生物药物分析教学提纲.ppt

生物药物分析 第三节第三节 生物药物概述生物药物概述一、生物药物的范围一、生物药物的范围1、生化药物、生化药物2、生物技术药物、生物技术药物3、生物制品、生物制品二、生物药物的研制发展过程二、生物药物的研制发展过程第一代第一代第二代第二代第三代第三代三、生物药物的分类三、生物药物的分类（一）按生物药物的化学本质和化学性（一）按生物药物的化学本质和化学性质来分类质来分类1、氨基酸及其衍生物类药物类、氨基酸及其衍生物类药物类2、有机酸、醇酮类、有机酸、醇酮类3、维生素、维生素4、酶及辅酶类、酶及辅酶类5、酯类、酯类6、多肽和蛋白质类、多肽和蛋白质类7、核酸及其降解物和衍生物、核酸及其降解物和衍生物8、糖类、糖类9、生物技术药物类、生物技术药物类10、生物制品类、生物制品类（二）按生物药物的用途分类（二）按生物药物的用途分类1、治疗药物、治疗药物2、预防药物、预防药物3、诊断药物、诊断药物4、用作其它生物医药用品、用作其它生物医药用品四、生物药物的性质四、生物药物的性质五、生物药物的特点五、生物药物的特点1、相对分子质量的测定、相对分子质量的测定2、生物活性检查、生物活性检查3、安全性检查、安全性检查4、效价测定、效价测定5、生化法确证结构、生化法确证结构 第四节第四节 生物药物的科学管理生物药物的科学管理一、药品质量标准制定原则一、药品质量标准制定原则（一）药品质量标准制定原则（一）药品质量标准制定原则（二）药典的内容（二）药典的内容1、国家药典、国家药典2、部颁药品标准和副药典、部颁药品标准和副药典3、地方药品标准、地方药品标准二、生物制品的标准化二、生物制品的标准化（一）生物制品规程（一）生物制品规程（二）生物制品的国家标准品和国家参（二）生物制品的国家标准品和国家参考品考品三、生物药物的科学管理三、生物药物的科学管理 第五节第五节 生物药物的分析检验生物药物的分析检验一、生物药物质量检验的程序与方法一、生物药物质量检验的程序与方法1、药物的取样、药物的取样2、药物的鉴别试验、药物的鉴别试验3、药物的杂质检查、药物的杂质检查4、药物的安全性检查、药物的安全性检查5、药物的含量（效价）测定、药物的含量（效价）测定6、检验报告的书写、检验报告的书写二、生物制品的质量检定二、生物制品的质量检定（一）生物制品的理化检定（一）生物制品的理化检定1、物理性状检查、物理性状检查（1）外观检查）外观检查（2）真空度及溶解时间）真空度及溶解时间2、蛋白质含量测定、蛋白质含量测定3、防腐剂含量测定、防腐剂含量测定4、纯度检查、纯度检查5、其它测定项目、其它测定项目（1）水分含量测定）水分含量测定（2）氢氧化铝与磷酸铝含量测定）氢氧化铝与磷酸铝含量测定（3）磷含量测定）磷含量测定（二）生物制品的安全检定（二）生物制品的安全检定1、一般安全性检查、一般安全性检查2、杀菌、灭活和脱毒情况的检查、杀菌、灭活和脱毒情况的检查3、外源性污染检查、外源性污染检查4、过敏性物质检查、过敏性物质检查（三）生物制品的效力鉴定（三）生物制品的效力鉴定1、动物保护力试验、动物保护力试验2、活疫苗的效力测定、活疫苗的效力测定3、抗毒素和类毒素的单位测定、抗毒素和类毒素的单位测定4、血清学试验、血清学试验三、生物药物常用的定量分析方法三、生物药物常用的定量分析方法1、酶法、酶法1）酶活力测定法：测定酶的含量或活性）酶活力测定法：测定酶的含量或活性2）酶分析法：以酶为分析工具测定待测物质）酶分析法：以酶为分析工具测定待测物质2、电泳法、电泳法3、理化测定法、理化测定法4、生物检定法：、生物检定法：利用药物对生物体的作用来测利用药物对生物体的作用来测定效价或生物活性的方法。定效价或生物活性的方法。1）药物的效价测定）药物的效价测定2）微量生理活性物质的测定）微量生理活性物质的测定3）某些有害杂质的限度检查）某些有害杂质的限度检查生物药物分析信息的获取生物药物分析信息的获取一、常用参考书一、常用参考书二、各国药典二、各国药典三、常用期刊三、常用期刊四、数据库资源四、数据库资源第二章第二章 酶分析法在生物药物分析中酶分析法在生物药物分析中 的应用的应用一、以酶为分析对象，通过底物或者产一、以酶为分析对象，通过底物或者产物浓度的改变来测定生物样品中所含的物浓度的改变来测定生物样品中所含的酶量或者酶活力的测定，称为酶分析法酶量或者酶活力的测定，称为酶分析法二、以酶为分析试剂，测定需要检测的二、以酶为分析试剂，测定需要检测的物质，称为酶法分析。物质，称为酶法分析。