《生物化学实验》优秀PPT.ppt

生物化学试验生物化学试验课程简介 生物化学课程是一门与生物技术相关的专业基础必修课，本试验课程是附属于该课程的一个教学环节，开设操作性、验证性、综合性等试验项目，试验内容主要进行生物分子（蛋白质、核酸、糖、维生素）的定性、定量测定和分别提取制备，学习酶活性和维生素的测定方法等试验，涉及了生物化学的基本试验技术及典型仪器设备。通过试验有助于学生加深对生物化学的基本学问和基本理论的理解，驾驭生物化学的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术。目 录l试验一试验一氨基酸的分别鉴定氨基酸的分别鉴定纸层析法纸层析法(操作性操作性)4)4学时学时l试验二试验二考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度(操作性操作性)3)3学时学时l试验三试验三血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳(验证性验证性)5)5学时学时l试验四试验四动物肝肝脏动物肝肝脏DNADNA的分别与鉴定的分别与鉴定(操作性操作性)3)3学时学时l试验五试验五血液中葡萄糖的测定血液中葡萄糖的测定(操作性操作性)3)3学时学时l试验六试验六血清中总胆固醇的测定血清中总胆固醇的测定(操作性操作性)4)4学时学时l试验七试验七唾液淀粉酶活性的视察唾液淀粉酶活性的视察(综合性综合性)4)4学时学时l试验八试验八维生素维生素C C的定量测定的定量测定(操作性操作性)4)4学时学时l试验九试验九脂肪酸的脂肪酸的-氧化氧化(操作性操作性)4)4学时学时l试验十试验十琼脂糖胶电泳法分别乳酸脱氢同工酶琼脂糖胶电泳法分别乳酸脱氢同工酶(操作性操作性)4学时学时l试验十一试验十一酪蛋白的制备酪蛋白的制备(操作性操作性)4学时学时l试验十二试验十二肝脏谷丙转氨酶活力测定肝脏谷丙转氨酶活力测定(综合性综合性)3学时学时试验一试验一氨基酸的分别鉴定氨基酸的分别鉴定纸层析法纸层析法【试验目的】【试验目的】1.驾驭纸上层析的一般原理和操作方法。驾驭纸上层析的一般原理和操作方法。2.了解氨基酸的特征性颜色反应。了解氨基酸的特征性颜色反应。3.学会分析未知样品的氨基酸成分。学会分析未知样品的氨基酸成分。【试验原理】【试验原理】纸上层析法是支配层析法中的一种，常以滤纸纸上层析法是支配层析法中的一种，常以滤纸为惰性支持物。纸上层析法是分别、鉴定和定量测为惰性支持物。纸上层析法是分别、鉴定和定量测定氨基酸、糖类、抗生素等有机物质的一项重要而定氨基酸、糖类、抗生素等有机物质的一项重要而简便的分析方法。所用设备简洁、操作便利，运用简便的分析方法。所用设备简洁、操作便利，运用样品少，分别效果好，为近样品少，分别效果好，为近代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用于科代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用于科代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用于科代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用于科研和生产分析工作中。研和生产分析工作中。研和生产分析工作中。研和生产分析工作中。纸上层析的原理：常以水和有机溶剂作为展层剂；纸上层析的原理：常以水和有机溶剂作为展层剂；纸上层析的原理：常以水和有机溶剂作为展层剂；纸上层析的原理：常以水和有机溶剂作为展层剂；水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶剂后的水相，一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤剂后的水相，一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤剂后的水相，一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤剂后的水相，一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力，而与有机纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力，而与有机纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力，而与有机纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力，而与有机溶剂的亲和力相对较弱，因此我们认为水相为固定相，溶剂的亲和力相对较弱，因此我们认为水相为固定相，溶剂的亲和力相对较弱，因此我们认为水相为固定相，溶剂的亲和力相对较弱，因此我们认为水相为固定相，有机溶剂相为移动相。