紫外可见分光光度法.pptx

第一节第一节 紫外紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱第二节第二节 朗伯朗伯-比尔定律比尔定律第三节第三节 紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计第四节第四节 分析条件的选择分析条件的选择第五节第五节 测定方法测定方法第1页/共158页概概 述述 紫外可见分光光度法(Ultraviolet-Visible Spectrophotometry)，又称:紫外-可见分子吸收光谱法(Ultraviolet-Visible Molecular Absorption Spectrometry)是利用被测物质对光的吸收特征和吸收强度对物质进行定量和定性的分析方法。第2页/共158页分光光度法的发展过程 分光光度法在发展过程中先后经过了分光光度法在发展过程中先后经过了目视比色法，目视比色法，光电比色法和分光光度法光电比色法和分光光度法三个阶段。三个阶段。（1 1）目视比色法目视比色法是一种用眼睛辨别颜色深浅，以确定待是一种用眼睛辨别颜色深浅，以确定待测组分含量的方法。测组分含量的方法。（2 2）光电比色法光电比色法是使用光电比色计测量溶液吸光度并计是使用光电比色计测量溶液吸光度并计算待测组分含量。算待测组分含量。（3 3）分光光度法分光光度法是应用分光光度计，通过测定被测物质是应用分光光度计，通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度，对该物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度，对该物质进行定性、定量分析的方法。它包括紫外分光光度法、进行定性、定量分析的方法。它包括紫外分光光度法、可见光分光光度法、红外分光光度法等。可见光分光光度法、红外分光光度法等。2023/2/233第3页/共158页紫外可见分光光度法的特点：(1)灵敏度较高(10-410-6g/ml)(2)精 密 度 和 准 确 度 较 高(0.20.5%)(3)选择性较好(4)仪器设备简单、费用少、分 析速度快、易于掌握和推广(5)应用范围广第4页/共158页光的反射、折射、衍射等现象。光的反射、折射、衍射等现象。第5页/共158页光的吸收、放射、光电效应等现象。光的吸收、放射、光电效应等现象。第6页/共158页第7页/共158页第8页/共158页第9页/共158页 当一束太阳光照射某一溶液时，太阳光中某一颜色的光被吸收，其互补色光透过溶液，刺激人的眼睛，使人感觉到它的颜色。2023/2/2310溶液颜色与光吸收的关系实例：1)高锰酸钾吸收绿光显紫红色；2)重铬酸钾吸收蓝光显黄色；3)邻菲罗啉铁溶液吸收蓝绿光显红色。第10页/共158页第11页/共158页2023/2/2312完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现象示意复合光黑色蓝色无色第12页/共158页课堂互动课堂互动1 1紫外紫外-可见光的波长范围是可见光的波长范围是A A200400nm B200400nm B400780nm 400780nm C C200780nm D200780nm D360800nm360800nm2 2下列叙述错误的是下列叙述错误的是A A光的能量与其波长成反比光的能量与其波长成反比 B B有色溶液越浓，对光的吸收也越强烈有色溶液越浓，对光的吸收也越强烈C C物质对光的吸收有选择性物质对光的吸收有选择性 D D光的能量与其频率成反比光的能量与其频率成反比13第13页/共158页课堂互动课堂互动3 3紫外紫外-可见分光光度法属于可见分光光度法属于 A A原子发射光谱法原子发射光谱法 B B原子吸收光谱法原子吸收光谱法 C C分子发射光谱法分子发射光谱法 D D分子吸收光谱法分子吸收光谱法14第14页/共158页第一节紫外-可见吸收光谱一、电子跃迁类型2.分子轨道轨道：电子围绕分子或原子运动的几率。分子轨道：当两个原子靠近而结合成分子时，两个原子的原子轨道以线性组合而成。COHnsH1.