实验四 小鼠精子畸形试验课件.pptx

精子畸形试验是检测受试化学毒物能精子畸形试验是检测受试化学毒物能否破坏哺乳动物精子正常形态的实验方法。否破坏哺乳动物精子正常形态的实验方法。通过实验，学习和掌握小鼠精子畸形试验通过实验，学习和掌握小鼠精子畸形试验的原理和步骤。的原理和步骤。实验目的实验目的1.1 1.第1页/共16页实验原理实验原理2 2.精子畸形精子畸形是指精子的形状异常和异常是指精子的形状异常和异常精子数量的增多。精子数量的增多。生殖系统生殖系统对化学毒物的对化学毒物的作用作用十分敏感十分敏感，在其他系统还未出现毒性，在其他系统还未出现毒性反应前，生殖系统可能已出现了损害作用。反应前，生殖系统可能已出现了损害作用。正常情况下正常情况下，哺乳动物的精液中也存在少，哺乳动物的精液中也存在少量的畸形精子，但在某些化学毒物的作用量的畸形精子，但在某些化学毒物的作用下，特别是在可引起生殖细胞遗传性损伤下，特别是在可引起生殖细胞遗传性损伤的化学毒物作用下，哺乳动物睾丸产生的的化学毒物作用下，哺乳动物睾丸产生的畸形精子数量可大量增加。因此，可以用畸形精子数量可大量增加。因此，可以用 第2页/共16页实验原理实验原理2 2.检查雄性动物接触化学毒物后检查雄性动物接触化学毒物后精子畸形率精子畸形率的高低，来反映该化学毒物的的高低，来反映该化学毒物的生殖毒性生殖毒性和和对生殖细胞潜在的对生殖细胞潜在的致突变性致突变性。化学毒物引起精子畸形的机制尚未完化学毒物引起精子畸形的机制尚未完全清楚。正常情况下，精子的成熟和正常全清楚。正常情况下，精子的成熟和正常形态发生过程受多种基因调控，一旦这些形态发生过程受多种基因调控，一旦这些基因中的一个或多个在化学毒物的作用下基因中的一个或多个在化学毒物的作用下发生突变，就会导致发生突变，就会导致畸形精子数量畸形精子数量的大量的大量增加。一般认为，常染色体上的基因控制增加。一般认为，常染色体上的基因控制 第3页/共16页实验原理实验原理2 2.精子畸形，精子畸形，Y-Y-性连锁基因控制畸形精子的性连锁基因控制畸形精子的表现。某些特异的染色体表现。某些特异的染色体重排重排，如，如性、常性、常染色体易位染色体易位，是化学毒物诱发哺乳动物畸，是化学毒物诱发哺乳动物畸形率增高的主要机制。形率增高的主要机制。由于精子畸形有可能影响生殖。因此，由于精子畸形有可能影响生殖。因此，当受检物引起当受检物引起精子畸形率增高精子畸形率增高，即使不一，即使不一定是化合物诱发生殖细胞突变的结果，但定是化合物诱发生殖细胞突变的结果，但也表明受试物也表明受试物直接或间接损害精子直接或间接损害精子，从而，从而可能影响生殖。可能影响生殖。第4页/共16页实验动物：实验动物：实验材料实验材料3 3.体重体重18-22g18-22g小鼠。小鼠。实验器材：实验器材：灌胃针、注射器灌胃针、注射器5 5套、眼科剪、眼套、眼科剪、眼科镊、显微镜、饲养笼等。科镊、显微镜、饲养笼等。实验试剂：实验试剂：磷酸盐缓冲液、生理盐水、无水乙磷酸盐缓冲液、生理盐水、无水乙醇、醇、2%2%伊红水溶液、甲基磺酸甲酯伊红水溶液、甲基磺酸甲酯或甲基磺酸乙酸或环磷酰胺。或甲基磺酸乙酸或环磷酰胺。第5页/共16页4 4.实验步骤实验步骤1.1.动物选择成熟的大鼠、小鼠均可使用。由于动物选择成熟的大鼠、小鼠均可使用。由于小鼠较为经济，且有大量实验证实小鼠在该试小鼠较为经济，且有大量实验证实小鼠在该试验系统中对化学毒物最为敏感，故一般采用验系统中对化学毒物最为敏感，故一般采用雄雄性小鼠性小鼠，年龄宜在，年龄宜在6 68 8周周。