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一、概念经典的基因治疗经典的基因治疗：指正常的基因整合入细胞基因组以校正或置换致病基因的指正常的基因整合入细胞基因组以校正或置换致病基因的一种治疗方法。一种治疗方法。广义的基因治疗广义的基因治疗：将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。以达到治疗疾病目的的方法。第1页/共117页1.基因治疗分类体细胞(somatic(somatic cell)cell)基因治疗生殖细胞(germline)(germline)基因治疗v只限于某一体细胞的基因的改变v只限于某个体的当代v对缺陷的生殖细胞进行矫正v当代及子代第2页/共117页1990年年9月月14日：第一例正式批准的基因治日：第一例正式批准的基因治疗实验开始进行疗实验开始进行（美国美国，世界上开展基因治疗最早的国家），世界上开展基因治疗最早的国家）大规模进行基因治疗临床实验必须经历以下大规模进行基因治疗临床实验必须经历以下阶段：阶段：体外试验和动物试验体外试验和动物试验 I期临床试验期临床试验6-10名志愿者名志愿者 II期临床试验期临床试验20-30名志愿者名志愿者 III期期临临床床试试验验充充分分分分析析疗疗效效、安安全全性性中国：中国：1991年年7月开始进行基因治疗试验月开始进行基因治疗试验2.基因治疗发展简史第3页/共117页 世世界界上上第第一一个个正正式式被被批批准准用用于于基基因因治治疗疗的的病病例例是是先先天天性性腺腺苷苷脱脱氨氨酶酶（ADAADA）缺乏症缺乏症。19901990年年9 9月月美美国国BlaeseBlaese博博士士成成功功地地将将正正常常的的人人的的ADAADA基基因因植植入入ADAADA缺缺乏乏症症病病人人的的淋淋巴巴结结内内，完完成成世世界界上上首首例例基基因因治治疗疗试验。试验。第4页/共117页腺苷脱氨酶(ADA)(ADA)缺乏的严重联合免疫缺陷(SCID)(SCID)病因:淋巴细胞缺乏ADA酶腺苷、dATP堆积破坏免疫功能患儿很少活到成年n第一个基因临床治疗的方案n治疗策略：n淋巴细胞ADA酶 恢复至正常水平的 5%-10%维持免疫系统功能 改善病人症状第5页/共117页治疗基本步骤:ADA基因+逆转录病毒载体导入患者淋巴细胞体外扩增回输病人体内淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10%维持免疫系统功能,改善病人症状第6页/共117页 一、基因治疗的策略一、基因治疗的策略TheStrategyofGeneTherapy第7页/共117页 （一）基因置换（一）基因置换（gene gene replacementreplacement）定义：定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有置换基因组内原有的缺陷基因的缺陷基因。目的目的：将缺陷基因的异常序列进行矫正将缺陷基因的异常序列进行矫正。对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。不涉及基因组的任何改变。第8页/共117页又称为又称为基因打靶基因打靶(gene targeting）定定点点整整合合的的条条件件:转转导导基基因因的的载载体体与与染染色色体体上上的的DNA具具有有相相同同的的序序列列。带带有有目目的的基基因因的的载载体体就就能能找找到到同同源源重重组组的的位位点点，进进行行部部分分基基因因序序列列的的交交换换，使使基基因置换这一治疗策略得以实现。因置换这一治疗策略得以实现。基因同源重组技术基因同源重组技术第9页/共117页要要实实现现基基因因置置换换，需需要要采采用用同同源源重重组组技技术术使使相相应应的的正正常常基基因因定定向向导导入入受受体细胞的基因缺陷部位。体细胞的基因缺陷部位。n定定向向导导入入的的发发生生率率约约1/1001/100万万，采采用用胚胚胎胎干干细细胞胞培培养养的的方方法法，这这种种同同源源重重组组的的检出率最高可达检出率最高可达1/101/10。第10页/共117页基因置换必要条件：基因置换必要条件：1、对导入的基因及其产物有详尽的了解2、外来基因能有效地导入靶细胞3、导入基因能在靶细胞中长期稳定存在4、导入基因能有适度水平的表达5、基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害第11页/共117页（二）（二）基因添加基因添加 基因添加基因添加或称或称基因增补基因增补（gene augmentationgene augmentation）:通过导入外源基因通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的使靶细胞表达其本身不表达的基因。