分子中价电子类型：电子，电子，n电子第15页/共158页3.有机化合物常见的跃迁类型有：*、n*、*、n*其相对能量大小次序为：*n*n*。成键轨道：两个分子轨道中能量较低的轨道，如、。反键轨道：两个分子轨道中能量较高的轨道，如*、*。非成键轨道：n电子能级基本保持不变。s*s*RKE,BnEn第16页/共158页*跃迁特征：发生在饱和烃；需要辐射能量很大；吸收峰在远紫外区，max104，属于强吸收；孤立*跃迁吸收峰在200nm左右；随着共轭双键的增多，所需能量越小，吸收峰长移；max随溶剂极性增加而向长波方向移动，称为红移(长移)。*跃迁特征：发生在含有杂原子的不饱和化合物中；比较小，10100；吸收峰在近紫外区，200400nm；max随溶剂极性增加而向短波方向移动，称为紫移(或蓝移、短移)。n*跃迁（200400nm）第18页/共158页1.吸收曲线：2.峰：3.谷：4.肩峰：5.末端吸收：6.生色团(chromophore)：含有*跃迁，n*跃迁的基团二、紫外可见吸收光谱的常用概念二、紫外可见吸收光谱的常用概念第20页/共158页7.助色团(auxochrome)：含有非键电子的杂原子饱和基团8.红移：max向长波方向移动9.紫移:max向短波方向移动一些助色团-OH、-NH2、-OR、-SH、-Cl，当它们与生色团相连时，使生色团的max红移，且增大。第21页/共158页10.增色效应：吸收强度增加11.减色效应：吸收强度减弱12.强带：max10413.弱带：max102第22页/共158页三、有机化合物的吸收带R带：由n*跃迁引起，是杂原子的不饱和基团的特征。max 300nm，104，max随溶剂极性增加而向长波方向移动KKRRn第24页/共158页B带：芳香族化合物的特征吸收带。max230-270 nm =200，*与苯环骨架振动引起；含取代基时，B带红移，简化。max（nm）max苯254200甲苯261300间二甲苯2633001，3，5-三甲苯266305六甲苯272300第25页/共158页E带：芳香族化合物的特征吸收带。由苯环中三个乙烯的环状共轭结构的 *引起，分为E1(180 nm =4.7104)，E2(200 nm 7000)带。苯和取代苯在异丙烷溶液中的紫外吸收图谱第26页/共158页苯与乙酰苯紫外光谱图双键羰基与苯环共扼,使得：(1)K带强；苯的E2带与K带合并，红移；(2)取代基使B带简化苯紫外光谱图苯紫外光谱图第27页/共158页四、影响紫外-可见吸收光谱的因素在室温范围内，温度对吸收光谱的影响不大。在低温时，由于分子的热运动降低，邻近分子间的能量交换减少，产生红移，吸收峰变得比较尖锐，吸收强度有所增大。温度较高时，分子的碰撞频率增加，谱带变宽，谱带精细结构消失。1温度第30页/共158页顺式max=283nm；max=12300反式：max=295nm；max=25000共平面产生最大共轭效应，max大2.位阻影响第31页/共158页有些有些、不饱和酮中，须双键与酮不产生共轭，但不饱和酮中，须双键与酮不产生共轭，但适当的立体排列使羰基氧的孤对电子和双键的适当的立体排列使羰基氧的孤对电子和双键的电子作用，使得相当于n*跃迁的R带波长长移，同时吸收增强；此外羰基的轨道与杂原子的P轨道能够有效交盖时也会出现跨环效应。3.跨环效应max=238nm；max=2535214nm处显示中等强度的吸收带，同时在284nm处出现R带第32页/共158页对物质的紫外可见光谱的测定，大多是在溶液中进行的，由于使用的溶剂不同，同一种物质得到的紫外可见吸收光谱可能不一样。4溶剂效应max(正己烷)max(氯仿)max(甲醇)max(水)*230238237243n*329315309305溶剂极性对异丙叉丙酮的两种跃迁吸收峰的影响结论：当溶剂极性增大时n*跃迁紫移，*跃迁红移，第33页/共158页当溶剂极性增大时n*跃迁紫移，*跃迁红移，非极性极性nn p np第34页/共158页非极性极性n*跃迁：紫移；*跃迁：红移；极性溶剂使精细结构消失第35页/共158页测定有机分子的紫外可见吸收光谱时，对溶剂要求：极性较小、能很好地溶解被测物；形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性；在样品的吸收光谱区无明显吸收；如果要与标准品的吸收光谱相比较，须用相同的溶剂。