(用)动物细胞培养和核移植技术.ppt
专题专题2.22.2动物细胞工程动物细胞工程动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体制备单克隆抗体制备细胞核移植细胞核移植动物动物细胞细胞工程工程技术技术动物细胞工程的动物细胞工程的基础基础2.2.1动物细胞培养和核移植技术动物细胞培养和核移植技术（一）、概念（一）、概念 是指从动物机体内取出是指从动物机体内取出相关相关的组织，的组织，将它分散成将它分散成单个细胞单个细胞，然后放在，然后放在适宜的适宜的培养基中，让这些细胞培养基中，让这些细胞生长生长和和增殖增殖。（二）、原理（二）、原理细胞分裂增殖细胞分裂增殖动物动物胚胎胚胎或或幼龄幼龄动动物的组织、器官物的组织、器官胰蛋白酶胰蛋白酶剪碎剪碎单个细胞单个细胞加培养液加培养液制成制成细胞细胞悬液悬液培养瓶培养瓶中培养中培养部分细胞部分细胞“癌变癌变”，无限传代，无限传代动物细胞培养不能动物细胞培养不能最终培养成动物体最终培养成动物体50代细胞代细胞原原代代培培养养传代培养传代培养贴贴壁壁生生长长接接触触抑抑制制剥离、分瓶剥离、分瓶细胞株此时细胞株此时遗传物质没遗传物质没有改变有改变细胞细胞细胞系遗传细胞系遗传物质改变物质改变2.动物细胞培养过程：动物细胞培养过程：增殖能力强，分裂旺盛，分化增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养程度低，容易培养去掉组织间去掉组织间蛋白蛋白归纳归纳过程过程取取 的组织、器官的组织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液 酶酶 贴满瓶壁的细胞贴满瓶壁的细胞单个细胞单个细胞加入加入 液液动物胚胎或幼龄动物动物胚胎或幼龄动物胰蛋白胰蛋白培养培养接触抑制接触抑制原代原代 培养培养1-10代细胞代细胞遗传物质遗传物质 改变改变原代细胞原代细胞培养培养加加 液液4050代细胞代细胞(细胞株细胞株)未未遗传物质遗传物质 改变改变无限传代（无限传代（细胞系细胞系）已已传代传代培养培养胰蛋白胰蛋白 酶酶 3、动物细胞培养过程中几个重要的概念、动物细胞培养过程中几个重要的概念（1）细胞贴壁：）细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上（单层单层）。要求：）。要求：培养瓶或培养皿的内表面培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。光滑、无毒、易于贴附。（2）接触抑制：）接触抑制：当贴壁细胞分裂生长当贴壁细胞分裂生长到到表面相互接触时表面相互接触时，细，细胞就会停止分裂增殖，胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接这种现象称为细胞的接触抑制。触抑制。动物细胞培养特点动物细胞培养特点：贴壁生长、接触抑制：贴壁生长、接触抑制：(3)原代培养(primary culture)定义：定义：指将要培养的动物细胞取出后，先用指将要培养的动物细胞取出后，先用胰蛋白酶胰蛋白酶等使组织分散成单个细胞，然后配等使组织分散成单个细胞，然后配制成一定浓度的制成一定浓度的细胞悬液细胞悬液，再将该悬液放入，再将该悬液放入培养瓶中培养瓶中培养。培养。过程：从动物机体中取出组织过程：从动物机体中取出组织 剪碎剪碎 加胰蛋白酶加胰蛋白酶 细胞游离细胞游离 制成细胞悬液制成细胞悬液 将细胞将细胞接种到培养瓶内接种到培养瓶内 培养（培养（1-21-2天换一天换一次培养液）次培养液）细胞贴壁生长细胞贴壁生长 长成单层细长成单层细胞胞定义：定义：当原代培养的当原代培养的细胞生长停止细胞生长停止，这，这时如果要使细胞继续生长，就要及时用时如果要使细胞继续生长，就要及时用胰蛋白酶胰蛋白酶等等，使细胞从瓶壁上解离下来，使细胞从瓶壁上解离下来，然后加入新的培养液，将然后加入新的培养液，将细胞分离稀释，细胞分离稀释，并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内，并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内，这个过程称传代培养这个过程称传代培养(4)传代培养(subculture)（5 5）细胞株：细胞株：从原代培养细胞群中筛选出进行传代培从原代培养细胞群中筛选出进行传代培养的细胞，能传到养的细胞，能传到40-5040-50代，其代，其遗传物质没有遗传物质没有发生变化。发生变化。细胞系：细胞系：传到传到40-5040-50代后有代后有部分细胞遗传物质发生部分细胞遗传物质发生了变化了变化，带有癌变的特点，可能在培养条件下，带有癌变的特点，可能在培养条件下无限制的传代下去，这种传代细胞称为细胞系。无限制的传代下去，这种传代细胞称为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。容易传代培养。细胞悬细胞悬浮液浮液培养瓶培养瓶中培养中培养5050代代细胞细胞无限传无限传代代原代培养原代培养传代培养传代培养细胞株细胞株细胞系细胞系各个新名词之间的联系各个新名词之间的联系多数组织细胞固定在表面多数组织细胞固定在表面生长和分裂。生长和分裂。随细胞增多，细胞接触就会停止分裂增殖随细胞增多，细胞接触就会停止分裂增殖遗传物质改变遗传物质改变思考题：思考题：1 1、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？