2.2.剂量与分组试验至少应设剂量与分组试验至少应设3 3个以上剂量组个以上剂量组，并，并同时设立同时设立阳性对照组阳性对照组和和阴性对照组阴性对照组。接触化学。接触化学毒物后每组至少应存活毒物后每组至少应存活5 5只动物。最高剂量组只动物。最高剂量组5d5d总剂量应能使部分动物死亡。总剂量应能使部分动物死亡。一般可采用一般可采用LDLD5050的的2 24 4倍剂量倍剂量，或预先给予化，或预先给予化学毒物的学毒物的LDLD5050，以求得最高总剂量，然后以它的，以求得最高总剂量，然后以它的1/21/2（或（或1/51/5、1/101/10）作为下一剂量组的接触剂作为下一剂量组的接触剂量，依此类推。量，依此类推。第6页/共16页4 4.实验步骤实验步骤阳性对照可用阳性对照可用环磷酰胺环磷酰胺20mg/kg20mg/kg或甲基磺酸甲酯或甲基磺酸甲酯75mg/kg75mg/kg或或甲基磺酸乙酯甲基磺酸乙酯60mg/kg60mg/kg，进行腹腔注，进行腹腔注射，每天一次，射，每天一次，连续连续5d5d。阴性对照选用给予相。阴性对照选用给予相同体积的溶剂。同体积的溶剂。3.3.染毒与采样可采用一次或每天一次连续染毒与采样可采用一次或每天一次连续5d5d的的方法进行染毒。染毒途径多用方法进行染毒。染毒途径多用腹腔注射腹腔注射，也可，也可采用与人体实际接触化学毒物相同的途径，采用与人体实际接触化学毒物相同的途径，如如经口、吸入和皮肤接触等经口、吸入和皮肤接触等。一般认为精原细胞后期或初级精母细胞早期一般认为精原细胞后期或初级精母细胞早期对化学诱变剂较为敏感，在接触化学毒物后对化学诱变剂较为敏感，在接触化学毒物后4 45 5周周精子畸形率最高，故选择在第一次染毒后第精子畸形率最高，故选择在第一次染毒后第35d35d进行采样。也可在染毒后进行采样。也可在染毒后第第1 1、第、第4 4和第和第1010周周第7页/共16页4 4.实验步骤实验步骤分三次采样，或者在染毒后每周采样一次，连续分三次采样，或者在染毒后每周采样一次，连续进行动态观察，直至精子形态恢复正常。进行动态观察，直至精子形态恢复正常。4.4.制片用制片用颈椎脱臼法颈椎脱臼法处死小鼠，剪开腹腔，分处死小鼠，剪开腹腔，分离并摘取离并摘取双侧附睾双侧附睾，将附睾放入盛有约，将附睾放入盛有约3ml3ml磷酸磷酸盐缓冲液或盐缓冲液或生理盐水生理盐水的小平皿中，以眼科剪将的小平皿中，以眼科剪将附睾尾剪成小块，用吸管将悬浮液轻轻吹打附睾尾剪成小块，用吸管将悬浮液轻轻吹打5 56 6次次，静置，静置3 35min5min，用四层擦镜纸滤除组织碎，用四层擦镜纸滤除组织碎片，吸取此精子悬液滴于清洁载玻片上，均匀片，吸取此精子悬液滴于清洁载玻片上，均匀推片，待玻片晾干后用甲醇固定推片，待玻片晾干后用甲醇固定5min5min，干燥后，干燥后即可镜检观察精子形态。也可用即可镜检观察精子形态。也可用2%2%的伊红水溶的伊红水溶液染色液染色1 12h2h后再作镜检。后再作镜检。第8页/共16页4 4.实验步骤实验步骤5.5.阅片在高倍镜下检查精子形态，可加上阅片在高倍镜下检查精子形态，可加上蓝色或蓝色或绿色绿色滤光片。每只小鼠检查完整的精子滤光片。每只小鼠检查完整的精子200200500500个个，每个剂量组至少检查，每个剂量组至少检查10001000个精子个精子。精子畸形。精子畸形主要表现在精子的头部，可分为：主要表现在精子的头部，可分为：无钩无钩、香蕉形香蕉形、无定形无定形、双头双头、双尾双尾、尾折叠尾折叠及及胖头胖头等等形态。