基因。类型类型:n在在有有缺缺陷陷基基因因的的细细胞胞中中导导入入相相应应的的正正常常基基因因，而而细细胞胞内内的的缺缺陷陷基基因因并并未未除除去去，通通过过导导入入正正常常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；n向向靶靶细细胞胞中中导导入入靶靶细细胞胞本本来来不不表表达达的的基基因因，利利用其表达产物达到治疗疾病的目的。用其表达产物达到治疗疾病的目的。第12页/共117页基因干预(gene interferencegene interference)指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不表达，以达到治疗疾病的目的。1.反义核酸：封闭基因表达2.核酶：裂解特异的靶mRNA3.RNA干涉技术：（三）基因干预（三）基因干预第13页/共117页（四）自杀基因治疗（四）自杀基因治疗自杀基因治疗自杀基因治疗:恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。原原理理:将将“自自杀杀”基基因因导导入入宿宿主主细细胞胞中中，这这种种基基因因编编码码的的酶酶能能使使无无毒毒性性的的药药物物前前体体转转化化为为细细胞胞毒毒性性代代谢谢物物，诱诱导导靶靶细细胞胞产产生生“自自杀杀”效效应应，从从而而达到清除肿瘤细胞的目的。达到清除肿瘤细胞的目的。第14页/共117页自杀基因的作用机制第15页/共117页1.1.自杀基因系统自杀基因系统TK/GCVTK/GCV 单纯疱疹病毒（单纯疱疹病毒（herps simplex herps simplex virus,virus,HSVHSV）型胸苷激酶型胸苷激酶（thymidine thymidine kinase,kinase,tktk）基因编码胸苷激酶，）基因编码胸苷激酶，胸苷激酶胸苷激酶特异性地将无毒的核苷类似物特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟丙氧鸟苷苷（ganciclovir,ganciclovir,GCVGCV）转变成）转变成毒性毒性GCVGCV三磷三磷酸核苷酸核苷，后者能抑制后者能抑制DNADNA聚合酶活性，导致细胞死亡。聚合酶活性，导致细胞死亡。第16页/共117页CD/5-FC CD/5-FC 大肠杆菌大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase,cytosine deaminase,CDCD）基因，）基因，胞嘧啶脱氨酶胞嘧啶脱氨酶在细胞内将无毒性在细胞内将无毒性5-5-氟胞嘧啶氟胞嘧啶（5-FC5-FC）转变成毒性产物）转变成毒性产物5-5-氟尿嘧啶（氟尿嘧啶（5-5-FUFU）。）。5-5-氟尿嘧啶氟尿嘧啶通过竞争性抑制通过竞争性抑制胸苷酸合酶胸苷酸合酶的活的活性，从而性，从而抑制脱氧胸苷三磷酸抑制脱氧胸苷三磷酸的合成。的合成。第17页/共117页 旁旁观观者者效效应应:“自自杀杀基基因因”治治疗疗不不仅仅使使转转导导了了“自自杀杀基基因因”的的肿肿瘤瘤细细胞胞在在用用药药后后被被杀杀死死，而而且且与与其其相相邻邻的的未未转转导导“自自杀杀基基因因”的的肿肿瘤瘤细细胞胞也被杀死。也被杀死。2.2.旁观者效应旁观者效应第18页/共117页（五）基因免疫治疗（五）基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强细胞因子或通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHCMHC基因基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。免疫反应。第19页/共117页二、基因治疗的必要条件1.发病机制在DNA水平上已经清楚；2.要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解；3.该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作；第20页/共117页1.外源基因可有效导入靶细胞2.外源基因能在靶细胞中长期稳定存留3.导入基因能适量表达4.