酶法分析的优点：酶法分析的优点：1、专一性强、专一性强2、效率高、效率高3、反应温和、反应温和4、方法简便、方法简便第一节第一节 酶法分析的原理酶法分析的原理一、酶的定义和性质一、酶的定义和性质:1、蛋白质、蛋白质2、专一性的催化功能、专一性的催化功能3、活性受到多种因素的影响、活性受到多种因素的影响商品化酶测定试剂盒商品化酶测定试剂盒二、酶反应的动力学二、酶反应的动力学米氏曲线：米氏曲线：低浓度时，产物浓度随底物低浓度时，产物浓度随底物浓度的增加而增加；高浓度时，酶和底物浓度的增加而增加；高浓度时，酶和底物结合饱和，产物浓度保持不变。结合饱和，产物浓度保持不变。米氏常数米氏常数米氏方程米氏方程第二节第二节 酶试剂的动力学原理酶试剂的动力学原理一、酶试剂的主要类型一、酶试剂的主要类型1、单酶法：应用单一酶测定底物、单酶法：应用单一酶测定底物2、多酶法：需要两个或者两个以上、多酶法：需要两个或者两个以上的酶耦联起来测定的酶耦联起来测定二、酶法分析的测定方法二、酶法分析的测定方法（一）测定酶反应的速率（一）测定酶反应的速率1、连续监测法：每隔一段时间读取、连续监测法：每隔一段时间读取一下数据，求出酶反应的速率一下数据，求出酶反应的速率2、固定时间法：在反应途中加入终、固定时间法：在反应途中加入终止剂终止反应，求出这段时间内反止剂终止反应，求出这段时间内反应的速率。应的速率。主要用于测定酶活力主要用于测定酶活力（二）测浓度（二）测浓度1、终点法：反应完全结束后测定、终点法：反应完全结束后测定底物或者产物的浓度底物或者产物的浓度2、固定时间法：在固定的反应时、固定时间法：在固定的反应时间终止反应，测定反应物或者产物间终止反应，测定反应物或者产物浓度。浓度。主要用于测定底物主要用于测定底物第三节第三节 酶法分析的检测方法酶法分析的检测方法酶反应中底物的减少，产物的增加酶反应中底物的减少，产物的增加量必须借助一定的检测方法进行检量必须借助一定的检测方法进行检测。测。一、紫外可见分光光度法一、紫外可见分光光度法酶反应中，当底物或产物在紫外酶反应中，当底物或产物在紫外可见光区有吸收峰时，可应用此法可见光区有吸收峰时，可应用此法进行检测。紫外可见分光图谱中，进行检测。紫外可见分光图谱中，吸收峰的峰值与浓度成正比。吸收峰的峰值与浓度成正比。二、荧光光度法二、荧光光度法酶反应中，当底物或者产物有荧光吸酶反应中，当底物或者产物有荧光吸收时，可用此法进行检测。收时，可用此法进行检测。检测灵敏度较高，专一性强。检测灵敏度较高，专一性强。三、氧电极法三、氧电极法酶反应过程中，产物有二氧化碳和酶反应过程中，产物有二氧化碳和氧气时，可以通过这些气体的改变氧气时，可以通过这些气体的改变量来进行检测。量来进行检测。灵敏度较高。灵敏度较高。四、固定化酶和酶电极法四、固定化酶和酶电极法固定化酶电极（有传感功能）酶固定化酶电极（有传感功能）酶电极电极酶反应过程中产生的离子含量（如氢酶反应过程中产生的离子含量（如氢离子）的变化导致电流量的改变。离子）的变化导致电流量的改变。通过酶电极显示的电流量的改变测定通过酶电极显示的电流量的改变测定底物的浓度。底物的浓度。固定化酶的优点：固定化酶的优点：1、可以反复使用、可以反复使用2、比较稳定、比较稳定3、利于产物提纯、利于产物提纯五、放射性同位素测定五、放射性同位素测定酶反应过程中对底物、产物或者酶酶反应过程中对底物、产物或者酶进行放射性同位素标记。通过测定进行放射性同位素标记。通过测定同位素的含量来测定底物浓度。同位素的含量来测定底物浓度。有污染性。有污染性。第四节第四节 终点测定法终点测定法酶法分析是以酶作为试剂分析非酶类酶法分析是以酶作为试剂分析非酶类物质。物质。反应使底物完全转化为产物，通过测反应使底物完全转化为产物，通过测定底物的减少量，产物的增加量来定定底物的减少量，产物的增加量来定量待测物的方法称为终点测定法。量待测物的方法称为终点测定法。一、应用终点法的条件一、应用终点法的条件（一）有作用于待测物质的酶和酶制（一）有作用于待测物质的酶和酶制剂剂（二）能够确定使酶反应接近进行完（二）能够确定使酶反应接近进行完全的条件全的条件（三）反应中底物的减少，产物的增（三）反应中底物的减少，产物的增加可用某种检测方法进行测定。加可用某种检测方法进行测定。二、终点法的种类二、终点法的种类（一）单酶反应测定法（一）单酶反应测定法1、利用底物量的减少进行测定、利用底物量的减少进行测定2、利用产物量的增加进行测定、利用产物量的增加进行测定3、辅酶变化量进行测定、辅酶变化量进行测定（二）多酶耦联测定（二）多酶耦联测定当被分析的底物或者反应产物没有易当被分析的底物或者反应产物没有易于检测的方法时，可以借助加入另一于检测的方法时，可以借助加入另一种酶，使之产生易于检测的产物或者种酶，使之产生易于检测的产物或者底物。