第36页/共158页很多化合物都具有酸性或碱性可解离基团，在不同pH的溶液中，分子的解离形式可能发生改变，其吸收光谱的形状、max和吸收强度可能不一样。5pH值的影响max210.5nm,270nmmax235nm,287nm第37页/共158页利用标准试样对未知物进行鉴定时，对两者吸收光谱中峰的位置、数目和吸收强度进行比较，如果两者完全一致，就可初步判断可能为同一种物质；如果有明显差别，肯定不是同一种物质。五、紫外-可见吸收光谱的应用1.对比吸收光谱的特征数据：max、E 11cm、(一)、定性分析第38页/共158页2.对比吸光度（或吸光系数）不只一个吸收峰的化合物，可用不同吸收峰处测得吸光度的比值作为鉴别的依据。V-B12的鉴别规定在361nm与278nm吸光度的比值应为；361nm与550nm吸光度的比值应为第39页/共158页（1）与标准品对照（2）与文献标准图谱对照（标准谱图库：46000种化合物紫外光谱的标准谱图）The sadtler standard spectra,Ultraviolet 3.对比吸光谱的一致性第40页/共158页(二)、纯度鉴定1.杂质检查：当甲醇中含有少量苯时，被污染甲醇的紫外吸收光谱在256nm处就会出现苯的特征吸收。2.杂质的限量检测：肾上腺素中的杂质肾上腺酮不得超过0.6%。其具体方法是：用的HCl溶解肾上腺素制成2mg/ml的溶液，在1cm吸收池中，于310nm处测定吸光度A。规定A。第41页/共158页可以推定分子骨架，判断发色团之间的共轭关系和估计共轭体系中取代基的种类、位置和数目。(三)、结构分析有机化合物的紫外吸收光谱1.饱和碳氢化合物只产生*跃迁，所需能量很大，200400nm没有吸收，常作为溶剂。第42页/共158页 发生n*跃迁，所需能量小于*跃迁所需能量，故吸收峰长移。2.2.孤立助色团和生色团的饱和有机化合物孤立助色团和生色团的饱和有机化合物杂原子的电负性越小和离子半径越大，n电子能级越高，n*跃迁所需能量小，吸收峰波长越长。（1）孤立助色团第43页/共158页发生n*、n*、*跃迁，孤立*跃迁吸收峰在150180nm间。（2）孤立生色团化合物醛和酮有三个吸收峰n*190nmn*275295nm*150180nm第44页/共158页 共轭体系使得*跃迁所需能量变小，吸收峰长移，吸光系数增大，化合物由无色变为有色。3.3.共轭烯烃共轭烯烃4.4.，不饱和醛、酮、酸、酯不饱和醛、酮、酸、酯非共轭烯键和羰基的非共轭烯键和羰基的*跃迁略在200nm处，有两个强吸收峰，同时在280nm处有羰基羰基n*吸收峰。（1）.，不饱和醛、酮不饱和醛、酮第45页/共158页，不饱和醛、酮中，羰基与烯键共轭不饱和醛、酮中，羰基与烯键共轭*长移到200260nm，吸光系数略为10000；n*跃迁长移到310350nm，吸光系数小于100。当溶剂极性增大时n*跃迁紫移，*跃迁红移，第46页/共158页助色团上的助色团上的n n电子与羰基双键的电子与羰基双键的电子共轭，使得成键的轨道和反键的*轨道的能级提高，而成键的轨道能量提高得更大，这样使得*跃迁所需能量降低，吸收峰长移。(2).(2).，不饱和酸、酯不饱和酸、酯n电子能量不变，*轨道的能级提高，使得n*跃迁所需能量增大，吸收峰短移第47页/共158页苯：最简单的芳香族化合物，具有环状共轭体系，*跃迁可产生E1、E2和B。B带的精细结构在极性溶剂中消失。取代苯：取代苯：苯环上有取代基使得苯的三个带都长移，吸光系数增大，B带的精细结构也因取代基的变化而变得简单（1）苯和取代苯5.5.芳香族化合物芳香族化合物第48页/共158页第49页/共158页吸电子取代基：吸电子取代基：-NH3+-SO2NH2 -COO-CN-COOH CHO -NO2取代基不同，长移效应也不同供电子取代基：-CH3-Cl-Br-OH-OCH3-NH2-O-NHCOCH3 104，B带长移.