导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害理想的基因治疗还必须：第21页/共117页二、基因转移技术二、基因转移技术TheTechniqueofGeneTransfer第22页/共117页 基因治疗途径基因治疗途径1、间接体内治疗途径（、间接体内治疗途径（ex vivo)是先从患者体内取出某一器官组织的细胞，是先从患者体内取出某一器官组织的细胞，体外扩增后，将目的基因转入靶细胞形成表体外扩增后，将目的基因转入靶细胞形成表达外源基因的遗传修饰细胞，选择高表达的达外源基因的遗传修饰细胞，选择高表达的细胞扩增培养，以一定数量移植患者体内。细胞扩增培养，以一定数量移植患者体内。（安全、易控制但操作复杂）（安全、易控制但操作复杂）2 2、直接体内治疗途径（in vivoin vivo）将目的基因体内直接转移到靶细胞，所用载将目的基因体内直接转移到靶细胞，所用载体必须具有特异的导向性和转移效率。（操体必须具有特异的导向性和转移效率。（操作简单但疗效短、免疫排斥等）作简单但疗效短、免疫排斥等）第23页/共117页基因治疗的两种途径基因治疗的两种途径载体载体目的基因目的基因invivoexvivo靶细胞第24页/共117页 基因转移基因转移(gene transfer)(gene transfer)技术：技术：1.1.病毒介导的基因转移系统。病毒介导的基因转移系统。2.2.非病毒介导的基因转移系统非病毒介导的基因转移系统。第25页/共117页 1.1.病毒介导的基因转移系统病毒介导的基因转移系统 病毒载体病毒载体介导的基因转移效率较高，介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有据统计，有72%72%的临床实验计划和的临床实验计划和71%71%的的病例使用了病毒载体，其中用得最多的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是是逆转录病毒载体逆转录病毒载体。第26页/共117页具有包膜，圆球状，直径为具有包膜，圆球状，直径为8080 120nm120nm基因组是基因组是单正链单正链RNARNA，3.53.5 9.0kb9.0kb病毒颗粒中有病毒颗粒中有逆转录酶逆转录酶能整合于宿主细胞的染色体能整合于宿主细胞的染色体 （1 1）逆转录病毒）逆转录病毒（Retroviruses）第27页/共117页逆转录病毒颗粒结构逆转录病毒颗粒结构第28页/共117页RNA逆转录酶逆转录酶衣壳蛋白衣壳蛋白基质蛋白基质蛋白包膜包膜gp120gp41第29页/共117页Reverse transcriptionIntegrationTranscriptionPackagingLifecycle of retrovirus第30页/共117页第31页/共117页逆转录病毒逆转录病毒整合入宿主整合入宿主DNADNA中的分子机制，其本质是中的分子机制，其本质是转座转座第32页/共117页LTR(long-terminal repeat):长末端重复序列长末端重复序列Provirus(原病毒原病毒):被被整合整合到细胞基因组中的逆到细胞基因组中的逆转录病毒序列转录病毒序列第33页/共117页3 forms第34页/共117页Two fates of RNA:Translation:作为作为mRNAmRNA翻译成病毒的蛋白质翻译成病毒的蛋白质Packaging：作为病毒作为病毒RNARNA基因组被装配成新的基因组被装配成新的病毒颗粒病毒颗粒第35页/共117页Everything is ready!第36页/共117页Packaging2 RNAs in 1 virus第37页/共117页HIV从受感染细胞的质膜出芽的情形从受感染细胞的质膜出芽的情形逆转录病毒的产生包括将RNA包装到衣壳中，然后从细胞的细胞膜上得到部分膜，出芽释放。第38页/共117页 调节和调节和启动转录启动转录 LTR gag pol env LTR 长末端长末端长末端长末端重复序列重复序列重复序列重复序列正常的病毒基因正常的病毒基因正常的病毒基因正常的病毒基因核心蛋白质核心蛋白质(Nucleoproteincore)编码逆转录编码逆转录酶和整合酶酶和整合酶(integrase)编码病毒外壳编码病毒外壳蛋白质蛋白质(Envelope)GenomeStructureofRetrovirus第39页/共117页（1 1）两端各有一）两端各有一长末端重复序列长末端重复序列LTRLTR。（2 2）LTRLTR由由U3U3、R R和和U5U5三部分组成。三部分组成。(1)(1)在在U3U3内有内有增强子增强子和和启动子启动子；(2)U3(2)U3和和U5U5两两端端分分别别有有病病毒毒整整合合序序列列(IS)(IS)；(3)(3)在在R R内还有内还有poly(A)poly(A)加尾信号加尾信号。