1.2基因工程的基本操作程序.pptx
第1页/共44页（一）目的基因的提取（一）目的基因的提取目的基因：主要是指目的基因：主要是指_。获取方法：获取方法：1、_中获取目的基因中获取目的基因2、PCR反应扩增反应扩增DNA2、人工合成法人工合成法：如果基因比较小，核苷酸序列又已知，：如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过也可以通过DNA合成仪合成仪用化学方法直接人工合成。用化学方法直接人工合成。基本操作步骤基本操作步骤从从基因文库基因文库编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因 第2页/共44页从基因文库中获取目的基因什么是基因文库？什么是基因组文库？什么是部分基因文库？怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？目的基因的有关信息与什么相联系？第3页/共44页1.从从基因文库基因文库中获取目的基因中获取目的基因基因文库：基因文库：将含有将含有某种生物生物不同基因不同基因的许多的许多DNADNA片断，导入到片断，导入到受体菌的群体受体菌的群体中，中，各个受体菌分别含有这种生物的不各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。同基因，称为基因文库。基因文库基因文库 基因组文库部分基因文库（如cDNAcDNA文库）一种生物所有的基因一种生物的一部分基因第4页/共44页基因文库的构建过程基因文库的构建过程基因组文库限制酶供体细胞的全部DNA大量DNA片段拼接到载体上导入受体细胞扩增第5页/共44页目的基因的目的基因的目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链单链单链DNA(cDNADNA(cDNA）双链双链双链双链DNADNA(即目的基因即目的基因即目的基因即目的基因)反转录反转录反转录反转录合成合成合成合成1）反转录法：）反转录法：以目的基因转录成的以目的基因转录成的以目的基因转录成的以目的基因转录成的mRNAmRNAmRNAmRNA为为为为模板，反转录成互补的单链模板，反转录成互补的单链模板，反转录成互补的单链模板，反转录成互补的单链DNADNADNADNA，然后在酶的作用下合成双链，然后在酶的作用下合成双链，然后在酶的作用下合成双链，然后在酶的作用下合成双链DNADNADNADNA，从而获得所需的基因。，从而获得所需的基因。，从而获得所需的基因。，从而获得所需的基因。蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质的氨基的氨基的氨基的氨基酸序列酸序列酸序列酸序列mRNAmRNA的核苷的核苷的核苷的核苷酸序列酸序列酸序列酸序列结构基因结构基因结构基因结构基因的核苷酸的核苷酸的核苷酸的核苷酸序列序列序列序列目的目的目的目的基因基因基因基因推测推测推测推测推测推测推测推测化学化学化学化学合成合成合成合成2）根据已知的氨基酸序列合成）根据已知的氨基酸序列合成DNA法法：cDNAcDNA：第6页/共44页非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子终止子终止子基因的结构基因的结构启动子启动子原核原核真核真核第7页/共44页一个典型的原核细胞原核细胞基因结构示意图 编码区编码区:组成基因的组成基因的核苷酸序列可以分为不同的区段核苷酸序列可以分为不同的区段,有的区段能够转录为相应的信使有的区段能够转录为相应的信使RNARNA，进而指导蛋白质，进而指导蛋白质的合成，这样的区段叫做编码区。的合成，这样的区段叫做编码区。非编码区：非编码区：有的区段不能转录为信使有的区段不能转录为信使RNARNA，也就是说，也就是说不能编码蛋白质不能编码蛋白质，这样的区段叫做非编码区。，这样的区段叫做非编码区。第8页/共44页一个典型的真核细胞基因结构示意图 真核细胞基因结构的主要特点是：编码区是间隔的、不连续的。能够编码蛋白质的序列叫做外显子，一般不能够编码蛋白质的序列叫做内含子。第9页/共44页第10页/共44页2.PCR技术多聚酶链式反应（体外）原理：原理：前提：前提：条件：条件：PCR扩增仪扩增仪DNA双链复制的基本原理双链复制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸（四种脱氧核苷酸（dNTPdNTP）一对引物一对引物热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(TaqTaq酶酶）DNADNA的两条链为模板的两条链为模板温度控制温度控制方式：以以_形式扩增，即形式扩增，即_（n n为扩增循环的为扩增循环的次数）次数）指数指数2 2n n第11页/共44页n 过程过程变性、退火、延伸三步曲变性、退火、延伸三步曲变性：变性：加热至9095双链双链DNADNA解链成为单链解链成为单链DNADNA退火：退火：冷却至5560部分引物与模板的单链部分引物与模板的单链DNADNA的特定互补部位相配的特定互补部位相配对和结合对和结合延伸：延伸：加热至7075以目的基因为模板，合以目的基因为模板，合成互补的新成互补的新DNADNA链链变性变性退火退火延伸延伸第12页/共44页v需要提供合成模板；v合成的方向都是5 533。vDNADNA聚合酶不能起始新的DNADNA链，必须要有引物提供3 3-OH-OH；核糖脱氧核糖第13页/共44页5 5/3 3/G GG GT TC C3 3/5 5/G GA AC CC C5 5/3 3/引物引物G GG G1.目的基因目的基因DNA受热变性，解链；受热变性，解链；2.引物与单链互补结合；引物与单链互补结合；3.合成链在合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。聚合酶作用下进行延伸。5 5/3 3/A AG G引物引物第14页/共44页利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因第15页/共44页胞内DNADNA复制与PCRPCR技术的比较：胞内胞内DNADNA复制复制PCRPCR解旋解旋解旋酶，边解旋边复制解旋酶，边解旋边复制酶酶解旋酶解旋酶/DNA/DNA聚合酶聚合酶模板模板DNADNA母链母链引物引物RNARNA能量能量+原原料料dNTPdNTP温度温度最适温度最适温度高温变性Taq Taq DNADNA聚合酶DNADNA母链dNTPdNTP3 3个温度DNADNA或RNARNA第16页/共44页1.1.