他们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离出来。第38页/共136页举例（提取细菌的DNA）第39页/共136页一、试验的实验试剂及仪器1.试剂溶液I（50mm/L，glucose，25mmol/L，tris0HCl，pH8.0，10mmol/LEDTA）溶菌酶（100mg/ml），蛋白酶K（10mg/ml）酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）3M醋酸钠无水乙醇含RNaseA（10mg/ml）的TE，LB培养基，70%乙醇2.仪器超净工作台，微量取液器，高速冷冻离心机，台式离心机，水浴锅，冰箱，制冰机，恒温摇床，漩涡震荡仪，烘箱，电泳仪第40页/共136页二、材料、设备及试剂二、材料、设备及试剂菌种菌种：DBT降解菌设备设备：eppendorf管、微量取液器(20l,200l,1000l)，台式高速离心机，涡旋振荡器试剂：试剂：LB液体培养基、裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH8.0）、5MNaCl、Tris-饱和酚、氯仿、RNA酶A、无水乙醇第41页/共136页三、操作步骤三、操作步骤1、1.5ml菌液（每组两管）412000rpm离心30sec，弃去上清，倒置试管于吸水纸上吸干。2、每管加入400l裂解液，用移液枪枪头反复抽吸辅助裂解，37水浴30min。3、每管加入132l的5MNaCl溶液，颠倒试管，充分混匀后，13000rpm离心15min。用粗口的枪头（用剪刀剪去1ml枪头的尖端）小心取出上清液转倒两支新的eppendorf管中。4、加入等体积的饱和苯酚/氯仿，充分混匀后，12000rpm离心3min，离心后的水层如混浊则说明仍含有蛋白质，则需将上清液转入新的试管，重复上述步骤直到水层透明，水层和酚层之间不再白色沉淀物为止（约2次）。第42页/共136页5、将上层清液转入新的eppendorf管，加等体积的氯仿，混匀后13000rpm离心3min，除去苯酚。6、小心吸出上清液转入新的eppendorf管，用预冷的两倍体积的无水乙醇沉淀，放置20冰箱30min，然后13000rpm离心15min，可见白色丝状沉淀物。7、小心吸出液体，弃上清液，用预冷的400l70乙醇洗涤2次，室温干燥后，用50lTE（含20g/ml的Rnase）溶解DNA，20冰箱放置备用。第43页/共136页第44页/共136页第45页/共136页第46页/共136页电泳琼脂糖电泳，采用0.8%的琼脂糖，0.5TBE缓冲液，100V电泳10min，观察电泳谱带。第47页/共136页四、实验的结果第48页/共136页7.注意事项注意事项（1 1）细胞裂解）细胞裂解）细胞裂解）细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，导致材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，量少，纯度低纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡第49页/共136页注意事项注意事项（2 2）核酸分离、纯化）核酸分离、纯化）核酸分离、纯化）核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相时，应提供相应的缓冲体系应的缓冲体系采用有机（酚采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法去杂质的方法第50页/共136页注意事项注意事项（3 3）核酸沉淀、溶解）核酸沉淀、溶解）核酸沉淀、溶解）核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀会更充分沉淀时加入沉淀时加入1/10体积的体积的NaAc（pH5.2，3M），有），有利于充分沉淀利于充分沉淀沉淀后应用沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥），让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用若长期储存建议使用TE缓冲液溶解缓冲液溶解TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNasepH值为值为8.0，可防止，可防止DNA发生酸解发生酸解 第51页/共136页1.1.DNADNA中含有蛋白、中含有蛋白、多糖、多酚类杂质多糖、多酚类杂质2.2.DNADNA在溶解前，有在溶解前，有酒精残留，酒精抑酒精残留，酒精抑制后续酶解反应制后续酶解反应3.3.DNADNA中残留有金属中残留有金属离子离子1.1.重新纯化重新纯化DNADNA，去，去除蛋白、多糖、多酚除蛋白、多糖、多酚等杂质等杂质2.2.重新沉淀重新沉淀DNADNA，让，让酒精充分挥发酒精充分挥发3.3.增加增加7070乙醇洗涤的乙醇洗涤的次数（次数（2-32-3次）次）8.DNA8.DNA8.DNA8.DNA提取常见问题提取常见问题提取常见问题提取常见问题q问题一：问题一：DNADNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCRPCR反应。