BCA法测定蛋白质含量ppt课件.ppt
在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么蛋白质定量分析：BCA法实验实验在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么分光光度计的基本原理是基于分光光度计的基本原理是基于物质对不同波长的光的选择性物质对不同波长的光的选择性吸收吸收，不同的物质都有各自的，不同的物质都有各自的吸收光谱。当白光通过某一溶吸收光谱。当白光通过某一溶液时，其中某些波长的光会被液时，其中某些波长的光会被溶液吸收。溶液吸收。光吸收程度达到最大值的波长，为光吸收程度达到最大值的波长，为最大吸收波长最大吸收波长，用，用maxmax示。示。分光光度计的基本原理分光光度计的基本原理在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么LambertBeer定律定律A=KCL定义定义：一束单色光通过介质溶液后，光能被吸收一部：一束单色光通过介质溶液后，光能被吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。1 1、只适用于、只适用于单色光单色光；maxmax2 2、仅适用于稀释溶液；、仅适用于稀释溶液；3 3、对于混合稀释溶液，应该尽量去除干扰物质；、对于混合稀释溶液，应该尽量去除干扰物质；（空白管）（空白管）4 4、A A值控制在值控制在0.20.20.80.8之间。之间。（A：吸光度；：吸光度；K：吸光系数；：吸光系数；C：吸光物质的浓度；：吸光物质的浓度；L：吸收层厚度：吸收层厚度）思考：根据该定律，如何计算待测物的浓度？思考：根据该定律，如何计算待测物的浓度？在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么LambertBeer定律的应用定律的应用1.1.利用标准管计算测定管浓度利用标准管计算测定管浓度(标准管法标准管法)用一已知浓度的测定物用一已知浓度的测定物(标准管标准管)按测定管同样处理显色，读取吸光度，再根据按测定管同样处理显色，读取吸光度，再根据A=KCL计算。计算。同一台仪器比色皿内径相同（同一台仪器比色皿内径相同（L L标标=L=L测测）,标准管和测定管为同一物质标准管和测定管为同一物质,吸光系数相同（吸光系数相同（K K标标=K=K测测），），A测测=K测测C测测L测测A标标=K标标C标标L标标 C测测=A测测/A标标C标标在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么v配制一系列的配制一系列的标准管，然后标准管，然后绘出标准曲线。绘出标准曲线。v再测出测定管再测出测定管的吸光度，在的吸光度，在标准曲线上查标准曲线上查找到对应浓度。找到对应浓度。浓度（浓度（C C）时间时间:仪器型号仪器型号:仪器编号仪器编号:作图者作图者:A2.2.利用标准曲线法进行换算测定物浓度（利用标准曲线法进行换算测定物浓度（标准曲线法标准曲线法）思考思考：试比较两种方法优缺点。：试比较两种方法优缺点。A待测待测C待测待测在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么1.1.预热预热 打开电源开关，打开样品室，使仪器预热打开电源开关，打开样品室，使仪器预热2020分钟。分钟。2.2.调波长调波长 转动波长手轮，调至所需要的单色波长。转动波长手轮，调至所需要的单色波长。3.3.调节调节T=0%T=0%调节功能键到调节功能键到“T”“T”档档，空白溶液、待测溶液依次，空白溶液、待测溶液依次放入样品室，使放入样品室，使空白溶液对准光路空白溶液对准光路，按下按下“0%”“0%”键键，使数字，使数字显示为显示为“0.000”0.000”。（。（此时样品室必须是打开的此时样品室必须是打开的）4.4.调节调节T=100%T=100%把样品室把样品室盖子轻轻盖上盖子轻轻盖上，按按“100%”100%”键键，使数，使数字显示正好为字显示正好为“100.0”100.0”。5.5.调节调节A A=0 0 将功能键调节至将功能键调节至“A”“A”档档,此时数字显示为此时数字显示为“.000”.000”。如果不是，则按如果不是，则按T 100T 100（即（即A 0A 0键）键）6.6.吸光度测定吸光度测定 拉动拉杆使待测液依次进入光路，读取拉动拉杆使待测液依次进入光路，读取A A值。值。7.7.关机关机 冲洗比色皿，关电源。冲洗比色皿，关电源。使用步骤使用步骤打开样品室盖，切断光路打开样品室盖，切断光路在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么 蛋白质蛋白质 定量定量 BCA BCA法法什么是蛋白质？什么是蛋白质？其元素组成？基本组成单位？分子结构？结构其元素组成？基本组成单位？分子结构？结构与功能的关系？与功能的关系？理化性质理化性质？如何分离纯化？如何分离纯化？定性？定量？定性？定量？BCA法是根据蛋白质什么性质？法是根据蛋白质什么性质？是什么或者有什么？是什么或者有什么？有多少有多少？为什么蛋白质可以定量测定？基于什么原理？为什么蛋白质可以定量测定？基于什么原理？呈色反应呈色反应A=KCL，标准管法或者，标准管法或者标准曲线法标准曲线法计算计算在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么一一.实验目的实验目的1、掌握、掌握BCA法测定蛋白质浓度的原理及操法测定蛋白质浓度的原理及操作；作；2、掌握、掌握722型分光光度计、移液管的正确型分光光度计、移液管的正确使用、使用、试剂盘的正确摆放试剂盘的正确摆放以及用标准曲线法以及用标准曲线法计算蛋白质的浓度；计算蛋白质的浓度；3、了解蛋白质含量测定的多种方法。、了解蛋白质含量测定的多种方法。在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么二二.