下表关于基因工程中有关基因操作下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是的名词及对应的内容，正确的组合是2 2、下列属于获取目的基因的方法的是、下列属于获取目的基因的方法的是()()利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成 从基因组文库中提取从基因组文库中提取从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成A.B.C.D.A.B.C.D.第17页/共44页3、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNADNA分分子片段为子片段为ATGTGATGTGTACACTACAC，要使其数量增多，可用，要使其数量增多，可用PCRPCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是技术进行人工复制，复制时应给予的条件是 双链双链DNADNA分子为模板分子为模板 ATGTGATGTG或或TACACTACAC模板链模板链 四四种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸 四种核苷酸四种核苷酸 DNADNA聚合酶聚合酶 热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶引物引物 温度变化温度变化 恒温恒温A BC D4、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是A.540个 B.8100个 C.17280个D.7560个第18页/共44页消耗的脱氧核苷酸数设亲代DNA分子中含有某种脱氧核苷酸数m个，则：(1)经过n次复制，共需要消耗游离的该脱氧核苷酸数：(2)在第n次复制时，共需要消耗游离的该脱氧核苷酸数：m(2n-1)m 2n-1第19页/共44页（1 1）用一定的）用一定的_切割质粒，使其出现一个切割质粒，使其出现一个切口，露出切口，露出_。（2 2）用）用_切断目的基因，使其产生切断目的基因，使其产生 _。（3 3）将切下的目的基因片段插入质粒的）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处，再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组DNADNA分子分子（重组质粒）（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶相同相同的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶重组质粒形成过程重组质粒形成过程:第21页/共44页 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。过程和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗抗虫基因首端虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子启动子、抗虫抗虫基因的质粒中插入终止子基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端抗虫基因末端)，导入，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。资资 料料:基因表达载体构建基因表达载体构建第22页/共44页基因表达载体的组成：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。的基因能够表达和发挥作用。a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因启动转录启动转录,是是RNARNA聚合酶的聚合酶的识别识别和和结合结合部位部位位于基因的末端位于基因的末端,终止转录终止转录检测检测目的基因是否导入受体细胞，目的基因是否导入受体细胞，筛选筛选出含目的基因的受体细胞出含目的基因的受体细胞第23页/共44页1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括A目的基因 B启动子 C终止子 D标记基因ABCD2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是A启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别A3、目前转基因工程可以A.打破地理隔离但不能突破生殖隔离B.打破生殖隔离但不能突破地理隔离C.完全突破地理隔离和生殖隔离D.部分突破地理隔离和生殖隔离 C第24页/共44页(三三)将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：常用的受体细胞：动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。将目的基因导入受体细胞的原理：将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。转化转化目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达第25页/共44页导入植物导入植物 细胞：细胞：（三）将目的基因导入受体细胞（三）将目的基因导入受体细胞导入动物导入动物 细胞：细胞：导入微生物细胞：导入微生物细胞：受体细胞受体细胞 导入方法导入方法体细胞体细胞 受精卵受精卵受精卵受精卵 显微注射法显微注射法Ca2处理法处理法农杆菌转化法农杆菌转化法 基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法第26页/共44页1、将目的基因导入植物细胞、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌）农杆菌转化法转化法特点特点:能感染能感染双子叶植物双子叶植物和和祼子植物祼子植物,对对单子叶植物无感染能力单子叶植物无感染能力Ti质粒质粒的的TDNA可转移至受体细可转移至受体细胞并胞并整合整合到其染色体上到其染色体上转化过程转化过程:Ti质粒质粒目的基因目的基因构建构建表达表达载体载体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色染色DNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌第27页/共44页（2）基因枪法）基因枪法 基因枪法又称基因枪法又称微弹轰击法微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。