反应。原因原因对对策策第52页/共136页1.1.材料不新鲜或反复冻材料不新鲜或反复冻融融2.2.未很好抑制内源核酸未很好抑制内源核酸酶的活性酶的活性3.3.提取过程操作过于剧提取过程操作过于剧烈，烈，DNADNA被机械打断被机械打断4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反复冻融反复冻融1.1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融免反复冻融2.2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液前加入裂解缓冲液3.3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料在提取内源核酸酶含量丰富的材料的的DNADNA时，可增加裂解液中螯合剂时，可增加裂解液中螯合剂的含量的含量4.4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌温灭菌6.6.将将DNADNA分装保存于缓冲液中，避免分装保存于缓冲液中，避免反复冻融反复冻融q问题二：问题二：DNADNA降解降解对对策策原原因因第53页/共136页1.1.实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全4.4.洗涤时洗涤时DNADNA丢失丢失1.1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材尽量选用新鲜（幼嫩）的材料料2.2.动植物要匀浆研磨充分；动植物要匀浆研磨充分；G G菌、酵母裂解前先用生物酶菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁或机械方式破壁3.3.高温裂解时，时间适当延长高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增（对于动物细胞、细菌可增加加PKPK的用量）的用量）4.4.低温沉淀，延长沉淀时间低温沉淀，延长沉淀时间5.5.加辅助物，促进沉淀加辅助物，促进沉淀6.6.洗涤时，最好用枪头将洗涤洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒液吸出，勿倾倒q问题三：问题三：DNADNA提取量少提取量少对对策策原原因因第54页/共136页q问题四：问题四：DNA断裂为小片段断裂为小片段1.机械张力或高温2.细胞内源DNA酶的作用3.化学因素也会降解DNA如过酸的条件下1.动作轻缓，避免过多的溶液转移，剧烈的震荡等。同时也应避免过高的温度，所用的枪头口不能太小(孔径有5mm左右)。2.在溶液中加入EDTA，SDS以及蛋白酶等。3.应避免使用过酸的条件。尽量减少酚/氯仿抽提，对对策策原原因因第55页/共136页思考1简要叙述酚氯仿抽提体系后出简要叙述酚氯仿抽提体系后出现的现象及其成因。现的现象及其成因。2.沉淀时为什么要用无水乙醇？沉淀时为什么要用无水乙醇？3.为了获得较为完整的基因组在实验中应注意什么问题？4.加NaCL的作用，为什么要加到1mol/L?第56页/共136页一、质粒一、质粒(Plasmid)(Plasmid)的概念：的概念：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链因子。是一种环状的双链DNADNA分子。分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。在细菌细胞中最多。质粒（质粒（plasmid）大小在）大小在1kb200kb之间，结构简单，大之间，结构简单，大多是具有双链闭合环状结构的多是具有双链闭合环状结构的DNA分子，通常以超螺旋状态分子，通常以超螺旋状态存在于许多细菌和酵母菌中。存在于许多细菌和酵母菌中。第二节质粒的提取第57页/共136页第58页/共136页DNA超螺旋结构超螺旋结构质粒具有不相容性，两种不同的质粒不能质粒具有不相容性，两种不同的质粒不能共存在同一个宿主细胞中。质粒可在细胞共存在同一个宿主细胞中。质粒可在细胞间传递，其在胞内的存在一般对宿主细胞间传递，其在胞内的存在一般对宿主细胞的代谢活动无影响。的代谢活动无影响。第59页/共136页11共价闭合环行共价闭合环行DNADNA（cccDNA,SCcccDNA,SC构型构型)两条多核苷酸链均保持着完整环形结构,呈现超螺旋的；22开环开环DNADNA（ocDNA,OCocDNA,OC构型）构型）两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口；33线性分子（线性分子（LDNA,LDNA,通称通称L L构型构型)双链断裂，在体内，质粒DNA是以超螺旋构型存在的。二、质粒的构型：第60页/共136页第61页/共136页L构型松弛线性的 DNAOC构型松弛开环的 DNASC构型共价闭合环形的超螺旋DNA(cccDNA)连接连接单链切割单链切割第62页/共136页在电场中，在中在电场中，在中性性pHpH值下，带负值下，带负电荷的电荷的DNADNA向阳向阳极迁移，其迁移极迁移，其迁移速率与其分子大速率与其分子大小、构型、电压、小、构型、电压、胶浓度有关。