时间分辨荧光技术TRFIA技术培训资料.pptx
标记免疫技术的检测水平标记免疫技术的检测水平放射免疫（精度：10-12mol/L）酶联免疫（精度：10-9 mol/L）化学发光（精度：10-15mol/L）电化学发光（精度：10-17mol/L）时间分辨荧光（精度：10-18mol/L）第1页/共48页放射性免疫分析法（放射性免疫分析法（RIARIA）应应 用用放免自60年代问世以来对临床诊断起了革命性的贡献，是一项较为成熟的诊断技术。夹心法、竞争法的标记原理为以后的检测技术的发展奠定了基础。问问 题题放射性（125 I），对环境的污染及对身体的危害125125 I 的半衰期短而导致其试剂有效期短被标记物的稳定性差操作繁琐，费时无法保存备用第2页/共48页酶免疫分析法（酶免疫分析法（ELISAELISA）应应 用用酶免的最大优势在于避免了对环境和人体危害试剂有效期较长曾经一度被认为是取代放免的检测手段问问 题题灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性不好第3页/共48页化学发光免疫分析法化学发光免疫分析法（chemiluminescent chemiluminescent immunoassayimmunoassay）应应 用用单个样本检测速度快，适合做急诊灵敏度较高自动化程度高分类：以丫啶酯直接标记以HRP标记，鲁米诺为发光底物Amerlite系统以AP(碱性磷酸酶)为标记物，AMPPD为发光底物问问 题题样品不能重复检测本底较高仪器故障率较高试剂稳定性较差检测精度不高，在超微量分析及早期诊断方面能力不足非开放性试剂；试剂价格高第4页/共48页电化学发光免疫分析法（电化学发光免疫分析法（ECLECL）应应 用用80年代末期问世的新型化学发光免疫分析方法基本原理：根据三联吡啶钌Ru(bpy)3和三丙胺在电场触发下产生发光的化学发光反应本底较小、灵敏度较高、线性范围较宽以罗氏为代表缺缺 点点非开放性试剂系统、不能做科研试剂价格过高第5页/共48页二、时间分辨荧光技术二、时间分辨荧光技术 （Time-Resolved Fluorescence）第6页/共48页时间分辨荧光发展史时间分辨荧光发展史 1979 1979年，提出“时间分辨荧光免疫分析”理论，19891989年该技术获诺贝尔化学奖提名。9090年代以来，时间分辨荧光分析技术因其灵敏度高，操作简便，标准曲线范围宽，不受样品自然荧光干扰，无放射性污染等特点，其方法学研究和临床应用的发展十分迅速。时间分辨荧光分析技术正在成为现代医学研究中最有发展前景的分析手段第7页/共48页时间分辨免疫荧光技术的定义时间分辨免疫荧光技术的定义用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质当反应体系发生后，如抗原抗体免疫反应、核酸探针杂交等反应，经解离增强作用，用时间分辨荧光仪，测定最后产物的荧光强度根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的第8页/共48页TRFTRF分析原理图（分析原理图（1 1）第9页/共48页加样本加样本加样本加样本第10页/共48页振荡、洗板振荡、洗板振荡、洗板振荡、洗板第11页/共48页加入加入加入加入EuEu标标标标V第12页/共48页VEu标记物轻链螯合剂Eu重链第13页/共48页振荡、洗板振荡、洗板振荡、洗板振荡、洗板V第14页/共48页加入解离增强液加入解离增强液加入解离增强液加入解离增强液第15页/共48页第16页/共48页仪器检测仪器检测第17页/共48页标记物为稀土金属标记物为稀土金属-镧系元素镧系元素 铕(Eu)(Eu)、钐（Sm)Sm)、镝(Dy)(Dy)、锝(Tb)(Tb)镧系元素荧光特点：1 1、荧光寿命极长镧系元素螯合物（6060900 us)900 us)714us普通荧光免疫中荧光团：1 1100us100us样本中蛋白质荧光：1 110us10us，易猝灭第18页/共48页利用镧系元素荧光物利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后理特性，荧光激发后在固定时间段检测特在固定时间段检测特异性荧光而在此时间异性荧光而在此时间之前，非特异性荧光之前，非特异性荧光已完全衰减为已完全衰减为0 0TRF分析原理图（分析原理图（2）第19页/共48页标记物为稀土金属标记物为稀土金属-镧系元素镧系元素2 2、StokesStokes位移大（大约（大约290nm290nm）铕：激发光铕：激发光340nm340nm、发射光、发射光613nm613nm荧光荧光素的素的StokesStokes位移位移为为280nm280nm3 3、荧光特异性强（发射光谱带很窄：（发射光谱带很窄：615 5nm615 5nm）4 4、解离-增强技术可使其荧光性提高可使其荧光性提高100100万倍万倍第20页/共48页巨大巨大StokesStokes位移位移发射光谱与激发发射光谱与激发光谱间存在的巨光谱间存在的巨大大StokesStokes位移。位移。