的基因与其整合并表达的方法。第28页/共44页（3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。因借助花粉管通道进入受体细胞。第29页/共44页2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法方法:显微注射技术显微注射技术操作程序操作程序:提纯含目的基提纯含目的基因表达载体因表达载体取受精卵取受精卵显微注射显微注射移植到子宫移植到子宫受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物第30页/共44页3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞常用法常用法：Ca2+处理处理常用菌常用菌：大肠杆菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少、多为单细胞、遗传物质相对少过程：过程：Ca2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态细感受态细胞吸收胞吸收DNA增大细胞壁的通透性增大细胞壁的通透性第31页/共44页1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是 A结构简单、操作方便 B繁殖速度快 C遗传物质含量少、简单 D性状稳定、变异少2、基因工程常用的受体细胞有 大肠杆菌 枯草杆菌 支原体 动植物细胞A B C DBD3、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A.人工合成基因 B.目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达C第32页/共44页4.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养A B C DC5.下列属于基因工程中导入目的基因方法的是农杆菌转化法 基因枪法 花粉管道法 显微注射法 胚胎移植 DNA分子杂交法A BC DC第33页/共44页目的基因是否插入转基目的基因是否插入转基因生物染色体的因生物染色体的DNA上上（四）目的基因的检测与鉴定（四）目的基因的检测与鉴定目的基因是否表达：目的基因是否表达：目的基因是否转录目的基因是否转录：方法方法:DNADNA分子杂交分子杂交方法方法:分分 子子 杂杂 交交方法方法:抗原抗体杂交抗原抗体杂交鉴定鉴定抗虫性鉴定、抗病性鉴定、生物抗虫性鉴定、抗病性鉴定、生物活性鉴定等（活性鉴定等（生理、性状水平的生理、性状水平的检测检测）检测检测第34页/共44页知识延伸知识延伸DNADNA分子杂交技术分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。或基因。第35页/共44页第36页/共44页 基因工程概念解读：基本原理基本原理操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程结果结果优点优点不足不足实例实例基因拼接成功基因拼接成功的原因的原因成功表达原因成功表达原因基因重组基因重组体外体外基因基因DNA分子水平分子水平剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达新的生物类型和生物产品新的生物类型和生物产品密码子的通用性：密码子的通用性：生物界共用一套相同的密生物界共用一套相同的密码子码子基本单位相同基本单位相同 结构相结构相同同碱基配对方式相同碱基配对方式相同安全性问题：生物安全、食品安全、环境安全安全性问题：生物安全、食品安全、环境安全转基因抗虫棉转基因抗虫棉打破生殖隔离打破生殖隔离定向改造生物定向改造生物时间短时间短第37页/共44页1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是 A结构简单、操作方便 B繁殖速度快 C遗传物质含量少、简单 D性状稳定、变异少2、基因工程常用的受体细胞有 大肠杆菌 枯草杆菌 支原体 动植物细胞A B C DBD2、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A.人工合成基因 B.目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达C第38页/共44页3.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养A B C DC4.下列属于基因工程中导入目的基因方法的是农杆菌转化法 基因枪法 花粉管道法 显微注射法 胚胎移植 DNA分子杂交法A BC DC第39页/共44页5、应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是 A用于检测疾病的医疗器械B用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子C合成-珠蛋白的DNAD合成苯丙羟化酶的DNA片段第40页/共44页6.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B B有利于对目的基因是否导入进行检测有利于对目的基因是否导入进行检测C C增加质粒分子的分子量增加质粒分子的分子量D D便于与外源基因连接便于与外源基因连接7.7.有关基因工程的叙述正确的是A A限制酶只在获得目的基因时才用限制酶只在获得目的基因时才用B B重组质粒的形成是在细胞内完成的重组质粒的形成是在细胞内完成的C C质粒都可作为运载体质粒都可作为运载体 D D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料第41页/共44页8.哪项不是基因表达载体的组成部分()A.启动子 B.终止密码 C.标记基因 D.目的基因9.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法()A基因枪法 B显微注射法 C.农杆菌转化法 D花粉管通道法第42页/共44页1010）（多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产人类胰岛素，这一过程涉及到（）A.用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接B.把重组后的DNA分子导入受体细菌内进行扩增C.检测重组DNA分子是否导入受体细菌内并表达出性状D.筛选出能产生胰岛素的“工程菌”ABCD第43页/共44页感谢您的观看。第44页/共44页