逆转录病毒前病毒的结构特点逆转录病毒前病毒的结构特点 第40页/共117页（3 3）病毒有三个结构基因）病毒有三个结构基因(1)(1)gaggag基因基因，编码核心蛋白；，编码核心蛋白；(2)(2)polpol基因基因，编码逆转录酶和整合酶；，编码逆转录酶和整合酶；(3)(3)envenv基基因因，编编码码病病毒毒外外壳壳或或包包膜膜糖糖蛋蛋白白(包包括括外外膜膜糖糖蛋蛋白白和和穿穿膜蛋白膜蛋白)。（4 4）55端端LTRLTR下下游游有有一一段段病病毒毒包包装装所所必必需需的的包包装装信信号号序序列列（）及及剪剪接接供供体体位位点点(SD)(SD)和和剪接受体位点剪接受体位点(SA)(SA)。逆转录病毒前病毒的结构特点逆转录病毒前病毒的结构特点 第41页/共117页构成逆转录病毒介导的基因转移系构成逆转录病毒介导的基因转移系统统逆转录病毒载体逆转录病毒载体由两部分组成：由两部分组成：(1)(1)保保留留病病毒毒颗颗粒粒的的包包装装信信号号而而缺缺失失病病毒毒蛋蛋白基因白基因第42页/共117页 (2)(2)辅辅助助细细胞胞株株(如如PA317)PA317)：它它由由缺缺陷陷型型逆转录病毒感染构建而成逆转录病毒感染构建而成第43页/共117页Retroviral packaging system第44页/共117页LTRLTRgaggagpolpolenvenv LTRLTRGagGag蛋白蛋白蛋白蛋白PoLPoL蛋白蛋白蛋白蛋白EnvEnv蛋白蛋白蛋白蛋白包装细胞系包装细胞系包装细胞系包装细胞系LTRLTRLTRLTR靶细胞靶细胞靶细胞靶细胞目的基因标记基因LTRLTRLTRLTR目的基因 标记基因12345假病毒颗粒的产生并感染靶细胞假病毒颗粒的产生并感染靶细胞逆转录病毒载体重组逆转录病毒(核酸部分只能是逆转录病毒载体)辅病毒辅病毒第45页/共117页 逆转录病毒载体的特点逆转录病毒载体的特点 逆转录病毒包膜上由逆转录病毒包膜上由envenv编码的糖蛋白编码的糖蛋白，能够被许能够被许多哺乳动物细胞膜上的多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别特异性受体识别，从而使，从而使逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。逆转录病毒结构基因逆转录病毒结构基因gaggag、envenv和和polpol的缺失不影响的缺失不影响其他部分的活性。其他部分的活性。前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。外源基因在靶细胞中的永久表达。包装好的包装好的假病毒颗粒假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转录病毒载体）（携带目的基因的重组逆转录病毒载体）以以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。于分离制备。第46页/共117页 逆转录病毒载体的主要缺点逆转录病毒载体的主要缺点 随机整合，有插入突变、激活癌基随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；因的潜在危险；逆转录病毒载体的容量较小，只能逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳容纳7 kb7 kb以下的外源基因。以下的外源基因。第47页/共117页（2 2）腺病毒）腺病毒(adenovirus(adenovirus，AVAV)载体载体腺腺病病毒毒是是一一种种大大分分子子(36(36 kb)kb)双双链链无无包包膜膜DNADNA病病毒毒。它通过受体介导的它通过受体介导的内吞作用内吞作用进入细胞内，进入细胞内，腺腺病病毒毒基基因因组组转转移移至至细细胞胞核核内内，保保持持在在染染色色体体外，外，不整合进入宿主细胞基因组中不整合进入宿主细胞基因组中。腺腺病病毒毒是是人人类类呼呼吸吸道道感感染染的的病病原原体体，但但目目前前尚尚未未发发现现与与肿肿瘤瘤发发生生有有关关联联。宿宿主主细细胞胞范范围围广广，可可感感染染分分裂裂和和非非分分裂裂终终末末分分化化细细胞胞，如如神神经经元元等。等。第48页/共117页纤毛第49页/共117页腺病毒的优点腺病毒的优点1.1.基因导入效率高，对人类安全；基因导入效率高，对人类安全；2.2.宿主范围广；宿主范围广；3.3.基因转导与细胞分裂无关；基因转导与细胞分裂无关；4.4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；入或气管内滴注；5.5.腺病毒载体容量较大，可插入腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb7.5 kb外源基因；外源基因；第50页/共117页 腺病毒载体缺点腺病毒载体缺点2.2.