形态。头部重叠或全部重叠的精子、无尾精子不进行头部重叠或全部重叠的精子、无尾精子不进行计数。计数。第9页/共16页5 5.结果分析结果分析分别计算各剂量组的分别计算各剂量组的精子畸形发生率精子畸形发生率。各剂量。各剂量组的组的精子畸形率精子畸形率与与阴性对照组阴性对照组之间的差异分析采之间的差异分析采用秩和检验。用秩和检验。由于不同品系小鼠的精子畸形率本底值差异较由于不同品系小鼠的精子畸形率本底值差异较大，且影响的因素也较多，故在结果分析时，应大，且影响的因素也较多，故在结果分析时，应首先观察首先观察阳性阳性和和阴性阴性对照组的试验结果。阳性对对照组的试验结果。阳性对照组精子畸形率的增高应在本实验室的历史记录照组精子畸形率的增高应在本实验室的历史记录范围之内，并与阴性对照组有范围之内，并与阴性对照组有显著性差异显著性差异（P0.01P0.01），阴性对照组的畸形精子率也应与自），阴性对照组的畸形精子率也应与自己实验室的历史记录接近，否则所得结果不可靠，己实验室的历史记录接近，否则所得结果不可靠，试验应重做。试验应重做。第10页/共16页5 5.结果分析结果分析出现可重复的剂量反应关系时，可判断出现可重复的剂量反应关系时，可判断试验结试验结果为阳性果为阳性。但要判定某一化学毒物为精子畸形诱。但要判定某一化学毒物为精子畸形诱变剂，至少应该有两个相邻剂量组的精子畸形率变剂，至少应该有两个相邻剂量组的精子畸形率比阴性对照组比阴性对照组显著增高（显著增高（P0.01P0.01）；或达到阴性；或达到阴性对照组的对照组的2 2倍或倍或2 2倍以上，并且试验结果能够重复。倍以上，并且试验结果能够重复。如果试验组的染毒剂量已使动物发生死亡，而精如果试验组的染毒剂量已使动物发生死亡，而精子畸形仍未见增加，则可判定试验结果为子畸形仍未见增加，则可判定试验结果为阴性阴性。在受试化学毒物的毒性作用较低而不至于引起动在受试化学毒物的毒性作用较低而不至于引起动物死亡时，应当记录最大的染毒剂量。物死亡时，应当记录最大的染毒剂量。第11页/共16页5 5.结果分析结果分析精子畸形试验还可进行畸变类型分析，不同部精子畸形试验还可进行畸变类型分析，不同部位的畸形对精子的活动能力和使卵子受孕的能力位的畸形对精子的活动能力和使卵子受孕的能力有不同的影响。可以结合有不同的影响。可以结合精子计数精子计数、精子运动能精子运动能力试验力试验等对化学毒物对雄性生殖系统的毒性作用等对化学毒物对雄性生殖系统的毒性作用做进一步的检测。做进一步的检测。第12页/共16页6 6.注意事项注意事项1 1在该试验过程中，虽然将精子悬液采用离心在该试验过程中，虽然将精子悬液采用离心等方法除去组织残渣后再制片效果会更佳，但这等方法除去组织残渣后再制片效果会更佳，但这使制片过程变得复杂化且更易造成人为误差。使制片过程变得复杂化且更易造成人为误差。2 2在镜检时要注意鉴别制片过程中人为造成的在镜检时要注意鉴别制片过程中人为造成的精子损伤。特别要注意由于精子重叠和交叉所造精子损伤。特别要注意由于精子重叠和交叉所造成的如多头、双头、双尾及多尾畸形等假象。成的如多头、双头、双尾及多尾畸形等假象。3 3在结果判定时，要注意排除机体某些如缺血、在结果判定时，要注意排除机体某些如缺血、变态反应、感染和体温增高等可能导致精子畸形变态反应、感染和体温增高等可能导致精子畸形率增高的因素，以免造成假阳性结果。率增高的因素，以免造成假阳性结果。第13页/共16页双尾精子双尾精子第14页/共16页胖头精子胖头精子第15页/共16页感谢您的观看。第16页/共16页