生色团取代基第53页/共158页 饱和五元环和六元环的吸收峰都小于200nm；五元不饱和杂环化合物，如呋喃、噻吩、吡咯相当于环戊二烯的CH2被杂原子取代，但杂原子上的n电子参与共轭，因此，他们的紫外光谱与环戊二烯相似。（2）芳杂环化合物六元氮芳杂环与相应的芳烃相似，但B带强度增大，精细结构简化甚至消失。如苯与吡啶，萘与喹啉。第54页/共158页有机化合物的结构研究(1)200-400nm无吸收峰。饱和化合物，单烯。(2)270-295nm有吸收峰（=10-100）醛酮n*跃迁产生的R带。(3)250-300nm有中等强度的吸收峰(=200-2000)，芳环的特征吸收(具有精细解构的B带)。(4)200-250nm有强吸收峰(104)，表明含有一个共轭体系(K)带。共轭二烯：K带(230nm)；不饱和醛酮：K带230nm，R带310-330nm。260nm,300nm,330nm有强吸收峰，35个双键的共轭体系。1.从吸收光谱中初步推断官能团第55页/共158页 松香酸 左旋松香酸max 238nm 273nm 15100 71002.异构体的推定（1）光学异构体第56页/共158页（2）顺反异构体顺式：max=280nm；max=10500反式：max=295.5nm；max=29000共平面产生最大共轭效应，max大第57页/共158页（3）互变异构体酮式：max=204nm；无共轭烯醇式：max=243nm第58页/共158页 未知化合物与已知化合物的紫外吸收光谱一致时，未知化合物与已知化合物的紫外吸收光谱一致时，可以认为两者具有同样的发色团，据此可以推断未可以认为两者具有同样的发色团，据此可以推断未知化合物的骨架。如维生素知化合物的骨架。如维生素K1(A)有吸收带：有吸收带：max=249 nm(lg)，260nm(lg)，325nm(lg)。这与已知的这与已知的1,4-蒽醌的光谱比较，发现蒽醌的光谱比较，发现维生素维生素K1(A)与与2,3-二烷基二烷基-1,4蒽醌蒽醌(B)的吸收带很相近。的吸收带很相近。3.化合物的骨架推定AB第59页/共158页I0入射光强度 Ia吸收光强度It透射光强度 Ir反射光强度第二节朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律1.透光率和吸光度I0IaItIr第60页/共158页在吸光度分析中，通常将被测溶液和参比溶液分别置于同样材料和厚度的吸收池中，让强度为I0的单色光分别通过两个吸收池，再测量透射光的强度。因为，反射光强度基本相同，其影响可相互抵消，I0IaItI0IaItIr溶液的透光度越大，表示它对光的吸收越小；反之，透光度越小，表示它对光的吸收越大。透光率TIt/I0第61页/共158页A值越大，表明物质对光的吸收越大。透光度和吸光度都是表示物质对光的吸收程度的一种量度。吸光度(absorbance)物质对光的吸收程度A-lgTEcl 或 T10-A10-ECL第62页/共158页2.朗伯-比尔定律朗伯定律(1760年)当用一种适当波长的单色光照射一固定浓度的溶液时，其吸光度与光透过的液层厚度成正比Akll液层厚度k比例系数朗伯定律对所有的均匀吸收介质都适用。第63页/共158页比尔定律(1852年)当用一适当波长的单色光照射一溶液时，若液层厚度一定，则吸光度与溶液浓度成正比Akcc溶液浓度k比例系数比尔定律不是对所有的吸光溶液均适用第64页/共158页k比例常数，与吸光物质的本性、入射 光波长、溶剂及温度等因素有关。如果溶液的浓度(c)和透光液层厚度(l)是不固定的，就必须同时考虑c和l对吸光度的影响Akcl朗伯-比尔定律当用适当波长的单色光照射一溶液时，吸光度与溶液浓度及液层厚度的乘积成正比。朗伯比尔定律适用于均匀、非散射介质，但不适用于非单色光和浓度大的溶液。第65页/共158页不同的物质对同一波长的单色光，可有不同的吸光系数，吸光系数越大，表明该物质的吸光能力越强，灵敏度越高，所以吸光系数是定量和定性的依据。3、吸光系数（1）物理意义吸光物质在单位浓度及单位厚度（1cm）的吸光度。在给定单色光、溶剂和温度等条件下，吸光系数是物质的特性常数，表明物质对某一特定波长的吸收能力。