底物。被耦联的酶起指示剂的作用，称为指被耦联的酶起指示剂的作用，称为指示酶。示酶。第五节第五节 反应速率法反应速率法测定反应的初速率，从而计算被测定反应的初速率，从而计算被测物质的浓度。测物质的浓度。一般此种方法很少用。一般此种方法很少用。第六节第六节 酶循环放大分析法酶循环放大分析法用于测定体液中的微量物质。用于测定体液中的微量物质。酶循环法是利用酶的底物特异性来酶循环法是利用酶的底物特异性来放大靶物质（被测物质）的测定方放大靶物质（被测物质）的测定方法。此法循环靶物质，增加了靶物法。此法循环靶物质，增加了靶物质的量，利于测定，减少干扰。质的量，利于测定，减少干扰。缺点：缺点：1、工具酶的用量为普通酶法的、工具酶的用量为普通酶法的10倍，费用较高。倍，费用较高。2、酶循环法中所需的试剂价格较、酶循环法中所需的试剂价格较高。高。3、体液中某些微量物质的测定缺、体液中某些微量物质的测定缺少合适的工具酶。少合适的工具酶。第七节第七节 生物传感器与酶传感器生物传感器与酶传感器一、生物传感器一、生物传感器1、概述、概述传感器：能感受一种信息并可将这传感器：能感受一种信息并可将这种信息转变成可以测量的信号的器种信息转变成可以测量的信号的器件。测量的信号一般为电子信号。件。测量的信号一般为电子信号。生物传感器：利用生物功能物质作为生物传感器：利用生物功能物质作为识别器件而制成的传感器。识别器件而制成的传感器。敏感元件：酶、抗体、微生物（测定敏感元件：酶、抗体、微生物（测定物理量、化学量的变化）物理量、化学量的变化）检测信号：电信号检测信号：电信号优点：选择性好优点：选择性好 干扰少干扰少2、生物传感器的组成、生物传感器的组成（1）可以选择性识别被测物质的部）可以选择性识别被测物质的部分分感受器感受器用能识别被测物质的功能物质酶，用能识别被测物质的功能物质酶，抗体等用固定化技术固定到适当的抗体等用固定化技术固定到适当的膜上，形成功能性生物敏感膜。膜上，形成功能性生物敏感膜。（2）发出电信号的电化学装置，）发出电信号的电化学装置，把发生在敏感膜上的生物反应产生把发生在敏感膜上的生物反应产生的变化转化成电信号输出。的变化转化成电信号输出。3、生物传感器的分类、生物传感器的分类（1）按照敏感材料分类：）按照敏感材料分类：酶、微生物、免疫、细胞器、组织酶、微生物、免疫、细胞器、组织传感器传感器（2）按照信号转换器分类：）按照信号转换器分类：电化学、半导体、测光型、测热型、电化学、半导体、测光型、测热型、测声型生物传感器测声型生物传感器4、生物传感器的特点、生物传感器的特点（1）具有分子识别元件，不需要样品）具有分子识别元件，不需要样品的预处理。的预处理。（2）体积小，可以实现连续监测。）体积小，可以实现连续监测。（3）响应快、样品用量少，且敏感材）响应快、样品用量少，且敏感材料是固定化的，可以反复多次使用。料是固定化的，可以反复多次使用。（4）传感器成本远低于大型仪器，便）传感器成本远低于大型仪器，便于推广普及。于推广普及。5、生物传感器的应用、生物传感器的应用（1）酶传感器：葡萄糖、氨基酸、）酶传感器：葡萄糖、氨基酸、尿素尿素（2）细胞器传感器：）细胞器传感器：NADH（3）微生物传感器：葡萄糖、醋酸）微生物传感器：葡萄糖、醋酸（4）免疫传感器：梅毒抗体、蛋白）免疫传感器：梅毒抗体、蛋白质质二、酶传感器二、酶传感器（一）概述（一）概述底物（待测对象）底物（待测对象）酶膜酶膜产物产物转换元件转换元件光信号光信号电信号电信号（二）结构（二）结构1、酶固定化、酶固定化2、与电化学传感器相连、与电化学传感器相连酶固定法的方法：酶固定法的方法：1、吸附法：、吸附法：酶分子通过极性键、氢键、疏水力等酶分子通过极性键、氢键、疏水力等作用吸附在不溶性载体上。作用吸附在不溶性载体上。常用载体：活性碳、多孔玻璃、氧化常用载体：活性碳、多孔玻璃、氧化铝铝优点：步骤简单、对酶损失小优点：步骤简单、对酶损失小缺点：生物活性物质易从电极中渗出缺点：生物活性物质易从电极中渗出举例：脂肪酶、过氧化物酶举例：脂肪酶、过氧化物酶2、凝胶或聚合物包埋法、凝胶或聚合物包埋法将酶分子包埋在凝胶或者聚合物的细将酶分子包埋在凝胶或者聚合物的细微格子里制成固定化。微格子里制成固定化。