由于物质的极性大小不同，在两有机溶剂相为移动相。由于物质的极性大小不同，在两有机溶剂相为移动相。由于物质的极性大小不同，在两有机溶剂相为移动相。由于物质的极性大小不同，在两相中支配比例有所差异。极性小的物质在有机相中支配相中支配比例有所差异。极性小的物质在有机相中支配相中支配比例有所差异。极性小的物质在有机相中支配相中支配比例有所差异。极性小的物质在有机相中支配较多，随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中支较多，随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中支较多，随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中支较多，随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中支配较多，移动相对较慢，从而将极性不同的物质分开。配较多，移动相对较慢，从而将极性不同的物质分开。配较多，移动相对较慢，从而将极性不同的物质分开。配较多，移动相对较慢，从而将极性不同的物质分开。一般来说，在相同的条件下，每种物质都有其固定的一般来说，在相同的条件下，每种物质都有其固定的一般来说，在相同的条件下，每种物质都有其固定的一般来说，在相同的条件下，每种物质都有其固定的RfRf值。值。值。值。RfRf值的定义为：值的定义为：值的定义为：值的定义为：Rf=(Rf=(原点到层析斑点中心的距离原点到层析斑点中心的距离原点到层析斑点中心的距离原点到层析斑点中心的距离)/)/（原点到溶剂前沿的（原点到溶剂前沿的（原点到溶剂前沿的（原点到溶剂前沿的距离）距离）距离）距离）用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相比较。若用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相比较。若用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相比较。若用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相比较。若没有标准品，可选择文献记载的该物质层析条件，依据没有标准品，可选择文献记载的该物质层析条件，依据没有标准品，可选择文献记载的该物质层析条件，依据没有标准品，可选择文献记载的该物质层析条件，依据文献文献文献文献RfRf值进行鉴定。值进行鉴定。值进行鉴定。值进行鉴定。【试验试剂与器材】【试验试剂与器材】【试验试剂与器材】【试验试剂与器材】1 1、溶剂系统、溶剂系统、溶剂系统、溶剂系统（1 1）碱相溶剂：正丁醇）碱相溶剂：正丁醇）碱相溶剂：正丁醇）碱相溶剂：正丁醇:12%:12%氨水氨水氨水氨水:95%:95%乙醇乙醇乙醇乙醇13:3:313:3:3（体积比）（体积比）（体积比）（体积比）（2）酸相溶剂：）酸相溶剂：正丁醇正丁醇正丁醇正丁醇:80%:80%甲酸甲酸甲酸甲酸:水水水水15:3:215:3:2（体积比）（体积比）（体积比）（体积比）2、显色贮备液：、显色贮备液：0.1%0.1%水合茚三酮丙酮溶液水合茚三酮丙酮溶液水合茚三酮丙酮溶液水合茚三酮丙酮溶液3、V（0.1%硫酸铜）硫酸铜）:V（75%乙醇）乙醇）=2:38溶液。溶液。4、混合氨基酸溶液、混合氨基酸溶液6mg/ml。5、滤纸。、滤纸。6、烧杯、烧杯10ml（1）。）。7、剪刀。、剪刀。8、层析缸（、层析缸（2）。）。9、微量注射器、微量注射器10l（1）或毛细管。）或毛细管。10、电吹风（、电吹风（1）。）。11、722型（或型（或7220型）分光光度计。型）分光光度计。【试验步骤】【试验步骤】1纸的处理纸的处理取取18cm长、长、18cm宽的滤纸一张，离底边宽的滤纸一张，离底边2cm处用铅笔轻轻划一条与底边平行的线，并等距处用铅笔轻轻划一条与底边平行的线，并等距离的在线上定点样点离的在线上定点样点(原点原点)划圈，使圈的直径小划圈，使圈的直径小于于0.5cm。2点样点样在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号（混合样可写（混合样可写M），然后用毛细管吸取样品，轻），然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的氨基酸圈内，待晾干或用冷风吹轻地点到相应的氨基酸圈内，待晾干或用冷风吹干后再点干后再点1次。每个样品共点次。每个样品共点2次。次。3层析层析将点好样的滤纸纵向卷起来，点样面对里，将点好样的滤纸纵向卷起来，点样面对里，点样点点样点位于一端，用针线缝成筒状，不要使滤纸两边接触位于一端，用针线缝成筒状，不要使滤纸两边接触位于一端，用针线缝成筒状，不要使滤纸两边接触位于一端，用针线缝成筒状，不要使滤纸两边接触(见图见图见图见图1)1)。