胶浓度有关。OC构型SC构型L构型 质粒质粒DNADNA琼脂糖凝胶电泳模式图琼脂糖凝胶电泳模式图质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。第63页/共136页1.1.提纯的思路提纯的思路质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA杂质：蛋白：加蛋白质变性剂（酚、氯仿）沉淀蛋白基因组DNA：碱变性+酸复性，分子量差异导致复性差异脂类及小分子杂质RNA：pH和Rnase三、提取质粒的原理第64页/共136页2.细菌裂解的方法：碱裂解法0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。第65页/共136页选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求第66页/共136页3.碱裂解法质粒DNA较染色体DNA小，且具有超螺旋闭合环状的特点。碱变性条件下，染色体DNA双螺旋解开而变性，而质粒DNA部分解开，双链不会完全分离。pH调至中性，变性的质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中，而染色体DNA不能复性，与蛋白质一起沉淀。第67页/共136页染色体双链完全分开质粒DNA为拓扑缠绕态不能分开线状染色体DNA难复性迅速准确配对，恢复天然超螺旋分子染色体、变性蛋白质、RNA分子一起沉淀上清中SDS、加溶液II(氢氧化钠)破坏碱基配对加溶液(醋酸)中和碱性NaOH离心染色体染色体染色体染色体试剂试剂试剂试剂质粒质粒质粒质粒第68页/共136页4.煮沸法染色体DNA比质粒DNA大得多。当加热时，染色体DNA发生变性呈长线状不易复性，质粒DNA虽也变性但在冷却时即恢复其天然构象。变性长线状染色体DNA易与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。第69页/共136页四、碱裂解法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)第70页/共136页剧烈振荡新鲜配制1.实验流程第71页/共136页第72页/共136页第73页/共136页q碱裂解法流程图对数期菌体对数期菌体溶液溶液IIIIII中和中和溶液溶液I I充分重悬充分重悬溶液溶液IIII裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶液第74页/共136页（一）细菌培养与质粒扩增 1.挑单克隆E.coli菌株接种到斜面培养基上（活化菌种），37过夜培养 2.从斜面培养基上挑E.coli菌株，接种于25毫升液体培养液内（含氨苄青霉素），37振荡过夜培养 3.从中取4毫升种子菌液于含M9培养基中（含Ap），37振荡培养3-4小时（OD6001.0）第75页/共136页（二）质粒提取1.取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中，12000r/min，4，30sec2.吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥3.将细菌沉淀悬浮于100l预冷的溶液I中，剧烈振荡4.加200L溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf管，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上第76页/共136页5.加入150L溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min 6.12000r/min，离心5min，将上清夜转至另一Eppendorf管中 7.向上清夜加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置5-10min。12000r/min离心5min。倒去上清夜，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体 8.用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清夜，真空抽干或空气中干燥 9.50L TE缓冲液，使DNA完全溶解（-20保存）第77页/共136页2.各种溶液成分和作用溶液I（溶菌液）50mM葡萄糖25mMTris-Cl10mMEDTA，pH8.0；水浴pH8.0剧烈震荡10分钟溶液粘稠浑浊第78页/共136页溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解细胞壁肽聚糖中的-1,4糖苷键。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA：（1）螯合金属离子，抑制Dnase的活性（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。第79页/共136页溶液II（NaOHSDS液）0.2NNaOH1%SDS；现配现用切勿振荡！颠倒混匀T5分钟SDS包被第80页/共136页NaOH：当5pH9时，核酸是稳定的。