常用凝胶：聚丙烯酰胺、海藻酸钙等常用凝胶：聚丙烯酰胺、海藻酸钙等缺点缺点：（：（1）孔径的大小导致高分子量）孔径的大小导致高分子量的底物反应受阻（的底物反应受阻（2）使小分子量的酶）使小分子量的酶漏出漏出举例：木瓜蛋白酶、纤维素酶举例：木瓜蛋白酶、纤维素酶3、交联法、交联法用双功能基试剂将酶和凝胶结合。用双功能基试剂将酶和凝胶结合。将吸附在膜表面的活性分子之间进行将吸附在膜表面的活性分子之间进行交联，可以避免解吸附和酶从网格中交联，可以避免解吸附和酶从网格中漏出。漏出。缺点：反应条件苛刻，不易掌握。缺点：反应条件苛刻，不易掌握。双功能试剂：戊二醛双功能试剂：戊二醛4、共价键的连接、共价键的连接采用共价键结合采用共价键结合优点：酶不易脱落优点：酶不易脱落（二）酶传感器的分类（二）酶传感器的分类测定电流测定电流测定电位测定电位1、电流型酶传感器、电流型酶传感器酶催化反应的反应物或产物在电极上酶催化反应的反应物或产物在电极上发生氧化还原反应产生电流，产生的发生氧化还原反应产生电流，产生的电流与被测物的浓度成比例电流与被测物的浓度成比例使用的酶为氧化还原酶使用的酶为氧化还原酶（1）O2（2）H2O22、电位型：检测离子浓度、电位型：检测离子浓度（四）酶传感器应用（四）酶传感器应用 第一节第一节 概述概述一、电泳一、电泳定义：带电粒子在电场中向与自身带定义：带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。相反电荷的电极移动的现象。分析带电的生物大分子：分析带电的生物大分子：蛋白质蛋白质 核酸核酸电泳法分析电泳法分析电泳法：电泳法：带电荷的样品在惰性支持介质带电荷的样品在惰性支持介质中，在电场的作用下，向对应的电中，在电场的作用下，向对应的电极方向按照各自的速度进行泳动，极方向按照各自的速度进行泳动，使组分分离程狭窄的区带，进行性使组分分离程狭窄的区带，进行性质和质量的分析。质和质量的分析。二、电泳技术的分类：二、电泳技术的分类：纸电泳纸电泳 醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳2、按凝胶形状分、按凝胶形状分 水平电泳水平电泳 垂直电泳垂直电泳1、按支持物分、按支持物分 第二节第二节 基本理论基本理论迁移率：带电颗粒在单位电场强度迁移率：带电颗粒在单位电场强度下移动的速率。下移动的速率。1、带电颗粒的性质、带电颗粒的性质1）带电荷多，迁移快）带电荷多，迁移快2）体积小，迁移快）体积小，迁移快影响迁移率的主要因素影响迁移率的主要因素2、电场强度、电场强度电压的大小：电场强度高，迁移快电压的大小：电场强度高，迁移快常压电泳：常压电泳：100500V，电泳时间长电泳时间长高压电泳：高压电泳：5001000V，电泳时间短，电泳时间短，电流大，需要冷却装置电流大，需要冷却装置3、溶液的、溶液的pH值值pH值影响带电颗粒解离的程度，决定值影响带电颗粒解离的程度，决定物质所带的电荷数目。物质所带的电荷数目。蛋白质是两性电解质，蛋白质是两性电解质，pH值离等电点值离等电点越远，颗粒所带电荷就越多，迁移快。越远，颗粒所带电荷就越多，迁移快。4、溶液的离子强度、溶液的离子强度离子强度高，迁移慢。离子强度高，迁移慢。在保持足够缓冲能力前提下，离子强度在保持足够缓冲能力前提下，离子强度较小为好。较小为好。通常缓冲液离子强度为：通常缓冲液离子强度为：0.050.1mol/L5、电渗作用、电渗作用液体对固体支持物的相对移动。液体对固体支持物的相对移动。第三节第三节 纸电泳法纸电泳法应用最早应用最早目前不太用目前不太用电泳介质：滤纸电泳介质：滤纸1、仪器、仪器2、操作法、操作法1）电泳缓冲液：枸橼酸盐缓冲液）电泳缓冲液：枸橼酸盐缓冲液pH3.02）滤纸处理：甲酸浸泡）滤纸处理：甲酸浸泡 漂洗漂洗 烘干烘干3）点样）点样 湿点：浸泡湿点：浸泡 取出取出 加样加样 干点：点样于滤纸上干点：点样于滤纸上 吹干吹干 喷湿喷湿4）电泳：）电泳：电压梯度：电压梯度：1820V/cm时间：时间：12小时小时吹干、检查吹干、检查5）含量测定：紫外灯下检视，剪下斑）含量测定：紫外灯下检视，剪下斑点，测定吸光度点，测定吸光度 分离小分子电荷物质分离小分子电荷物质如氨基酸、如氨基酸、短肽、核酸等。短肽、核酸等。适用适用 第四节第四节 琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶具有较大的孔径，适于大琼脂糖凝胶具有较大的孔径，适于大分子物质的分离，主要用来检测核酸。