宿主的免疫反应导致宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂腺病毒载体表达短暂。3.3.有两个环节有两个环节可能产生复制型腺病毒可能产生复制型腺病毒。4.4.靶向性差。靶向性差。1.1.不能整合到靶细胞的基因组不能整合到靶细胞的基因组DNADNA中中。分裂增殖快。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。机会增多，表达时间相对较短。(1)(1)腺病毒产生过程中与腺病毒产生过程中与293293辅助细胞辅助细胞内内E1E1区序列发生同源重组；区序列发生同源重组；(2)(2)腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺病毒，甚至乳头瘤病腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺病毒，甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。毒、巨细胞病毒发生重组。第51页/共117页AAVVirusParticles（3 3）腺病毒相关病毒载体）腺病毒相关病毒载体腺病毒相关病毒腺病毒相关病毒(adenovirus associated(adenovirus associated virusvirus，AAVAAV)是一类是一类单链线状单链线状DNADNA缺陷型病毒缺陷型病毒。其基因组其基因组DNADNA小于小于5 kb5 kb，无包膜，外形为裸露的，无包膜，外形为裸露的2020面体颗粒。面体颗粒。AAVAAV不能独立复制不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感潜伏感染染。第52页/共117页StructureofAAVVirusGenomicDNAREP:病毒复制基因,CAP:编码衣壳蛋白的基因第53页/共117页AAVAAV的特点的特点 以潜伏感染为主；以潜伏感染为主；病毒基因组与细胞共存；病毒基因组与细胞共存；只要宿主细胞正常，只要宿主细胞正常，AAVAAV基因表达就处于抑制而维持潜伏状态；基因表达就处于抑制而维持潜伏状态；若细胞受刺激，表达应激基因，若细胞受刺激，表达应激基因，AAVAAV基因表达从而使基因表达从而使AAVAAV病毒复制；病毒复制；产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。第54页/共117页AAVAAV载体是目前正在研究的一类新型安全载体，载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性。它对人类无致病性。AAVAAV可以高效可以高效定点整合定点整合至人至人1919号染色体的特定号染色体的特定区域区域19q13.419q13.4中，并能较稳定地存在。中，并能较稳定地存在。这种靶向定点整合可以这种靶向定点整合可以避免随机整合可能带避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性险性，而且外源基因可以持续稳定表达而且外源基因可以持续稳定表达，并可受到，并可受到周围基因的调控，兼具逆转录病毒载体和腺周围基因的调控，兼具逆转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。病毒载体两者的优点。第55页/共117页 AAVAAV载体的缺陷：载体的缺陷：AAVAAV载体容量小，目前最多只能容载体容量小，目前最多只能容纳纳5 kb5 kb外源外源DNADNA片段；片段；感染效率比逆转录病毒载体低。感染效率比逆转录病毒载体低。在在40%-80%40%-80%的成人中存在过感染，的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥。可能会引起免疫排斥。第56页/共117页第57页/共117页2.2.非病毒载体介导的基因转移系统非病毒载体介导的基因转移系统（1 1）脂质体介导的基因转移技术脂质体介导的基因转移技术脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。基本原理基本原理:利用利用阳离子脂质体单体阳离子脂质体单体与与DNADNA混合后，可以自动混合后，可以自动形成包埋外源形成包埋外源DNADNA的脂质体的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用内吞作用将外源将外源DNADNA（即目（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。