第66页/共158页u摩尔吸光系数：在入射光波长一定时，溶液摩尔吸光系数：在入射光波长一定时，溶液浓度为浓度为1 mol/L，液层厚度为液层厚度为1cm时所测得时所测得的吸光度称为摩尔吸光系数，常用的吸光度称为摩尔吸光系数，常用表示表示。u百分吸光系数：在入射光波长一定时，溶液百分吸光系数：在入射光波长一定时，溶液浓度为浓度为1（1g100ml，W/V）、）、层厚度层厚度为为1cm时所测得的吸光度称为百分吸光系数，时所测得的吸光度称为百分吸光系数，常用常用 表示表示。二者的关系：二者的关系：67 （2）吸光系数的两种表示方法第67页/共158页课堂互动课堂互动某有色溶液的摩尔浓度为某有色溶液的摩尔浓度为c c，在一定条件下用在一定条件下用1 1cmcm比色杯测得吸光度为比色杯测得吸光度为A A，则摩尔吸光系数则摩尔吸光系数为为 A AcAcA B BcMcM C CA/C DA/C DC/A C/A 68符合朗伯-比尔定律的一有色溶液，当有色物质的浓度增加时，最大吸收波长和吸光度分别是()A.增加、不变 B.减少、不变 C.不变、增加 D.不变、减少 1-5吸光度与透射比的关系是()1-6一有色溶液符合比尔定律，当浓度为c时，透射比为T0，若浓度增大一倍时，透光率的对数为()第68页/共158页课堂互动课堂互动 用双硫腙测定用双硫腙测定用双硫腙测定用双硫腙测定CdCdCdCd2+2+2+2+溶液的吸光度溶液的吸光度溶液的吸光度溶液的吸光度A A A A时，时，时，时，CdCdCdCd2+2+2+2+（CdCdCdCd的原子量为的原子量为的原子量为的原子量为112112112112）的浓度为）的浓度为）的浓度为）的浓度为140140140140g/Lg/Lg/Lg/L，在在在在525525525525nmnmnmnm波长处，用波长处，用波长处，用波长处，用L L L L1cm1cm1cm1cm的吸收池，测得吸光度的吸收池，测得吸光度的吸收池，测得吸光度的吸收池，测得吸光度A A A A0.2200.2200.2200.220，试计算摩尔吸光系数和百分吸收系数，试计算摩尔吸光系数和百分吸收系数，试计算摩尔吸光系数和百分吸收系数，试计算摩尔吸光系数和百分吸收系数，实验中应选用哪种材质的吸收池盛装实验中应选用哪种材质的吸收池盛装实验中应选用哪种材质的吸收池盛装实验中应选用哪种材质的吸收池盛装溶液？溶液？溶液？溶液？69第69页/共158页例1：某物质的摩尔质量为236，将其配成浓度为的溶液，盛于1cm吸收池中，在max355nm处测得A0.557,求E 11cm与。解：c=/100mlE 11cmA/(c.l)=0.577/(0.0004962.1=(M/10).E 11cm=26492用准确浓度的稀溶液测定吸光度来换算可得吸光系数第70页/共158页（3）吸光系数的大小，取决于物质(溶质、溶剂)的本性、温度和光的波长。1）物质不同，则吸光系数不同，吸光系数为物质的特征常数。2）溶剂不同，同一物质吸光系数亦不同。所以在说明吸光系数时，应注明溶剂。3）一般情况下，105第73页/共158页4)光的波长不同，其吸光系数亦不同。如将不同波长的单色光依次通过被分析物质，分别测得吸光度，然后绘制吸光度-波长曲线，称为吸收曲线，又称吸收光谱第74页/共158页例2.称取溶于100ml的硫酸溶液中，再准确取液稀释到100ml，取此液于1cm吸收池中在max245nm处测得A0.551,求其百分含量。已知E 11cm（245nm）=560。解：cA/(E 11cm.l)=0.551/(560.1)=9.83910-4g/100ml=9.83910-6g/ml 试样中V-C的质量为m=9.83910-6g/ml50100ml试样中V-C的百分含量为第75页/共158页4.吸光度的加和性测定混合物组分含量的依据A11c1 lA22c2 lA33c3 lA=A1A2+A3+第77页/共158页5、偏离比尔定律的因素遵守比尔定律负偏离正偏离第78页/共158页谱带A的吸光系数变化不大，谱带B的吸光系数变化较大max第81页/共158页2023/2/2383第三节 紫外可见分光光度计光源单色器吸收池检测器显示系统0.575光源单色器吸收池检测器显示第83页/共158页1.1.