可以通过干涉滤可以通过干涉滤光片将发射光谱光片将发射光谱与激发光谱完全与激发光谱完全分离分离第21页/共48页TRFIATRFIA为临床检测带来的先进为临床检测带来的先进性性技术技术特点特点检验先进性检验先进性时间分辨时间分辨光谱分辨光谱分辨特异性荧光与非特异性荧特异性荧光与非特异性荧光分离光分离发射荧光与激发光分离发射荧光与激发光分离零背景、高特异性零背景、高特异性高灵敏度高灵敏度解离解离-增强增强 荧光性大大提高荧光性大大提高稳定的荧光螯合物稳定的荧光螯合物线性范围宽线性范围宽高灵敏度高灵敏度原子标记原子标记 标记位点多，可达标记位点多，可达20个个 对标记物结构及活性影对标记物结构及活性影响小响小 无衰变无衰变 受环境影响小受环境影响小高稳定性，高精确度高稳定性，高精确度试剂保质期至少一年试剂保质期至少一年标准曲线保留时间长标准曲线保留时间长同一批次可两点定标同一批次可两点定标多标记多标记单，双，三，四标记单，双，三，四标记同一试剂盒可同时测同一试剂盒可同时测多个项目多个项目第22页/共48页灵敏度更高，检测范围更广灵敏度更高，检测范围更广 以下数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书 试剂 DELFIA（WALLC）Immulite（DPC化学发光）ACS-180(拜尔）AFP0.1-1000IU/ml 0.2-300IU/ml 1.0-1000IU/mlCEA0.1-500ng/ml 0.2-500ng/ml 0.5-100ng/mlHCG0.5-10000U/L 5-5000U/L 2-1000U/L TSH0.005-100U/ml 0.002-75U/ml 0.03-150U/mlFSH0.05-256mU/ml 0.1-170mU/ml 0.3-200mU/mlProg0.08-120nmol/L 无 0.1-40ng/ml Prolactin0.04-250ng/ml 0.5-150ng/ml 0.3-200ng/ml第23页/共48页时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定，同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标0.5 1 2 5 10 20 50 100 200 500 U/L 51002000Cps.10 3DELFIA hFSHN=6标准曲线稳定，试剂保质期时间标准曲线稳定，试剂保质期时间长长第24页/共48页时间分辨荧光与化学发光方法学比时间分辨荧光与化学发光方法学比较较 时间分辨荧光时间分辨荧光 化学发光化学发光发光效率 95%1%重复检测 可无数次 不可重复本底噪声 零本底 干扰大灵敏级数 10-18 10-15标记物 原子 大分子化合物标记位点 可达20个/抗体 1个/抗体标准曲线 稳定达一年以上 稳定 2 到 4周多标记 有，最多可达四标记 无科研开发 有 无第25页/共48页时间分辨荧光和电化学发光的比较时间分辨荧光和电化学发光的比较 时间分辨荧光时间分辨荧光 电化学发光电化学发光标记物四种原子:Eu,Sm,Tb,Dy一种原子:钌多标记技术 有 无做科研能(1000多种科研项目)无 试剂种类58种临床,24种科研,28种临床,无科研试剂 共82种试剂价格 低 高第26页/共48页时间分辨荧光免疫时间分辨荧光免疫-突出优点突出优点零本底、灵敏度高线性范围宽试剂有效期长标准曲线稳定性好易于自动化对环境及人体没有任何影响TRFIA作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物学技术，将会给标记免疫学带来一场革命。第27页/共48页三、时间分辨荧光免疫技术三、时间分辨荧光免疫技术的临床应用的临床应用 (临床检测试剂盒简介)第28页/共48页内分泌科检查 1、甲状腺功能系列 T3 三碘甲状原氨酸T4 甲状腺素FT3 游离三碘甲状原氨酸FT4 游离甲状腺素TSH-U 促甲状腺素(超敏感)TBG Ab 甲状腺结合球蛋白TPO Ab 甲状腺过氧化物酶时间分辨荧光分析仪器测定项目介时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍绍第29页/共48页临床意义概述：甲状腺是人体一个重要的内分泌腺，也是最大的内分泌腺体，甲状腺疾病也是目前最常见最多发一种内分泌疾病，对人体的正常功能可产生明显影响，甚至危及生命。以上各项目的联合检测，为临床医生对病患者甲状腺功能的评价提供更基础、全面的依据。时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍第30页/共48页2、糖尿病系列 InS 胰岛素 CP C肽 临床意义概述：了解残留胰岛细胞的功能，特别是用于区分胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)(IDDM)和非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM);(NIDDM);用于胰岛素瘤的诊断等。时间分辨荧光分析仪器测定项目介时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍绍第31页/共48页 时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍3、生长激素 hGH 生长激素 临床意义概述：对诊断肢端肥大症是一项特异的方法；hGH低下还见于侏儒症和垂体前叶功能减退症如席汉综合征等。