的基因）转移至细胞内，并进行表达。第58页/共117页 脂质体介导的基因转移示意图第59页/共117页脂质体介导法缺点脂质体介导法缺点：脂质体介导进入靶细胞内，脂质体介导进入靶细胞内，易被单核易被单核-吞噬细胞系统选择性吞噬、降解吞噬细胞系统选择性吞噬、降解。第60页/共117页缺点：受体介导的缺点：受体介导的DNA通常进入细胞溶酶体内被降解。通常进入细胞溶酶体内被降解。（2 2）受体介导转移技术）受体介导转移技术将将DNADNA与与细胞细胞或组织亲和性的或组织亲和性的配体配体偶联，可使偶联，可使DNADNA具有靶向性。具有靶向性。这种偶联通常通过这种偶联通常通过多聚阳离子多聚阳离子（如多聚赖氨（如多聚赖氨酸）来实现。酸）来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷通过电荷相互作用与带负电荷的相互作用与带负电荷的DNADNA结合，将结合，将DNADNA包围包围，只留下配体暴露于表面。只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，细胞吞饮，从而将外源从而将外源DNADNA导入靶细胞。导入靶细胞。第61页/共117页受体介导转移技术示意图受体介导转移技术示意图第62页/共117页（3 3）基因直接注射技术）基因直接注射技术不需要进行基因工程的繁琐操作，不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因直接将裸露基因DNADNA注入动物肌肉或某些器官组织内。注入动物肌肉或某些器官组织内。动物实验表明：接受注射外源动物实验表明：接受注射外源DNADNA的小鼠能够按其基的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。1.1.将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%30%40%40%；2.2.将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；尿病所缺少的胰岛素；3.3.肌内注射凝血因子肌内注射凝血因子基因，可产生血友病所需的基因，可产生血友病所需的凝血因子等等。凝血因子等等。第63页/共117页基因直接注射法的优点基因直接注射法的优点1.1.制备具有调控部件的质粒制备具有调控部件的质粒DNADNA重组体的技术重组体的技术较容易；较容易；2.2.排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；用；3.3.导入的基因不需整合即可表达导入的基因不需整合即可表达，避免了逆转，避免了逆转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点；易中止或逆转的缺点；4.4.基因直接注射法可反复使用基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。下降。第64页/共117页三、基因转移的靶细胞靶细胞的选择须考虑：1.容易取出和移植。血液系统的细胞、成纤维细胞、成肌细胞；2.细胞具有较长的寿命3.离体细胞较易受外源基因转化4.离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内，仍较易成活体细胞体细胞生殖细胞生殖细胞第65页/共117页目前常用的靶细胞有：1.造血细胞2.皮肤成纤维细胞3.肝细胞4.血管内皮细胞5.淋巴细胞6.肌肉细胞7.肿瘤细胞第66页/共117页三、基因干预三、基因干预GeneInterference主要干扰特定细胞的主要干扰特定细胞的mRNA转录和翻译转录和翻译第67页/共117页基因干预的种类：基因干预的种类：1.1.反义反义RNA(antisense RNA(antisense RNA)RNA)2.2.干扰干扰RNA(RNA RNA(RNA interference)interference)3.3.核酶核酶 (ribozyme)第68页/共117页（一）反义（一）反义RNARNADefinition:反义反义RNA（AntisenseRNA)：指与靶指与靶RNA(或或DNA)具有互补序列的具有互补序列的RNA分子。分子。第69页/共117页反义反义RNA技术技术 通过通过体外合成的反义体外合成的反义RNA或或构建能转录反义构建能转录反义RNA的重组的重组DNA质粒质粒转入细胞中，利用转入细胞中，利用碱基互补原理碱基互补原理结合细胞中特异结合细胞中特异mRNA以调控其表达。