光源光源2023/2/2384作用-提供入射光 在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可见光区：钨灯、卤钨灯作为光源，其辐射波长范围在3202500nm。紫外区：氢、氘灯，发射200375nm的连续光谱。第84页/共158页 2023/2/2385作用：将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光。入射狭缝：光源的光由此进入单色器；准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；出射狭缝。第85页/共158页4色散元件(1)棱镜玻璃棱镜可见光区石英棱镜紫外光区多数用平面反射光栅，用于紫外、可见及红外光谱区域(2)光栅第86页/共158页2023/2/2387 样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。注意：用作盛空白溶液的比色皿与盛试样溶液的比色皿应互相匹配，即有相同的厚度与相同的透光性。为了减少反射损失，比色皿的光学面必须完全垂直于光束方向。不能用手指拿比色皿杯的光学面，用后要及时洗涤，可用温水或稀盐酸，乙醇以至铬酸洗液（浓酸中浸泡不要超过15分钟），表面只能用柔软的绒布或拭镜头纸擦净。第87页/共158页第88页/共158页2023/2/2389 利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。检流计、数字显示、计算机进行仪器自动控制和结果处理。第89页/共158页课堂互动课堂互动 试述紫外试述紫外-可见分光光度计的可见分光光度计的主要部件及其作用？主要部件及其作用？90第90页/共158页根据被测组分的吸收光谱，选择最强吸收带的最大吸收波长(max)为入射光波长，这样可以得到最大的测量灵敏度，称为最大吸收原则。当最强吸收峰的峰形比较尖锐时，往往选用吸收稍低、峰形稍平坦的次强峰或肩峰进行测定。第四节分析条件的选择(一)、仪器条件的选择1入射光波长的选择一、条件的选择max第93页/共158页2023/2/2394浓度测量值的相对误差（c/c）不仅与仪器的透光度误差T 有关，而且与其透光度读数T 的值也有关。T=1%，溶液浓度相对误差c/c与其透光度T 的关系曲线如右图。由图可见T=1%，T 在20%65%之间时，浓度相对误差较小，此为最佳读数范围。所以要求选择适宜的吸光度范围（0.），以使测量结果的误差最小。2.吸光度范围的控制 措施：（a）控制溶液的浓度；（b）选择不同厚度的比色 皿，改变光程长度。第94页/共158页3狭缝宽度的选择一般来说，狭缝宽度大约是试样吸收峰半宽度的l/10狭缝入射光单色性灵敏度降低曲线偏离定律狭缝能量小，电子不能发生跃迁狭缝宽度影响测定的灵敏度和校正曲线的线性范围。第98页/共158页吸收池的厚度应一致，透光性能要好；对于吸光度的溶液，应选用厚的吸收池；相反，对于的溶液，应选用薄的吸收池，使吸光度A控制在范围内，从而减小吸光度误差。4吸收池的选择第99页/共158页反应的生成物必须在紫外-可见光区有较强的吸光能力，即摩尔吸光系数较大；反应应有较高的选择性，被测组分经反应生成的化合物的吸收曲线与其他共存组分的吸收曲线有明显的差别；反应生成物有足够的稳定性，以保证测量过程中溶液的吸光度不改变；反应生成物的组成恒定。(二)、显色条件的选择常见的显色反应有配位反应、氧化还原反应及增加生色基团的衍生化反应。这些反应应满足：第100页/共158页1显色剂的用量（过量、适量、定量）浅红桔红浅红显色剂的量是通过实验确定，即保持被测组分浓度和其他条件不变，加入不同量的显色剂，测定其吸光度A并作图。第101页/共158页（a）：开始随着显色剂用量的增加，吸光度不断增加，当增加到一定值时，吸光度不再增加，出现ab平坦部分，这意味着显色剂用量已足够了，我们可以在ab之间选择合适的显色剂用量。(a)(c)(b)（b）：曲线平坦部分很窄，当显色剂用量继续增加时，吸光度将降低。因此必须控制好显色剂的用量，才能进行被测组分的测定。（c）：当显色剂的用量不断增大时，吸光度不断增大，对于这种情况，只有严格控制显色剂的用量才能进行测定。