做动物细胞培养材料？2 2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？因为这些组织或器官，分裂能力旺盛，易于培养。因为这些组织或器官，分裂能力旺盛，易于培养。成块组织使细胞靠在一起限制了细胞的生长和成块组织使细胞靠在一起限制了细胞的生长和增殖，且细胞不能与培养液充分接触，不利于增殖，且细胞不能与培养液充分接触，不利于培养。培养。3、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？的物质是什么成份？催化蛋白质水解。细胞间的物质主要是蛋催化蛋白质水解。细胞间的物质主要是蛋白质白质(胶原蛋白等胶原蛋白等)。4、细胞膜的主要成份是什么？、细胞膜的主要成份是什么？蛋白质和磷脂蛋白质和磷脂5、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？能能6 6、既然、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉胰蛋白酶能将细胞消化掉，那，那将动物组将动物组织分散成单个细胞要织分散成单个细胞要注意什么问题呢？注意什么问题呢？7 7、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？注意时间的控制注意时间的控制 不能，因为两者的最适不能，因为两者的最适PHPH不同，不同，用动物细胞用动物细胞培养适宜的培养适宜的PH为为7.27.4，此环境下胃蛋白酶，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性的活性较高。较高。1、无菌、无毒的环境、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液）（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2、营养、营养 （葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清、微量元素等清、微量元素等）3、温度和、温度和PH 温度温度36.5+0.5度，pH7.27.44、气体环境、气体环境 O2和和CO2（95%空气和空气和5%CO2）4、动物细胞培养条件、动物细胞培养条件保证细胞顺利保证细胞顺利的生长增殖的生长增殖离体培养的细胞对离体培养的细胞对微生物和有毒物质微生物和有毒物质没有防御能力没有防御能力5 5、动物细胞培养技术的应用、动物细胞培养技术的应用（1 1）生产蛋白生物制品：）生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体单克隆抗体等。等。（4 4）用于）用于检测有毒物质检测有毒物质（3 3）获得大量自身的）获得大量自身的皮肤细胞皮肤细胞，用于植皮。，用于植皮。（5 5）用于生理、病理、药理等方面的研究，）用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据为治疗和预防疾病提供理论依据（2 2）作为基因工程的受体细胞）作为基因工程的受体细胞获得细胞获得细胞细胞的全能性细胞的全能性细胞株、细胞系细胞株、细胞系植物体植物体培养结果培养结果或细胞分泌蛋白或细胞分泌蛋白快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株等无病毒植株等培养目的培养目的葡萄糖、动物血清葡萄糖、动物血清促生长因子促生长因子蔗糖、植物激素蔗糖、植物激素培养基特有成分培养基特有成分液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基培养基性质培养基性质细胞增殖细胞增殖原理原理动物细胞培养动物细胞培养植物组织培养植物组织培养比较项目比较项目6 6、植物细胞和动物细胞培养的比较、植物细胞和动物细胞培养的比较本节内容小结本节内容小结1、动物细胞培养过程涉及的概念、动物细胞培养过程涉及的概念 细胞贴壁、细胞的接触抑制、原代培养、细胞贴壁、细胞的接触抑制、原代培养、传代培养、细胞株、细胞系传代培养、细胞株、细胞系3 3、植物细胞和动物细胞培养的比较、植物细胞和动物细胞培养的比较4 4、动物细胞培养技术的应用、动物细胞培养技术的应用2、动物细胞培养条件、动物细胞培养条件（一）、动物细胞核移植的概念：（一）、动物细胞核移植的概念：动物核移植是将动物的一个细胞的动物核移植是将动物的一个细胞的细胞细胞核核,移入一个已经去移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞掉细胞核的卵母细胞中中.使其重组并发育成一个新的胚胎使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的这个新的胚胎最终发育为动物个体胚胎最终发育为动物个体.克隆动物：用核移植的方法得到的动物。克隆动物：用核移植的方法得到的动物。原理：体细胞核的全能型原理：体细胞核的全能型（二）、分类：（二）、分类：胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植：体细胞核移植体细胞核移植：细胞分化程度低，恢复细胞分化程度低，恢复全能性容易全能性容易 细胞分化程度高，恢复细胞分化程度高，恢复全能性困难全能性困难供体细胞供体细胞（供核）（供核）细胞培养细胞培养体细胞体细胞 卵巢卵母细胞卵巢卵母细胞（MM中期：供质）中期：供质）去核去核无核卵无核卵母细胞母细胞注入注入电激使电激使两细两细 胞胞融合融合重重组组细细胞胞构建重组构建重组胚胎胚胎胚胎胚胎移植移植代孕代孕母体母体生出与供体奶生出与供体奶牛遗传基本相牛遗传基本相同的牛犊同的牛犊归纳归纳:1.1.