第32页/共48页妇产科检查（性激素）hCG 绒毛膜促性腺激素 LH-Spec 黄体生成素(特异性)FSH 促卵泡激素 PRL 催乳素 E2 雌二醇 Testo 睾酮 Prog 孕酮 SHBG 性激素结合球蛋白时间分辨荧光分析仪器测定项目介时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍绍第33页/共48页时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍临床意义概述性激素是由性器官或肾上腺皮质分泌的，维持和调节机体内正常生命，生理活动和生殖功能的一类甾体激素。检测这些激素的含量对于生殖生理的研究、疾病的诊断、治疗、随访及计划生育工作的开展具有重要的意义。第34页/共48页肿瘤科检查 AFP 甲胎蛋白 PSA 前列腺特异抗原 B2-M Beta 2微球蛋白 NSE 神经元烯醇化酶 PAP 前列腺酸性磷酸酶 CEA 癌胚抗原 PSA Free/total 前列腺特异抗原/总量时间分辨荧光分析仪器测定项目介时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍绍第35页/共48页临床意义概述：肿瘤标志物（Tumor Markers,TM)是指示体内肿瘤存在并反映其一定的生物特性的生化物质。通过测定其存在或含量，对于肿瘤可辅助诊断，分析病情，指导治疗，监测复发或转移及判断预后等。对现有TM项目进行综合分析、多元分析，筛选出有价值的TM，确定一个最佳组合方式具有极大的临床意义。时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍第36页/共48页遗传科检查1、产前筛查 PAPP-A 妊娠相关血浆蛋 Free hCGBeta 游离绒毛膜促性腺激素 亚单位 AFP 甲胎蛋白 E3 游离雌三醇h AFP/Free hCG 甲胎蛋白/游离绒毛膜促性腺激素 亚单位 临床意义概述：是预防患有严重遗传性疾病和先天畸形胎儿出生的一项有效措施。随着产前诊断技术的不断完善，产前诊断不仅为患儿的出生提供了客观依据，也使医师能在分娩过程中和分娩后给予合适的处理。时间分辨荧光分析仪器测定项目介时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍绍第37页/共48页时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍2、新生儿筛查 Neoneotal hTSH 新生儿筛查促甲状腺素 Neoneotal T4 新生儿筛查甲状腺素 Neoneotal 17-OH-Prog 17-羟基酮 Neoneotal PKU 新生儿筛查苯丙氨酸临床意义概述：通过先进的实验室检测及早发现某些危害严重的先天性遗传代谢性疾病，从而早期诊断、早期治疗，避免宝宝因脑、肝、肾等损害导致智力、体力发育障碍甚至死亡。第38页/共48页血液科检查1、贫血检查 Ferritin 铁蛋白 Vit B12 维生素B12 folate 叶酸2、白血病分型、免疫细胞分型、细胞毒试验等其它科研时间分辨荧光分析仪器测定项目介时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍绍第39页/共48页第40页/共48页泰莱泰莱-I-I型时间分辨系统型时间分辨系统第41页/共48页泰莱泰莱-型时间分辨系统型时间分辨系统第42页/共48页使用使用TRFIATRFIA的理由的理由一、专为中国医院量身定制仪器、试剂的国产化，更适应我国国情，为各级医院开展高灵敏度的特种检验提供可行、低成本的方案。二、先进的方法学TRF因其更灵敏、方法更特异，技术更简单、操作更方便、成本更低所以更具生命力。第43页/共48页使用使用TRFIATRFIA的理由的理由三、可测项目多开放性试剂系统；试剂多达72种，其中临床48种，科研24种，能做1000多项科研项目，比美大型免疫分析仪。有助于推进我国基础医学与临床医学的发展，并为提高人民的健康水平和改善人民的生活质量做出贡献。四、对操作人员没有伤害第44页/共48页使用使用TRFIATRFIA的理由的理由五、试剂有效期长、标准曲线稳定低分子量原子标记，标记位点可达20个/抗体对标记物的结构与活性影响小，无衰变，决定了试剂的高稳定性。减少了因定标和试剂保存期短而造成的试剂浪费。六、结果可靠方法学的优异性、高灵敏度、可重复测试，更宽的检测线性范围，受环境因素影响更少。第45页/共48页专家评价专家评价 主主要要技技术术性性能能已已达达到到国国外外同同类类型型半半自自动动测测试试仪仪的的先先进进水水平平。具具有有国国内内领领先先水水平平，特特别别是是其其操操作作系系统统实实现现了了全全中中文文WindowsWindows界界面面下下的的操操作作与与数数据据处处理理，更更为为适适应应国内医院使用，为国内首创。国内医院使用，为国内首创。第46页/共48页谢谢！第47页/共48页感谢您的观看！第48页/共48页