但当pH12或pH3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1L，pH=12.6，DNA与质粒DNA的变性。SDS：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-R-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制Rnase，必须把它去除干净，第81页/共136页溶液III，（3molLNaAc（pH4.8）溶液）3M醋酸钠2M醋酸第82页/共136页溶液III用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3molLNaAc有利于变性染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀。Na+中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。第83页/共136页五、注意事项五、注意事项1.材料准备材料准备使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）菌不能太老，因为衰老期的菌体其内源性菌不能太老，因为衰老期的菌体其内源性DNaseDNase的释入，使得不易提的释入，使得不易提取质粒，但是菌体数太低质粒将太少。取质粒，但是菌体数太低质粒将太少。培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）第84页/共136页2.细胞裂解细胞裂解菌体量适当。培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断。复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染。G菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁。第85页/共136页3.核酸分离、纯化核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法第86页/共136页4.核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解第87页/共136页1.1.菌体老化菌体老化2.2.碱裂解不充分碱裂解不充分3.3.菌体中无质粒菌体中无质粒4.4.溶液使用不当溶液使用不当1.1.请涂布平板培养后，重新挑请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养选新菌落进行液体培养2.2.可减少菌体用量或增加溶液可减少菌体用量或增加溶液的用量的用量3.3.不要频繁转接，每次接种时不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素应接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。使用浓度是否正确。4.4.溶液溶液在温度较低时可能出在温度较低时可能出现浑浊，置于现浑浊，置于3737保温片刻保温片刻直至溶解为清亮的溶液直至溶解为清亮的溶液。六、质粒六、质粒DNA提取常见问题提取常见问题q问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？原因原因对对策策第88页/共136页1.1.混有蛋白混有蛋白2.2.混有混有RNARNA3.3.混有基因组混有基因组DNADNA1.1.不要使用过多菌体。重新纯化不要使用过多菌体。重新纯化DNADNA，去除蛋白、多糖、多酚，去除蛋白、多糖、多酚等杂质等杂质2.2.加入加入RNaseARNaseA室温放置一段时间室温放置一段时间3.3.加入溶液加入溶液II II 和和IIIIII后后防止剧烈振荡，防止剧烈振荡，可能把基因组可能把基因组DNADNA剪切成碎片剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和时间过长会导致细胞和DNADNA的的降解，培养时间不要超过降解，培养时间不要超过1616小小时。时。六、质粒六、质粒DNA提取常见问题提取常见问题q问题二：质粒纯度不高，如何解决？原原 因因对对策策第89页/共136页1.简要叙述溶液、溶液和溶液的作用，以及实验中 分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因。2.染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？七、问题与讨论第90页/共136页第三节RNA的提取RNA：tRNA15%，mRNA5%，rRNA80%第91页/共136页RNADNA第92页/共136页RNARNA1.RNA不稳定的原因：RNARNA分子可自发水解分子可自发水解分子可自发水解分子可自发水解:特别在碱性条件下很容易通过2-OH形成2、3磷酸二酯（环），即使无Rnase存在，RNA在溶液中的稳定性也很低。RnaseRnase对对对对RNARNA的降解作用的降解作用的降解作用的降解作用:2-OH，且不需要二价金属离子的参与。