共分成两大阶段：共分成两大阶段：核移植核移植和和胚胎移植胚胎移植2.2.取减数第二次分裂中期的卵细胞作受体细胞的取减数第二次分裂中期的卵细胞作受体细胞的原因原因是是:它是最大的细胞它是最大的细胞,易操作易操作,它发育可直接表达性状它发育可直接表达性状3.3.严格来说新个体有卵巢母细胞的细胞质，所以有严格来说新个体有卵巢母细胞的细胞质，所以有两两个亲本个亲本的性状的性状1.核移植的受体核移植的受体细胞是什么？胞是什么？处在什么在什么时期？期？2.通通过什么手段激活受体什么手段激活受体细胞，胞，构建重构建重组胚胎？胚胎？细胞核细胞核移植移植早期胚胎早期胚胎卵裂卵裂C母绵羊子宫母绵羊子宫胚胎移植胚胎移植多莉羊多莉羊分娩分娩妊娠妊娠融合后的卵母细胞融合后的卵母细胞电脉冲刺电脉冲刺激激卵母细胞卵母细胞黑面母绵羊黑面母绵羊白面母绵羊白面母绵羊乳腺细胞乳腺细胞细胞质细胞质细胞核细胞核（M卵母细胞）卵母细胞）减数第二次分裂中期减数第二次分裂中期去核的卵母细胞去核的卵母细胞供体细胞注入供体细胞注入去核卵母细胞去核卵母细胞受体细胞激活，受体细胞激活，完成减数分裂、完成减数分裂、发育发育胚胎移植胚胎移植(二二)、体细胞核移植的过程：、体细胞核移植的过程：请看教材请看教材P48P48图图2-212-21思考：思考：1.1.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？用此细核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？用此细胞作为受体细胞有什么好处？胞作为受体细胞有什么好处？2.2.通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？M M中期卵母细胞中期卵母细胞诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。细胞分裂和发育进程。卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物质丰富，卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物质丰富，提供早期胚胎发育所需的营养；含有激活细胞核体提供早期胚胎发育所需的营养；含有激活细胞核体现全能性的物质。现全能性的物质。为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。胞的遗传物质去掉或将其破坏。3.3.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？核？4.4.用于核移植的供体细胞一般都选用传代用于核移植的供体细胞一般都选用传代1010代以内的细胞，想一想，这是为什么？代以内的细胞，想一想，这是为什么？培养的动物细胞一般当传代至培养的动物细胞一般当传代至10105050代左右代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而物质可能会发生突变，而1010代以内的细胞一般能代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代用传代1010代以内的细胞。代以内的细胞。四、体细胞核移植技术的应用前景四、体细胞核移植技术的应用前景 1、加速家畜遗传改、加速家畜遗传改良进程，促进优良良进程，促进优良畜群繁育畜群繁育2、保护濒危物种，、保护濒危物种，增加存活数量增加存活数量3、克隆动物作为生、克隆动物作为生物反应器，生产医用物反应器，生产医用蛋白蛋白4、可以作为异种移、可以作为异种移植的供体，可以用于植的供体，可以用于组织器官的移植组织器官的移植（五）、体细胞核移植技术存在的问题（五）、体细胞核移植技术存在的问题 1、克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚。、克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚。2、克隆技术效率低，畸形率高、死亡率高、易出、克隆技术效率低，畸形率高、死亡率高、易出 现早衰等问题。现早衰等问题。3、生产克隆动物费用昂贵。、生产克隆动物费用昂贵。知识点小结知识点小结动物体细胞核移植技术和克隆动物动物体细胞核移植技术和克隆动物1.克隆动物的概念克隆动物的概念2.体细胞核移植技术的过程体细胞核移植技术的过程3.体细胞核移植技术的应用前景体细胞核移植技术的应用前景4.体细胞核移植技术存在的问题体细胞核移植技术存在的问题4 4、一般说来，动物细胞体外培养需要满足以下条件（、一般说来，动物细胞体外培养需要满足以下条件（）无毒的环境无毒的环境 无菌的环境无菌的环境 培养基需要加入血培养基需要加入血清清 温度与动物体温相似温度与动物体温相似 需要需要O O2 2，不需要，不需要COCO2 2 COCO2 2能调节培养液能调节培养液PHPHA A、B B、C C、D D、D D5 5、动物细胞培养的特点、动物细胞培养的特点 （）细胞贴壁细胞贴壁 有丝分裂有丝分裂 细胞分化细胞分化 接触抑制接触抑制 减数分裂减数分裂A A、B B、C C、D D、A A