分子物质的分离，主要用来检测核酸。核酸在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率取决核酸在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率取决于：于：1、琼脂糖浓度：浓度小，迁移快、琼脂糖浓度：浓度小，迁移快2、核酸分子大小：分子大，迁移慢、核酸分子大小：分子大，迁移慢3、核酸的形状：形状紧密成球形，、核酸的形状：形状紧密成球形，迁移快迁移快 Syngene GeneGenius全自动凝胶成全自动凝胶成像系统像系统 第五节第五节 醋酸纤维素薄膜电泳法醋酸纤维素薄膜电泳法优点：优点：1、电泳后区带界限清晰、电泳后区带界限清晰2、通电时间短（、通电时间短（20min1h）3、对各种蛋白几乎不吸附，因此无、对各种蛋白几乎不吸附，因此无 拖尾现象拖尾现象4、对染料也没有吸附，无样品处几、对染料也没有吸附，无样品处几 乎完全无色乎完全无色适用范围：分离极性大分子适用范围：分离极性大分子操作：操作：1、仪器装置、仪器装置2、试剂：、试剂：1）缓冲液：巴比妥）缓冲液：巴比妥PH8.62）染色液：氨基黑）染色液：氨基黑3）漂洗液：乙醇、冰醋酸）漂洗液：乙醇、冰醋酸4）透明液：冰醋酸、乙醇）透明液：冰醋酸、乙醇3、操作法：、操作法：1）处理薄膜）处理薄膜2）点样）点样3）电泳：）电泳：1012V/cm电压梯度电压梯度4）染色）染色5）透明）透明5）含量测定）含量测定洗脱法：吸干洗脱法：吸干 剪下区带剪下区带 测定吸测定吸 光度光度扫描法：干燥扫描法：干燥 色谱扫描仪扫描区色谱扫描仪扫描区 带大小带大小应用：血清蛋白、血球蛋白、球蛋白、应用：血清蛋白、血球蛋白、球蛋白、糖蛋白等分离分析糖蛋白等分离分析 第六节第六节 聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法 以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质优点：优点：1、对样品的吸附作用小，电渗作用、对样品的吸附作用小，电渗作用 小小2、可以通过调整聚丙烯酰胺的浓度、可以通过调整聚丙烯酰胺的浓度 来调整空隙大小，筛选特定分子量来调整空隙大小，筛选特定分子量 的物质的物质3、对热稳定，凝胶透明，电泳结果、对热稳定，凝胶透明，电泳结果 易于观察易于观察缺点：神经毒缺点：神经毒1、仪器装置：垂直电泳、仪器装置：垂直电泳2、试剂、试剂:缓冲液缓冲液 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 染色液：考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝 脱色液：乙醇、冰醋酸脱色液：乙醇、冰醋酸3、操作法：、操作法：1）制胶）制胶2）电泳）电泳3）染色和脱色）染色和脱色4）观察）观察定量检测：扫描区带面积定量检测：扫描区带面积第七节第七节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白质分离蛋白质SDS使蛋白质变性，形成一级结构使蛋白质变性，形成一级结构电泳只取决于分子量的大小电泳只取决于分子量的大小用于测定蛋白质的分子量用于测定蛋白质的分子量 第八节第八节 等电聚焦等电聚焦定义：定义：在电泳槽中放入载体两性电解质，在电泳槽中放入载体两性电解质，当通直流电时，两性电解质即形成一当通直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的个由阳极到阴极逐步增加的pH值梯度。值梯度。分离蛋白样品时，不同的蛋白质移动分离蛋白样品时，不同的蛋白质移动到与其等电点相当的到与其等电点相当的pH值位置上。值位置上。优点优点:分辨率高分辨率高可直接测定蛋白质的等电点可直接测定蛋白质的等电点缺点：缺点：1、要求用无盐溶液，而无盐溶液、要求用无盐溶液，而无盐溶液 中，蛋白质可能发生沉淀中，蛋白质可能发生沉淀2、不适用在等电点不溶或者发生变、不适用在等电点不溶或者发生变 性的蛋白质性的蛋白质载体两性电解质的条件：载体两性电解质的条件：1、在等电点处有足够的缓冲力，不、在等电点处有足够的缓冲力，不 致被其它物质改变致被其它物质改变pH值值2、分子量要小，使之可与被分离的高、分子量要小，使之可与被分离的高 分子物质分离分子物质分离3、化学组分不同于被分离物质，不干、化学组分不同于被分离物质，不干 扰测定扰测定4、应不与分离物质反应或变性、应不与分离物质反应或变性pH梯度支持介质：聚丙烯酰胺凝胶梯度支持介质：聚丙烯酰胺凝胶 （最常用）（最常用）琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶染色：不可用染色剂直接染色，因为常染色：不可用染色剂直接染色，因为常用的蛋白质染色剂也能和两性电解质结用的蛋白质染色剂也能和两性电解质结合，因此应先将凝胶浸泡在合，因此应先将凝胶浸泡在5的三氯的三氯醋酸中去除两性电解质，然后再以适当醋酸中去除两性电解质，然后再以适当的方法染色。