专题基因工程优秀课件.ppt

专题基因工程第1页，本讲稿共37页（一）基因工程的概念（一）基因工程的概念基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程结果结果基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNADNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNADNADNA分子水平分子水平人类需要的基因产物人类需要的基因产物剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达表达表达原理原理基因重组基因重组第2页，本讲稿共37页限制性内切酶1.特点：特特异异性性，即即识识别别特特定定核核苷苷酸酸序序列，在特定的切点切割。列，在特定的切点切割。2.分布：主要在微生物中。主要在微生物中。3.结果：产产生生黏黏性性末末端端（碱碱基基互互补补配配对）或平末端对）或平末端 。4.举例：大大肠肠杆杆菌菌的的一一种种限限制制酶酶能能识识别别GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之间切开。之间切开。第3页，本讲稿共37页DNA连接酶的种类：连接酶的种类：根据酶的来源不同，可分为两类：（1 1）E.coliE.coliDNADNA连接酶：连接酶：只能将双链只能将双链DNADNA片段互补片段互补的黏性末端之间连接起来的黏性末端之间连接起来（2）T4DNA连接酶：既可以连接双链双链DNADNA片段片段互补的黏性末端，又可以互补的黏性末端，又可以双链双链DNADNA片段的平末端片段的平末端第4页，本讲稿共37页运载体运载体1.作用：2.条件：3.种类：质粒质粒、噬菌体和动植物病毒。、噬菌体和动植物病毒。4 4.质粒的特点质粒的特点要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是能将外源基因送入细胞的工具就是能将外源基因送入细胞的工具就是能将外源基因送入细胞的工具就是运载体运载体。将外源基因送入受体细胞。将外源基因送入受体细胞。第5页，本讲稿共37页作为运载体必须具备哪些条件？作为运载体必须具备哪些条件？作为运载体必须具备哪些条件？作为运载体必须具备哪些条件？（二）基因操作的工具（二）基因操作的工具1.能够在宿主细胞中能够在宿主细胞中复制并稳定地保存复制并稳定地保存。2.2.具具多个限制酶切点多个限制酶切点，以便与外源基因连接。，以便与外源基因连接。3.具有某些具有某些标记基因标记基因，便于进行，便于进行筛选筛选。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。基因等。第6页，本讲稿共37页大肠杆菌的质粒：大肠杆菌的质粒：（二）基因操作的工具（二）基因操作的工具 最常用的质粒是大肠杆最常用的质粒是大肠杆最常用的质粒是大肠杆最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗菌的质粒，其中常含有抗菌的质粒，其中常含有抗菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素的标记药基因，如四环素的标记药基因，如四环素的标记药基因，如四环素的标记基因。质粒的存在与否对基因。质粒的存在与否对基因。质粒的存在与否对基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性宿主细胞生存没有决定性宿主细胞生存没有决定性宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主作用，但复制只能在宿主作用，但复制只能在宿主作用，但复制只能在宿主细胞内成。细胞内成。细胞内成。细胞内成。第7页，本讲稿共37页质粒的特点质粒的特点1.细胞染色体（或拟核DNA分子）外能自主复制的小型环状DNA分子；2.质粒的存在对宿主细胞无影响；3.质粒的复制只能在宿主细胞内完成。第8页，本讲稿共37页非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子 RNARNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。与其结合。第9页，本讲稿共37页不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不，不能编码蛋白质。能编码蛋白质。：能转录相应的信使：能转录相应的信使RNARNA，能，能 编码蛋白质编码蛋白质 编码区编码区非编非编码区码区原核原核细胞细胞的的 基基因结因结构构有调控遗传信息表达的核有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中，最重苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的要的是位于编码区上游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。第10页，本讲稿共37页编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内不能够编码蛋白质的序列叫做内含子含子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子：外显子：外显子：第11页，本讲稿共37页真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA 聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非编码序列：非编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子第12页，本讲稿共37页原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码思考思考:第13页，本讲稿共37页1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指:编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因2 2、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些?（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）人工合成）人工合成（3 3）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增第14页，本讲稿共37页 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片段，导入到受体菌的群体中，各个受片段，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库为基因文库基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如:cDNAcDNA文库）文库）1.1.基因文库基因文库第15页，本讲稿共37页基因组基因组DNADNA文库文库限制性内切酶限制性内切酶基因组基因组DNADNA基因重组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装1)1)基因组文库基因组文库 (Genomic library)(Genomic library)是指将某种生物体的全部基因组是指将某种生物体的全部基因组DNADNA用限制性内切酶或机械力量切用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的割成一定长度范围的DNADNA片段，再与片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落，这个宿主细胞获得的所有阳性菌落，这个群体就称为该生物基因组文库。其目群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因的是分离有用的目的基因 和保存某种和保存某种生物的全部基因。生物的全部基因。