以调控其表达。第70页/共117页类反义RNA直接作用于靶mRNA的S D序列和(或)部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶 降解；类反义RNA与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象变化，抑制翻译；类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转录 1.根据反义RNA的作用机制分为第71页/共117页反义寡聚核苷酸（类）与mRNA特异性结合，阻断翻译过程第72页/共117页利用反义利用反义RNARNA对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种：方法有两种：（1 1）体外合成反义体外合成反义RNARNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNARNA后，后，发挥作用。发挥作用。缺点：缺点：RNARNA易降解易降解（2 2）构建能转录反义构建能转录反义RNARNA的重组质粒的重组质粒，将质粒转入细胞，转录，将质粒转入细胞，转录出反义出反义RNARNA而发挥作用而发挥作用缺点：细胞内转录的反义缺点：细胞内转录的反义RNARNA量不易控制量不易控制2.反义RNA与基因表达调控第73页/共117页 反义反义RNARNA的关键技术问题：的关键技术问题：反义反义RNARNA进入靶细胞前的降解问题进入靶细胞前的降解问题专专一一性性转转移移问问题题：如如何何解解决决某某一一组组织织、器器官官或系统中部分细胞病变进行专一性转移治疗。或系统中部分细胞病变进行专一性转移治疗。第74页/共117页3.受体介导反义RNA转移技术 受受受受体体介介导导DNADNA转转移移方方法法的的启启发发把把DNADNA换换成成反反义义RNARNA，就就可可以以实实现现受受体体介介导导的的反义反义RNARNA的转移。的转移。第75页/共117页将将脱唾液酸血清类粘蛋白脱唾液酸血清类粘蛋白（ASGPASGP）与）与多聚赖多聚赖氨酸氨酸（PLPL）共价连接，得到）共价连接，得到ASGP-PLASGP-PL复合物复合物，成为运载核酸的工具。成为运载核酸的工具。结合反义结合反义RNARNA，成为成为ASGPPLASGPPL反义反义RNARNA复合复合物物ASGP-PLASGP-PL反义反义RNARNA复合物可以复合物可以专一性地被肝专一性地被肝细胞表面的细胞表面的ASGPASGP受体所识别受体所识别，并吞噬到肝细，并吞噬到肝细胞中，反义胞中，反义RNARNA进入肝细胞后，可被逐渐释放进入肝细胞后，可被逐渐释放出来发挥作用。出来发挥作用。例：例：第76页/共117页受体介导的受体介导的RNARNA转移十分转移十分专一专一，而且效率高；，而且效率高；被转移的被转移的RNARNA是被保护的，与周围环境之间存在是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层多聚赖氨酸的保护层,可可以以抵抗环境中的核酸酶的降解作用抵抗环境中的核酸酶的降解作用。第77页/共117页4.反义RNA的应用（一）利用反义利用反义RNA的原癌基因失活疗法：的原癌基因失活疗法：阻止或抑制原癌基因的过度表达及抑制癌基因突变体阻止或抑制原癌基因的过度表达及抑制癌基因突变体mRNA成熟成熟第78页/共117页 原癌基因调控细胞生长，增殖与分化正常情况下，表达受严格控制一旦调节失控，基因产物（生长因子，生长因子受体，胞内外传递信号等癌蛋白）分泌过剩，细胞恶性增生，致癌第79页/共117页根据已知癌基因的核苷酸序列合成反义RNA相应的反义寡聚核苷酸与肿瘤癌基因活化表达的mRNA的起始翻译位点结合成RNA/RNA双链体双链体阻止核糖体的结合，或核糖体沿mRNA上移，抑制翻译治疗方法第80页/共117页抗HIV-l的作用：从翻译水平封闭基因表达，并干扰mRNA的剪切、加工而实现抗病毒作用 反义RNA的应用（二）第81页/共117页tat为HIV-l重要的调节基因，编码反式激活因子 Tat蛋白,它能增强HIV-1基因转录起始和延伸的效率.TAR序列是TAT激活HIV基因表达所必需的效应元件。处于LTR的R区内。Tat结合到TAR的茎环结构上。第82页/共117页Tat可与RNA结合因子一起以复合体形式结合在转录物的TAR序列上，并与装配在启动子处的转录起始复合体作用，这种作用导致TFH的激酶活性被激活，结果RNA聚合酶的羧基端结构域(CTD)实现磷酸化，使得RNA聚合酶前进，完成HIV转录单位的阅读，实现HIV蛋白的大量合成。