这种情况一般只用于定性，而不用于定量。第102页/共158页显色反应最适宜的pH范围可通过实验来确定：测定某一固定浓度的试液的吸光度随溶液pH的变化，以吸光度为纵坐标，溶液pH为横坐标作图，曲线的平直部分，即吸光度恒定部分所对应的pH范围就是最适宜的pH范围。2溶液pHpH第103页/共158页通过试验测定溶液在某波长下的吸光度随时间 变化的曲线，以确定显色反应所需的最佳时间。3显色温度一般均在室温下进行。显色反应最适宜的温度也是通过实验测定吸光度与温度的变化曲线来选择。要求待测溶液与标准溶液 在相同温度下进行测定4显色时间第104页/共158页当试样基体有色(如试样溶液中混有其它有色离子)，但显色剂无色，且不与试样中被测成分以外的其它成分显色时，可用试样空白校正。所谓试样空白，系不加显色剂但按显色反应相同条件进行操作的试样溶液。(三)、参比溶液的选择1溶剂参比溶液当试样溶液的组成较为简单、共存的其他组分很少且对测定波长的光几乎无吸收时，可采用溶剂作为参比溶液，它可消除溶剂、吸收池等因素的影响。2试样参比溶液第105页/共158页用不含被测组分的试样，在相同条件下与被测试样同时进行处理，由此得到平行操作参比溶液。如在进行某种药物浓度监测时，取正常人的血样与待测血药浓度的血样进行平行操作处理，前者得到的溶液即为平行操作参比溶液。3试剂参比溶液如果显色剂或其他试剂在测定波长有吸收，按显色反应相同的条件，不加入试样，同样加入试剂和溶剂作为参比溶液。这种参比溶液可消除试剂产生吸收的影响4平行操作参比溶液第106页/共158页课堂互动测定试样时，吸光度的读数应控制在0.20.7范围内。若吸光度读数不在此范围，可采用哪些方法进行调整?第113页/共158页二、紫外可见分光光度计的类型和光学性能单波长分光光度计双波长分光光度计双光束分光光度计单光束分光光度计类型第120页/共158页(一)单波长单光束分光光度计光源：钨灯或氢灯型号：国产721型、751型、XG-125型英国SP500型、伯克曼DU-8型等721型分光光度计采用自准式棱镜色散系统，波长范围为360-800nm，用钨灯作光源，光电管作检测器第121页/共158页1.光源：2.聚光透镜；3.色散棱镜；4.准直镜；5.保护玻璃；6.狭缝；7.反射镜；8.光栏；9.聚光透镜；10.吸收池；11.光门；12.保护玻璃；13.光电管第122页/共158页从同一光源发出的光分为两束，分别经过两个单色器后，得到两束不同波长(1和2)的光，利用切光器使两束光以一定的频率交替照射同一吸收池，最后由检测器显示出两个波长下的吸光度差值(A)（二）双波长分光光度计第123页/共158页1.波长范围：195820nm2.波长准确度：仪器显示的波长数值与实际 波长值 间的误差，3.波长重复性：重复使用同一波长，单色光实 际波长的变动值，4.透光率测量范围：0150（T）5.吸光度测量范围：-0.1730+2.00(A)光学性能光学性能第124页/共158页6.光度准确度：以透光率测量值的误差表示，7.光度重复性：同样情况下重复测量透光率的变动性：8.分辨率：单色器分辨两条靠近的谱线的能力。260nm处9.杂散光：通常以测光讯号较弱的波长处所含杂散光的强度百分比为指标第125页/共158页紫外可见分光光度的使用紫外可见分光光度的使用2023/2/23126第126页/共158页2023/2/23127第127页/共158页721721分光光度计操作步骤分光光度计操作步骤1.1.预热仪器。为使测定稳定，将电源开关打开，使仪器预热20min20min，为了防止光电管疲劳，不要连续光照。预热仪器和不测定时应将比色皿暗箱盖打开，使光路切断。2.2.选定波长。根据实验要求，转动波长调节器，使指针指示所需要的单色光波长。3.3.固定灵敏度档。旋动灵敏度档，使其固定于某一档，在实验过程中不再变动。一般测量固定在“1 1”档。“0 0”点。轻轻旋动调“0 0”电位器，使读数表头指针恰好位于透光度为“0 0”处（此时，比色皿暗箱盖是打开的，光路被切断，光电管不受光照）。“0 0”和调“100100”。