Rnase为较小的单链蛋白（约220AA），尤其是含有较多的二硫键（4对），10020min不会失活，高压灭菌也不能使之变性。一、去除Rnase方法第93页/共136页RNA组织（样品）灰尘实验器皿试剂人体汗液皮肤手指唾液 Rnase分布广泛：第94页/共136页RNA2.消除消除Rnase的活性方法：的活性方法：（1 1）对于外源）对于外源RnaseRnase：器皿和材料器皿和材料塑料器皿（如离心管、Tip头、eppendorf管）其它不能用高温烤的材料。DEPCDEPC（焦碳酸二乙酯）：（焦碳酸二乙酯）：0.1%DEPC水37浸泡2小时以上，并经高压灭菌；碘乙酸水溶液碘乙酸水溶液氯仿氯仿第95页/共136页RNA玻璃器皿：200干烤6-12 h器皿和材料器皿和材料第96页/共136页RNA加入DEPC至 0.1%浓度然后剧烈振荡20min或室温过夜煮沸15min或高压灭菌以消除残余的DEPC试试剂剂否则DEPC与腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。DEPC是Rnase的化学修饰剂，它与Rnase的活性基团组氨酸咪唑环反应而抑制Rnase的活性。第97页/共136页RNA（2 2）对于内源）对于内源RnaseRnase：根据实验特点采用不同方法：如体外转录等实验中加入Rnase的专一抑制剂(Rnasin)：对于RNA的分离制备可采用非特异的蛋白变性剂、蛋白酶K、阴离子去污剂。第98页/共136页二、实验原理细胞内RNA均与蛋白质结合在一起，并且多以核蛋白的形式存在。制备RNA时，必须使RNA与蛋白解离，并除去蛋白质。由于RNA的种类来源和存在形式不同，所用的制备方法各异，一般常用的方法有，盐酸胍法，去污剂法和苯酚法。第99页/共136页异硫氰酸胍/苯酚法（Trizol法）原理a.裂解细胞：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；b.沉淀Pro等杂质：有机溶剂抽提，交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，更有效去除蛋白质。多糖如何去除？多糖如何去除？第100页/共136页q多糖的去除：多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/21/2体体积的积的5M NaCl5M NaCl，高盐可溶解多糖。，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2(1/2体积体积)，氯苯可，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。用用聚乙二醇或异丙醇聚乙二醇或异丙醇代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNADNA。多酚如何去除多酚如何去除第101页/共136页q多酚的去除：多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如加入易与酚类结合的试剂：如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇)，它，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNADNA的结合的结合q盐离子的去除：盐离子的去除：7070的乙醇洗涤的乙醇洗涤第102页/共136页如何去除DNA？第103页/共136页c.分离DNA与RNA：释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；在与组织/细胞匀浆后加氯仿分相时，如果pH5.2，则DNA会部分分配在水相，Trizol的成分主要是异硫氰酸胍，-巯基乙醇等RNase的抑制剂+十二烷基肌氨酸钠等表面活性剂+乙酸饱和酚和pH缓冲成分NaAc，整个试剂的pH在44.5之间原理关键第104页/共136页氯仿的作用:一是作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀,同时也通过变性作用抑制RNase活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚），苯酚微溶于水，抽提烷之后水相里有痕量的酚，氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等）第105页/共136页d.沉淀RNA，核酸与钠、钾、镁形成的盐在许多有机溶剂中不溶，也不会变性.多糖，蛋白等不沉淀，(一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯粹的异丙醇，可以大大降低多糖残留)有机溶剂：乙醇、异丙醇、聚乙二醇。乙醇、异丙醇沉淀核酸的区别？第106页/共136页异丙醇0.6V1V就够了，乙醇需要至少2V，一般需要2.5倍体积。异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。这可以最大程度的降低盐的共沉淀降，第107页/共136页多次用75%乙醇洗涤的目的？第108页/共136页洗涤目的：洗涤目的：去除盐离子去除盐离子 去除残存的有机溶剂和水去除残存的有机溶剂和水第109页/共136页