的方法染色。适用范围：分离蛋白质和多肽适用范围：分离蛋白质和多肽仪器仪器 第九节第九节 高效毛细管电泳法高效毛细管电泳法HPCE(high performance capillary electrophoresis)以弹性石英毛细管为分离通道以弹性石英毛细管为分离通道以高压直流电场为驱动力以高压直流电场为驱动力依据样品中各组分之间淌度和分依据样品中各组分之间淌度和分 配行为上的差异而实现分离的分配行为上的差异而实现分离的分 析方法析方法优点：优点：毛细管表面积大，利于高电压下毛细管表面积大，利于高电压下的热量扩散的热量扩散高分辨率高分辨率快捷快捷仪器化仪器化类型多样：类型多样：1、单根毛细管电泳、单根毛细管电泳 空管空管 填充管填充管2、陈列毛细管电泳、陈列毛细管电泳3、芯片式毛细管电泳、芯片式毛细管电泳4、联用、联用毛细管电泳的研究：毛细管电泳的研究：应用应用方法研究方法研究应用：应用：1、氨基酸、肽、蛋白质分离、氨基酸、肽、蛋白质分离2、糖分析、手性药物等的快速分析、糖分析、手性药物等的快速分析3、核酸序列分析、核酸序列分析4、单个细胞和病毒的分析、单个细胞和病毒的分析使分析科学从微升进入纳升水平使分析科学从微升进入纳升水平使单细胞、单分子分析成为可能使单细胞、单分子分析成为可能一、毛细管电泳分离模式一、毛细管电泳分离模式1、毛细管区带电泳：、毛细管区带电泳：CZE分离机理：基于被分离物质的荷质分离机理：基于被分离物质的荷质 比的差异比的差异用于分析荷电粒子：氨基酸用于分析荷电粒子：氨基酸 多肽多肽 蛋白质等蛋白质等2、1984年年Terabe等提出的胶束电动等提出的胶束电动 毛细管色谱毛细管色谱（MEKC）不仅能测离子，而且能测中性分不仅能测离子，而且能测中性分 子、手性对映体等。子、手性对映体等。二、毛细管电泳的特点二、毛细管电泳的特点弹性聚酰亚胺涂层熔融石英管，弹性聚酰亚胺涂层熔融石英管，内径内径25100微米。微米。1、容积小，表面积大，散热快，可、容积小，表面积大，散热快，可 承受高电场承受高电场2、可使用自由溶液、凝胶等为支持、可使用自由溶液、凝胶等为支持 介质介质优点：优点：1、高效、高效2、快速：几十秒至十几分钟、快速：几十秒至十几分钟3、微量：、微量：1微升进样量微升进样量 消耗体积消耗体积150微升之间微升之间4、多模式分离，却仅需一台仪器、多模式分离，却仅需一台仪器5、应用范围广，从无机离子到中性、应用范围广，从无机离子到中性 分子到单个细胞，均能分析分子到单个细胞，均能分析6、自动化程度高、自动化程度高7、洁净，通常使用水溶液，对人和、洁净，通常使用水溶液，对人和 环境无害。环境无害。8、经济，实验中使用的缓冲液量少。、经济，实验中使用的缓冲液量少。总结总结高灵敏度、高分辨率、高速度、低成高灵敏度、高分辨率、高速度、低成本、低耗样、应用范围广本、低耗样、应用范围广三、毛细管电泳法的基本装置三、毛细管电泳法的基本装置（一）毛细管电泳仪的基本结构（一）毛细管电泳仪的基本结构1、毛细管、毛细管2、进样器：电动进样、进样器：电动进样3、检测器：常用紫外、检测器：常用紫外/可见检测器可见检测器4、电渗与吸附作用、电渗与吸附作用5、毛细管清洗、毛细管清洗6、电源、电源7、温度控制、温度控制 1）冷风）冷风 2）液冷）液冷四、毛细管电泳法的应用四、毛细管电泳法的应用1、分离分析生化样品：无机离子、小、分离分析生化样品：无机离子、小 分子有机物、氨基酸、肽、蛋白、分子有机物、氨基酸、肽、蛋白、核酸核酸2、单细胞分析、单细胞分析3、临床分析较少：样品（血、尿）、临床分析较少：样品（血、尿）成分复杂、分析前处理复杂成分复杂、分析前处理复杂第十节第十节 蛋白质组学研究中的核心技术蛋白质组学研究中的核心技术双向凝胶电泳双向凝胶电泳(Two Dimensional Electrophoresis，2DE)蛋白质组研究蛋白质组研究旨在揭示基因表达的真正执旨在揭示基因表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能。