将培育皿中放入将培育皿中放入将培育皿中放入将培育皿中放入2 23 3量的展层剂，放入层析缸中，量的展层剂，放入层析缸中，量的展层剂，放入层析缸中，量的展层剂，放入层析缸中，然后将滤纸直立于层析缸的培育皿中，样品端向下垂直放然后将滤纸直立于层析缸的培育皿中，样品端向下垂直放然后将滤纸直立于层析缸的培育皿中，样品端向下垂直放然后将滤纸直立于层析缸的培育皿中，样品端向下垂直放置，切勿使展层剂浸到样品点，起先层析。置，切勿使展层剂浸到样品点，起先层析。置，切勿使展层剂浸到样品点，起先层析。置，切勿使展层剂浸到样品点，起先层析。当溶剂前沿到达离上端当溶剂前沿到达离上端当溶剂前沿到达离上端当溶剂前沿到达离上端2cm2cm处，取出滤纸，用铅笔处，取出滤纸，用铅笔处，取出滤纸，用铅笔处，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿，晾干。描出溶剂前沿，晾干。描出溶剂前沿，晾干。描出溶剂前沿，晾干。图图1滤纸的缝合滤纸的缝合4 4显色显色显色显色用喷雾器向滤纸上匀整喷洒用喷雾器向滤纸上匀整喷洒用喷雾器向滤纸上匀整喷洒用喷雾器向滤纸上匀整喷洒0.1%0.1%茚三酮，晾干后，茚三酮，晾干后，茚三酮，晾干后，茚三酮，晾干后，将滤纸放入烘箱中将滤纸放入烘箱中将滤纸放入烘箱中将滤纸放入烘箱中(80-100(80-100)，烘烤，烘烤，烘烤，烘烤5 5分钟后，滤纸上即分钟后，滤纸上即分钟后，滤纸上即分钟后，滤纸上即显出紫红色的氨基酸斑点。用铅笔描出斑点轮廓显出紫红色的氨基酸斑点。用铅笔描出斑点轮廓显出紫红色的氨基酸斑点。用铅笔描出斑点轮廓显出紫红色的氨基酸斑点。用铅笔描出斑点轮廓(见图见图见图见图2)2)。图图图图2.2.层析谱层析谱层析谱层析谱1 1原点；原点；原点；原点；2 2层析点；层析点；层析点；层析点；3 3溶剂前沿溶剂前沿溶剂前沿溶剂前沿5 5计算计算计算计算用尺量出原点到斑点中心距离以及原点到溶剂前沿用尺量出原点到斑点中心距离以及原点到溶剂前沿用尺量出原点到斑点中心距离以及原点到溶剂前沿用尺量出原点到斑点中心距离以及原点到溶剂前沿距离，计算各标准氨基酸和混合氨基酸的距离，计算各标准氨基酸和混合氨基酸的距离，计算各标准氨基酸和混合氨基酸的距离，计算各标准氨基酸和混合氨基酸的RfRf值。值。值。值。【留意事项】【留意事项】【留意事项】【留意事项】(1)(1)在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，否则手指在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，否则手指在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，否则手指在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，否则手指上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。(2)(2)在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。(3)(3)展层结束后，切勿遗忘用铅笔描出溶剂前沿。展层结束后，切勿遗忘用铅笔描出溶剂前沿。展层结束后，切勿遗忘用铅笔描出溶剂前沿。展层结束后，切勿遗忘用铅笔描出溶剂前沿。(4)(4)点样斑点不能太大（其直径应小于点样斑点不能太大（其直径应小于点样斑点不能太大（其直径应小于点样斑点不能太大（其直径应小于0.5cm0.5cm），防止氨），防止氨），防止氨），防止氨基酸斑点重复；吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。基酸斑点重复；吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。基酸斑点重复；吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。基酸斑点重复；吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。(5)(5)依据目的、要求，选择合适溶剂系统。依据目的、要求，选择合适溶剂系统。依据目的、要求，选择合适溶剂系统。依据目的、要求，选择合适溶剂系统。试验二试验二 考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 【试验目的】【试验目的】学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法。和方法。【试验原理】【试验原理】考马斯亮蓝测定蛋白质含量是利用蛋白质考马斯亮蓝测定蛋白质含量是利用蛋白质-染料结合法的原理，定量测定微量蛋白质浓度快染料结合法的原理，定量测定微量蛋白质浓度快速、灵敏的方法。速、灵敏的方法。考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250G-250存在着两种不同样色形存在着两种不同样色形式，红色式，红色-棕黑色和蓝色。