实验原理实验原理BCA分子式BCA试剂盒 在碱性条件下，蛋白质将在碱性条件下，蛋白质将CuCu2 2+还原为还原为CuCu+，Cu Cu+与两分子与两分子BCABCA（二辛可酸）反应形成（二辛可酸）反应形成紫蓝色紫蓝色的络合物，测定其在的络合物，测定其在562nm562nm处的吸处的吸光度光度值，并与标准曲线对比，即可计算待测值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白质的含量。蛋白质的含量。在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么紫蓝色二二.实验原理实验原理562nmA562M蛋白质蛋白质在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么二二.实验原理实验原理采用标准曲线法计算待测液含量采用标准曲线法计算待测液含量A待测待测m待测待测45作图人：仪器型号：722型分光光度计时间：波长：562nmBCA法测定蛋白质含量标准曲线法测定蛋白质含量标准曲线在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么试剂盘摆放及移液管选择试剂盘摆放及移液管选择试剂盘摆放：试剂盘摆放：试剂在左，移液管在右侧试剂在左，移液管在右侧取试剂时，将试剂和相应的移液管取试剂时，将试剂和相应的移液管拿出试拿出试剂盘剂盘，用完之后放回原处用完之后放回原处，谨防试剂污染。，谨防试剂污染。在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么三三.实验步骤实验步骤 取取7 7支试管按下表编号并操作：支试管按下表编号并操作：（平行加样、准确量取）平行加样、准确量取）管号管号试剂（试剂（mLmL）空白管空白管 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 测定管测定管 标准蛋白溶液标准蛋白溶液（0.30.3mg/mlmg/ml ）0.10.1 0.20.2 0.30.3 0.40.4 0.50.5 蒸馏水蒸馏水 3.03.0 2.92.9 2.82.8 2.72.7 2.62.6 2.5 2.5 待测样品待测样品(小牛血清，小牛血清，已经稀释了已经稀释了500500倍倍)0.50.5 BCABCA工作液工作液 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 蛋白质含量蛋白质含量(ug)(ug)3030 6060 9090 120120 150150 将上述各管混匀后于将上述各管混匀后于37C保温保温30分钟分钟，用，用562nm波长比色测定吸波长比色测定吸光度值。光度值。在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么三三.实验步骤实验步骤1、以蛋白质含量为横坐标，、以蛋白质含量为横坐标，A值为纵坐标，绘制值为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线。2、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相应的蛋、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相应的蛋白质含量白质含量m,再计算出待测血清中蛋白质浓度再计算出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。注意：最后浓度单位要统一换算成注意：最后浓度单位要统一换算成g/LC=mV 500小牛血清正常范围为：小牛血清正常范围为：30-50g/L30-50g/L在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么原始数据原始数据管号空白管12345测定管m(ug)01530456075吸光度(A)仪器名称、型号编号：波长：测定日期：测定人：BCA法测定蛋白质含量法测定蛋白质含量在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么四四.注意事项注意事项1 1、实验分组，两人一组、实验分组，两人一组2 2、试剂盘的摆放：专管专用，防止污染试剂盘的摆放：专管专用，防止污染3 3、准确量取试剂，正确使用吸量管、准确量取试剂，正确使用吸量管4 4、正确操作、正确操作722722型分光光度计，此次由于溶型分光光度计，此次由于溶液体积较少，液体积较少，比色皿不需要待测溶液润洗比色皿不需要待测溶液润洗5 5、正确绘制标准曲线正确绘制标准曲线，标明名称、仪器、，标明名称、仪器、作图人、时间等作图人、时间等6 6、实验原始数据书写规范，、实验原始数据书写规范，三线表三线表7 7、待测液、待测液(小牛血清小牛血清)已经稀释了已经稀释了500500倍，倍，在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么BCA试剂盒BCA法广泛用于科研工作，其法广泛用于科研工作，其特点特点：1、操作简便，快速、操作简便，快速2、准确灵敏，试剂稳定性好、准确灵敏，试剂稳定性好3、经济适用、经济适用4、抗试剂干扰能力较强，不受绝大部分样、抗试剂干扰能力较强，不受绝大部分样品中的去污剂、尿素等化学物质的影响品中的去污剂、尿素等化学物质的影响在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么方法灵敏度时间原理干扰物紫外线吸收法较低快速酪氨酸和色氨酸在280nm的光吸收 核苷酸改良凯氏定氮低费时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮双缩脲法低中速肽键和碱性Cu2形成紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液 某些氨基酸Lowry法高费时双缩脲反应；酚试剂被还原甘氨酸硫醇考马斯亮蓝法高快速G-250与蛋白质结合物在595nm的光吸值强碱性缓冲液 TritonX-100;SDSBCA法最高较快肽键和碱性Cu2形成紫色络合物不受去污剂、尿素等的影响各种方法比较各种方法比较