物功能。双向电泳是蛋白质组研究的三大关键核心双向电泳是蛋白质组研究的三大关键核心技术之一技术之一(另两种是质谱技术和蛋白质组另两种是质谱技术和蛋白质组信息学信息学)。操作过程：操作过程：1、2DE 的第一向电泳：等电聚焦电泳的第一向电泳：等电聚焦电泳(Iso-Electric Focusing，IEF)，在，在 IEF 中，蛋白质因等电点不同而被分离中，蛋白质因等电点不同而被分离2、2DE 的第二向电泳：的第二向电泳：SDS-PAGE 电电泳，在泳，在 SDS-PAGE 中，不同分子量的中，不同分子量的蛋白质相互间被分离开蛋白质相互间被分离开3、用考马斯亮兰或银染进行检测，经、用考马斯亮兰或银染进行检测，经 Pdquest 等软件对结果进行比对、解析。等软件对结果进行比对、解析。意义：意义：由于蛋白质的等电点和分子量是两个由于蛋白质的等电点和分子量是两个彼此不相关的重要性质，而彼此不相关的重要性质，而 2DE 同时利用了同时利用了蛋白质间的这两个性质上的差异分离蛋白质，蛋白质间的这两个性质上的差异分离蛋白质，因此因此 2DE 的分离能力非常强大，它甚至能将的分离能力非常强大，它甚至能将细胞中的细胞中的 5000 种蛋白分离开，种蛋白分离开，2DE 在分离在分离蛋白混合样品，比较差异方面有不可替代的蛋白混合样品，比较差异方面有不可替代的作用，结合质谱鉴定技术可查明大型蛋白复作用，结合质谱鉴定技术可查明大型蛋白复合物各组组分，与其它生物技术如分子生物合物各组组分，与其它生物技术如分子生物学、分子遗传工程、免疫学、微量蛋白质的学、分子遗传工程、免疫学、微量蛋白质的自动氨基酸序列分析相结合，可以快速准确自动氨基酸序列分析相结合，可以快速准确地发现和鉴定新的蛋白质。地发现和鉴定新的蛋白质。双向电泳高分辨率和高灵敏度已成为分双向电泳高分辨率和高灵敏度已成为分析复杂蛋白混合物的基本工具。析复杂蛋白混合物的基本工具。第三章第三章 免疫分析法免疫分析法 第一节第一节 概述概述是以特异性抗原抗体反应为基础的分是以特异性抗原抗体反应为基础的分析方法。析方法。1959年，首次将放射性核素示踪技术与年，首次将放射性核素示踪技术与抗原抗体识别相结合，建立了放射免疫抗原抗体识别相结合，建立了放射免疫分析法分析法(RIA)。免疫分析法的优点：免疫分析法的优点：1、高灵敏度、高灵敏度2、高特异性、高特异性3、适于特定复杂体系中的微量组分、适于特定复杂体系中的微量组分应用：应用：1、药物代谢动力学参数的测定、药物代谢动力学参数的测定2、超过安全剂量易发生严重不良反应的临、超过安全剂量易发生严重不良反应的临 床药物血液浓度监测床药物血液浓度监测3、从发酵液或细胞培养液中快速测定有效、从发酵液或细胞培养液中快速测定有效 组分的含量组分的含量4、对药品中是否存在特定的微量有害杂质、对药品中是否存在特定的微量有害杂质 进行评价进行评价 第二节第二节 抗原抗原一、全抗原和半抗原一、全抗原和半抗原（一）定义：（一）定义：在机体中引起特异性免疫应答反应的在机体中引起特异性免疫应答反应的物质。物质。包括两层含义：包括两层含义：免疫原性，促使动物产生抗体免疫原性，促使动物产生抗体抗原特异性，能与抗体结合抗原特异性，能与抗体结合全抗原：同时具有免疫原性和抗原特异性全抗原：同时具有免疫原性和抗原特异性半抗原：只有抗原特异性，没有免疫原性半抗原：只有抗原特异性，没有免疫原性（二）药物分子的抗原性（二）药物分子的抗原性1、药物分子的免疫原性、药物分子的免疫原性 大分子药物（蛋白、多肽）：大分子药物（蛋白、多肽）：全抗原全抗原 小分子药物：半抗原小分子药物：半抗原半抗原药物载体蛋白半抗原药物载体蛋白=合成抗原合成抗原免疫动物免疫动物产生抗药物分子的抗体产生抗药物分子的抗体利用半抗原药物的抗原特性利用半抗原药物的抗原特性免疫分析免疫分析二、人工抗原合成二、人工抗原合成针对半抗原小分子药物，将其人工合成针对半抗原小分子药物，将其人工合成抗原。抗原。早期工作，利用重氮化反应将芳香胺类早期工作，利用重氮化反应将芳香胺类化合物通过酪氨酸残基与蛋白质结合，化合物通过酪氨酸残基与蛋白质结合，形成结合蛋白质。形成结合蛋白质。与之结合的蛋白质称为载体蛋白。与之结合的蛋白质称为载体蛋白。人工抗原合成的方法：化学反应人工抗原合成的方法：化学反应检测：定性检测：定性 定量定量 第三节第三节 抗体抗体定义：抗体是机体经抗原刺激由免疫定义：抗体是机体经抗原刺激由免疫活性细胞产生的一组免疫球蛋白。