第83页/共117页抗HIV-l策略在逆转录病毒启动子LTR之后连接反义tat与多聚TAR的构建物(LTR-25TAR-AS-TAT)，具有反义tat及TAR诱饵的双重作用第84页/共117页gag是HIV-1的结构基因，编码p24等病毒结构蛋白Veres等构建了逆转录病毒载体，在细胞内表达互补于gag区不同长度的反义RNA(225-1225nt)在CEM-SS T细胞及外周血CD4细胞均有抑制HIV-l复制的作用长片段反义RNA的抗HIV-l作用更好，可能由于它能与不同种的HIV-l RNA结合而限制了病毒的逃逸 第85页/共117页 3.3.反义反义RNARNA的应用前景的应用前景 受受体体介介导导的的反反义义RNARNA基基因因治治疗疗有有其其自自身身的的优优点点，而在一定程度上补充了转基因治疗的不足。而在一定程度上补充了转基因治疗的不足。（l l）安全性高）安全性高 （2 2）反义）反义RNARNA设计设计 和制备方便和制备方便 （3 3）具有剂量调节效应）具有剂量调节效应 （4 4）能直接作用于一些）能直接作用于一些RNARNA病毒病毒 反反义义RNARNA只只作作用用于于特特异异的的mRNAmRNA分分子子，不不改改变变所所调调节节基基因因的的结结构构。反反义义RNARNA分分子子无无论论怎怎样样修修饰饰，最最终终将将在在细细胞胞内内部部被被降解，不留降解，不留“残渣残渣”。在在治治疗疗RNARNA病病毒毒感感染染性性疾疾病病时时，受受体体介介导导的的反反义义RNARNA基基因因治治疗疗比比一一般般的的DNADNA基基因因治治疗疗有有更更大大的的优优势势。利利用用反反义义RNARNA可可以直接作用于病毒以直接作用于病毒RNARNA，阻断，阻断RNARNA病毒的繁殖。病毒的繁殖。第86页/共117页1.RNA1.RNA干扰现象干扰现象 （二）干扰（二）干扰RNARNA对对RNARNA干扰的认识来源于用干扰的认识来源于用线虫线虫（C.C.eleganselegans）和）和果蝇果蝇所进行的实验。所进行的实验。实验结果显示，有义链实验结果显示，有义链RNARNA（sense RNAsense RNA）或）或反义链反义链RNARNA（antisense RNAantisense RNA）均能抑制线虫）均能抑制线虫基因的表达，双链基因的表达，双链RNARNA比单链比单链RNARNA更为有效。更为有效。将特异的双链将特异的双链RNARNA注入线虫体内注入线虫体内可抑制有同源可抑制有同源序列的基因的表达。序列的基因的表达。得到的结果是得到的结果是有义链有义链RNARNA和反义链和反义链RNARNA都同样阻断基因表达途径。都同样阻断基因表达途径。这与传统上对反义这与传统上对反义RNARNA技术的解释正好相反。技术的解释正好相反。而且其抑制基因表达的效率比反义而且其抑制基因表达的效率比反义RNARNA至少高至少高2 2个数量级。个数量级。第87页/共117页 RNA RNA干扰干扰（RNA interferenceRNA interference，RNAiRNAi）是一种）是一种由双链由双链RNARNA诱发的基因沉默现诱发的基因沉默现象象。在此过程中，与双链。在此过程中，与双链RNARNA有同源序列的有同源序列的信使信使RNARNA（mRNAmRNA）被降解，从而抑制该基因）被降解，从而抑制该基因的表达。的表达。第88页/共117页 2.RNA2.RNA干扰的机制干扰的机制 RNARNA干扰过程主要有干扰过程主要有2 2个步骤：个步骤：（1 1）小干扰性小干扰性RNARNA（siRNAsiRNA）（2 2）siRNAsiRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为体，称为RNARNA诱导的沉默复合体诱导的沉默复合体（RNA-induced RNA-induced silencing complex,silencing complex,RISCRISC)。该复合体可识别与该复合体可识别与siRNAsiRNA有同源序列的有同源序列的mRNAmRNA，并在特异的位点将该，并在特异的位点将该mRNAmRNA切断。切断。长双链长双链RNARNA被细胞内的双链被细胞内的双链RNARNA特异性核酸酶特异性核酸酶DicerDicer切成切成21-2321-23个碱基对的短双链个碱基对的短双链RNARNA，称为，称为小小干扰性干扰性RNARNA（small interfering RNAsmall interfering RNA，siRNAsiRNA）。）。第89页/共117页siRNA反义链可作为引物。与mRNA结合，并以其为模板，在依赖于RNA的聚合酶催化下合成新的dsRNA。Dicer切割成siRNA，再识别新的mRNA。这是RNAi的高效性和持久