比色皿中装入参比溶液近4/5,4/5,放入比色皿座架的第一格内，其它格内放入样品或标样，把比色皿暗箱盖子轻轻盖上，用参比溶液重复调“0 0”和“100%100%”,至仪器稳定。6.6.测定。轻轻拉动比色皿座架拉杆，使样品或标样溶液进入光路，此时表头指针所示为该溶液的吸光度A A。读数后，打开比色皿暗箱盖。7.7.关机。实验完毕，整理仪器，切断电源。将比色皿取出洗净，并将比色皿座架及暗箱用软纸擦净。2023/2/23128第128页/共158页2023/2/23129液晶显示屏氘灯钨灯室操作键盘比色皿室 岛津UV1700紫外可见分光光度计第129页/共158页2023/2/23130分光光度计使用注意事项p 对仪器工作环境的要求 稳固的工作台 温度、湿度合适p 仪器保养和维护方法 仪器工作电源 光源使用注意事项 单色器使用注意事项 正确使用吸收池第130页/共158页2023/2/23131比色皿的使用(1)要根据所使用的波长来选择比色皿。石英比色皿和普通硅酸盐玻璃比色皿两种。(2)选择配对良好的比色皿。根据国家检定规程的要求比色皿间的偏差不得超过0.5%，所以比色皿在使用之前，要对比色皿进行透光测定，把偏差小于0.5%的比色皿配对使用。(3)选择合适厚度的比色皿。常用比色皿厚度有1、2、3、5、10cm等，在实际分析工作中，通常根据溶液浓度的不同，选用液槽厚度不同的比色皿，使溶液的吸光度控制在之间。(4)对有挥发性的样品，选择带盖比色皿。1.比色皿的选择第131页/共158页2.比色皿的使用方法(1)拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。(2)不得将光学面与硬物或脏物接触。(3)测定有色溶液吸光度时，一定要用有色溶液润洗比色皿内壁几次，以免改变有色溶液的浓度。另外，在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差。(4)盛装溶液时，高度为比色皿的4/5处即可。(5)比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸吸干，以保护透光面。(6)凡含有腐蚀玻璃的物质的溶液，不得长期盛放在比色皿中。(7)不能将比色皿放在火焰或电炉上进行加热或干燥箱内烘烤。2023/2/23132第132页/共158页3.比色皿的清洗 (1)每次做完实验时，应立即洗净比色皿。清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。如比色皿被有机物沾污，可用盐酸-乙醇混合洗涤液（1:2）浸泡片刻，再用水冲洗。不能用碱溶液或铬酸洗液等氧化性强的洗涤液洗比色皿，以免损坏。(2)不能用毛刷清洗比色皿，以免损伤它的透光面。2023/2/23133第133页/共158页一、单组分的定量方法吸光系数法标准曲线法标准对比法(一)吸光系数法A=c l已知 l 和吸光系数或E1cm1，由A求出被测物的浓度c第五节 测定方法第134页/共158页例5：维生素B12的水溶液在361nm处的E1cm1值是207，盛于lcm吸收池中，测得溶液的吸光度为，求溶液的浓度。A=E1cm1 c l得：根据公式第135页/共158页(二)标准曲线法第136页/共158页绘制标准曲线应注意以下几点：(1)按选定浓度，配制一系列不同浓度的标准溶液，浓度范围应包括未知试样浓度的可能变化范围。一般五到七个点。(2)测定时每一浓度至少应同时作两管(平行管)，同一浓度平行管测定得到的吸光度值相差不大时，取其平均值(3)用坐标纸绘制标准曲线。也可用最小二乘法处理，由一系列的吸光度浓度数据求出直线回归方程。(4)绘制完后应注明测试内容和条件，如测定波长、吸收池厚度、操作时间等。第137页/共158页c1c2第138页/共158页在相同条件下测定试样溶液吸光度(Ax)和某一浓度的标准溶液的吸光度(As)，由标准溶液的浓度(cs)可计算出试样中的被测物浓度(cx)(三)标准对比法As=csl Ax=cxl 同种物质、同台仪器、同一波长、l相同第139页/共158页二、多组分的定量方法(一).各组分的吸收峰所在波长处，其他组分没有吸收Aa=aca lAb=bcb l第140页/共158页感谢您的观看！第158页/共158页