活性细胞产生的一组免疫球蛋白。IgG在血清免疫求蛋白中的含量最高，在血清免疫求蛋白中的含量最高，高达高达70。是最常用的抗体。是最常用的抗体。一、抗体的制备一、抗体的制备1、抗血清（多克隆抗体）：由抗、抗血清（多克隆抗体）：由抗 原直接免疫动物获得原直接免疫动物获得2、单克隆抗体：小鼠免疫脾细胞、单克隆抗体：小鼠免疫脾细胞 骨髓瘤细胞杂交瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞（一）抗血清的制备（一）抗血清的制备1、免疫原的制备：免疫物质佐剂、免疫原的制备：免疫物质佐剂2、动物免疫：兔、羊、动物免疫：兔、羊3、试血及效价测定、试血及效价测定4、免疫动物血液采集和抗血清的分离、免疫动物血液采集和抗血清的分离（二）单克隆抗体的制备（二）单克隆抗体的制备二、抗体的纯化二、抗体的纯化1、非专一方法（化学方法）：提纯、非专一方法（化学方法）：提纯 或浓缩某一类的免疫球蛋白或浓缩某一类的免疫球蛋白2、专一方法：利用免疫吸附剂和亲、专一方法：利用免疫吸附剂和亲 和层析色谱的方法得到免疫学上和层析色谱的方法得到免疫学上 专一性的抗体。专一性的抗体。（一）（一）IgG的化学分离的化学分离1、冷酒精沉淀法、冷酒精沉淀法2、中性盐分段沉淀法、中性盐分段沉淀法 简便、常用简便、常用 利用硫酸铵或硫酸钠沉淀免疫球利用硫酸铵或硫酸钠沉淀免疫球 蛋白。蛋白。3、DEAE-纤维素柱层析法纤维素柱层析法 IgG不被柱子保留，被洗脱下来，不被柱子保留，被洗脱下来，其它血蛋白组分均被保留。其它血蛋白组分均被保留。（二）利用免疫吸附剂纯化特异性抗体（二）利用免疫吸附剂纯化特异性抗体 1、利用特异性抗原纯化特异性抗体、利用特异性抗原纯化特异性抗体 抗原与不溶性载体结合，制成特抗原与不溶性载体结合，制成特 异性的免疫吸附剂。异性的免疫吸附剂。2、利用特定的细菌蛋白纯化特异抗、利用特定的细菌蛋白纯化特异抗体体从葡萄球菌中分离出的从葡萄球菌中分离出的A蛋白和从链蛋白和从链球菌中分离出的球菌中分离出的G蛋白在一定条件下蛋白在一定条件下可与各种免疫球蛋白的可与各种免疫球蛋白的Fc端相结合。端相结合。A蛋白与不溶性载体结合后可以纯化蛋白与不溶性载体结合后可以纯化免疫球蛋白。免疫球蛋白。商品商品A蛋白载体：蛋白载体：Sepharose 4B 第四节第四节 免疫分析方法及应用免疫分析方法及应用一、一、RIA放射免疫分析法放射免疫分析法 最早建立最早建立 经典经典 有毒害有毒害二、荧光免疫分析二、荧光免疫分析FIA1、荧光淬灭、荧光淬灭 有荧光的抗体不发荧光的半抗有荧光的抗体不发荧光的半抗原，能量从抗体转移至半抗原，荧光原，能量从抗体转移至半抗原，荧光消失消失2、荧光增强、荧光增强 有荧光的抗原吸收抗体中蛋白质有荧光的抗原吸收抗体中蛋白质色氨酸转移过来的光能色氨酸转移过来的光能三、克隆酶给予体免疫分析法三、克隆酶给予体免疫分析法 CEDIA 利用利用DNA重组技术合成重组技术合成 galactosidase（半乳糖苷酶）的两（半乳糖苷酶）的两个独立存在时无酶活性的蛋白质片段个独立存在时无酶活性的蛋白质片段 小片段小片段 ED大片段大片段 EA当样品半抗原多，当样品半抗原多，ED标记半抗原标记半抗原与抗体结合少，与抗体结合少，ED与与EA结合，产结合，产生酶活性增强。生酶活性增强。优点：优点：反应灵敏反应灵敏精确度高精确度高四、酶联免疫分析法四、酶联免疫分析法ELISA抗体或抗原包被技术抗体或抗原包被技术微孔板：聚苯乙烯板微孔板：聚苯乙烯板和蛋白类抗体或抗原有较强的相和蛋白类抗体或抗原有较强的相互作用互作用ELISA的灵敏度的灵敏度1081012 g基本原理基本原理:使抗原或抗体结合到某种固相载体使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。保留其免疫活性，又保留酶的活性。ELISA可用于测定抗原，也可用于测定可用于测定抗原，也可用于测定抗体。抗体。在这种测定方法中有在这种测定方法中有3种必要的试剂：种必要的试剂：固相的抗原或抗体，固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。酶作用的底物。双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。及杂质。（2）加受检标本，使之与固相抗体接）加受检标本，使之与固相