第16页，本讲稿共37页2)cDNA2)cDNA文库文库 (cDNA library)(cDNA library)：是指将某种生物体基因组转录的全部是指将某种生物体基因组转录的全部mRNAmRNA经经反转录产生的反转录产生的cDNAcDNA片段分别与克隆载体重组，片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的组的cDNAcDNA文库。文库。cDNA(complementary DNAcDNA(complementary DNA，互补，互补DNA)DNA)：是由：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNAmRNA经体外反转录后形成的互补经体外反转录后形成的互补DNADNA。第17页，本讲稿共37页cDNAcDNA文库的构建：文库的构建：基因重组基因重组反转录酶反转录酶mRNAmRNAcDNAcDNA第18页，本讲稿共37页 根据已知蛋白质的根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相氨基酸序列，推测出相应的信使应的信使RNARNA序列，然序列，然后按照碱基互补配对原后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成第19页，本讲稿共37页优点优点缺点缺点鸟枪法鸟枪法反转录法反转录法根据已知氨基根据已知氨基酸合成酸合成DNADNA法法操作简便操作简便广泛使用广泛使用工作量大，盲目，分工作量大，盲目，分离出来的有时并非一离出来的有时并非一个基因个基因专一性强专一性强操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很不稳定，要求的技很不稳定，要求的技术条件较高术条件较高专一性最强专一性最强仅限于合成核苷酸对仅限于合成核苷酸对较少的简单基因较少的简单基因思考思考:为什么要构建基因文库为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗生物体内提取不行吗?上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？第20页，本讲稿共37页 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果结果：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增条件：条件：_、_、_ _、_._.前提条件：前提条件：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n有一段以知目的基因的核苷酸序列有一段以知目的基因的核苷酸序列特定特定DNADNA片段片段第21页，本讲稿共37页过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性（复性55-6555-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_ _。c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端端延伸，合成与模板互补延伸，合成与模板互补 的的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链第22页，本讲稿共37页第23页，本讲稿共37页质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种第24页，本讲稿共37页基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：复制原点复制原点+目的基因目的基因+启动子启动子+终止子终止子+标记基因标记基因第25页，本讲稿共37页转化转化 方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受受体细胞内维持体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达第26页，本讲稿共37页三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞第27页，本讲稿共37页检查是否成功检查是否成功检测检测个体生物学水平鉴定：个体生物学水平鉴定：检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）（注意与上不同之处）抗原抗原-抗体杂交抗体杂交第28页，本讲稿共37页DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分子分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。仍然是两条游离的单链。P P1515思考与探究思考与探究第29页，本讲稿共37页四、基因工程的成果及发展四、基因工程的成果及发展2、医药卫生：、医药卫生：a、药品生产、药品生产b、基因诊断与治疗、基因诊断与治疗我国生产的部分基因我国生产的部分基因工程疫苗和药物工程疫苗和药物诊断原理：诊断原理：DNADNA分子杂交原理分子杂交原理生生产产胰胰岛岛素素第30页，本讲稿共37页1、农牧业与食品工业、农牧业与食品工业生长快、肉质好的转基因生长快、肉质好的转基因鱼鱼(中国中国)转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转鱼抗寒基因转鱼抗寒基因的番茄的番茄第31页，本讲稿共37页3 3、环境保护、环境保护基因工程做成的基因工程做成的“超级细菌超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。能吞食和分解多种污染环境的物质。通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的功的“超级细菌超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解食转化汞、镉等重金属，分解DDTDDT等毒害物质。等毒害物质。第32页，本讲稿共37页例如：例如：改造改造干扰素（半胱氨酸）干扰素（半胱氨酸）体外很难保存体外很难保存干扰素（丝氨酸）干扰素（丝氨酸）体外可以保存半年体外可以保存半年玉米中赖氨酸含量比较低玉米中赖氨酸含量比较低天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶（352位的苏氨酸）位的苏氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶二氢吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）位的天冬酰胺）改造改造改造改造天冬氨酸激酶（异亮氨酸）天冬氨酸激酶（异亮氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶（异二氢吡啶二羧酸合成酶（异亮氨酸）亮氨酸）玉米中赖氨酸含量可提高数倍玉米中赖氨酸含量可提高数倍第33页，本讲稿共37页蛋白质工程的概念蛋白质工程的概念蛋白质工程：是指以蛋白质分子的结构规蛋白质工程：是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质改造或制造一种新的蛋白质，以满足人类，以满足人类对生产和生活的需求。对生产和生活的需求。前提前提：了解蛋白质的结构和功能了解蛋白质的结构和功能原理原理：改造基因（基因修饰或基因合成）改造基因（基因修饰或基因合成）目的：目的：定向改造或制造蛋白质定向改造或制造蛋白质第34页，本讲稿共37页基因表达流程图第35页，本讲稿共37页蛋白质工程流程图1.从预期的蛋白质功能出发从预期的蛋白质功能出发2.设计预期的蛋白质结构设计预期的蛋白质结构3.推测应有的氨基酸序列推测应有的氨基酸序列4.找到相应的脱氧核苷酸序列找到相应的脱氧核苷酸序列第36页，本讲稿共37页讨论：讨论：1、怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？、怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？请把相应的碱基序列写出来。请把相应的碱基序列写出来。活动活动2 某多肽链的一段氨基酸序列是：某多肽链的一段氨基酸序列是：-丙氨酸丙氨酸-色氨酸色氨酸-赖氨酸赖氨酸-甲硫氨酸甲硫氨酸-苯丙氨酸苯丙氨酸-丙氨酸：丙氨酸：GCU、GCC、GCA、GCG 色氨酸：色氨酸：UGG 赖氨酸：赖氨酸：AAA、AAG 甲硫氨酸：甲硫氨酸：AUG 苯丙氨酸：苯丙氨酸：UUU、UUC 第37页，本讲稿共37页