染料与蛋白质结合后有棕黑色和蓝色。染料与蛋白质结合后有红色红色-棕黑色和蓝色形式，最大光吸取由棕黑色和蓝色形式，最大光吸取由465nm465nm变成变成595nm595nm，测定，测定595 nm595 nm吸光的增加量，可以测定与其吸光的增加量，可以测定与其结合的蛋白质的量。结合的蛋白质的量。蛋白质与染料结合速度很快，蛋白质与染料结合速度很快，2min就可以反应完全，就可以反应完全，并可以稳定并可以稳定1h，蛋白质，蛋白质-染料复合物有很大的消光系数，染料复合物有很大的消光系数，使得测定蛋白质浓度是灵敏度很高。测定范围为使得测定蛋白质浓度是灵敏度很高。测定范围为10-100g蛋白质，微量测定时达到蛋白质，微量测定时达到1-10g蛋白质。此反应反复性好蛋白质。此反应反复性好精度高，线性关系好。精度高，线性关系好。【试验试剂与器材】【试验试剂与器材】1、标准蛋白液（、标准蛋白液（0.1mg/ml）0.2g结晶牛血清白蛋白用结晶牛血清白蛋白用0.9%NaCl稀释到稀释到2000ml。2、0.9%NaCl3、考马斯亮蓝试剂：、考马斯亮蓝试剂：100mg考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250溶于溶于50ml5%乙醇中，加乙醇中，加100ml85%磷酸，蒸馏水稀释磷酸，蒸馏水稀释1000ml，滤纸过滤。，滤纸过滤。4、待测蛋白：人血清，用前用、待测蛋白：人血清，用前用0.9%NaCl稀释稀释200倍。倍。5、漩涡混合器、漩涡混合器6、移液管、移液管0.5ml（2），），1.0ml（2），），5ml（1）7、分光光度计、分光光度计8、试管、试管1.5cm15cm(8)9、量筒、量筒100ml(1)10、电子分析天平、电子分析天平11、试管架、试管架(1)【试验步骤】【试验步骤】一、标准曲线线的绘制一、标准曲线线的绘制取取7支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。以支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。以A595为纵坐标，标准蛋白质年浓度为横坐标，绘制标准为纵坐标，标准蛋白质年浓度为横坐标，绘制标准曲线。曲线。试管号试管号试剂试剂1234561mg/ml标准标准蛋白液蛋白液/ml0.10.20.30.40.50.60.15mol/LNaCl/ml10.90.80.70.60.4考马斯亮蓝考马斯亮蓝染液染液/ml4.04.04.04.04.04.0摇匀，摇匀，1小时内以小时内以1号管为空白对照，在号管为空白对照，在595nm处比色处比色A595nm二、未知样液的测定二、未知样液的测定另取一干净试管，加入样品另取一干净试管，加入样品1.0ml及考马斯亮蓝染液及考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀，室温静置，混匀，室温静置3min，于波长，于波长595nm处比色，读处比色，读取吸光度。在标准曲线上查找蛋白质浓度。取吸光度。在标准曲线上查找蛋白质浓度。【留意事项】【留意事项】1、假如测定的要求很严格，可以在试剂加入、假如测定的要求很严格，可以在试剂加入5-20min内测内测定吸光度，在这段时间内样色很稳定。定吸光度，在这段时间内样色很稳定。2、测定中，蛋白质、测定中，蛋白质-染料复合物会吸附在比色皿上，试验染料复合物会吸附在比色皿上，试验证明可以忽视。测定完后可以用乙醇洗干净。证明可以忽视。测定完后可以用乙醇洗干净。【思索题】【思索题】1、依据一下要求选择一种或者几种蛋白质定量测、依据一下要求选择一种或者几种蛋白质定量测定蛋白定蛋白质浓度。质浓度。（1）样品不简洁溶解，但要求结果很精确。）样品不简洁溶解，但要求结果很精确。（2）要求在半天内测定）要求在半天内测定60个样品。个样品。（3）要求很快速的测定一系列试管（）要求很快速的测定一系列试管（30只）中溶只）中溶液的蛋液的蛋白质浓度白质浓度2、试着比较该法与其他几种方法的优缺点。、试着比较该法与其他几种方法的优缺点。试验三试验三 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 【试验目的】【试验目的】驾驭醋酸纤维素薄膜电泳的原理和操作过驾驭醋酸纤维素薄膜电泳的原理和操作过程。程。【试验原理】【试验原理】血清中各种蛋白质的等电点不同，在血清中各种蛋白质的等电点不同，在pH8.6pH8.6的巴比妥缓冲液中，各种蛋白质所带的净电的巴比妥缓冲液中，各种蛋白质所带的净电荷量不相等，加上蛋白质分子大小不相同，在电荷量不相等，加上蛋白质分子大小不相同，在电场中移动的速度就不等，例如，白蛋白等电点比场中移动的速度就不等，例如，白蛋白等电点比其他蛋白质低，在其他蛋白质低，在pH8.6pH8.6时带的负电荷比其他蛋白时带的负电荷比其他蛋白质多，加上白蛋白的分子较小，因此在电场中比质多，加上白蛋白的分子较小，因此在电场中比其他蛋白质移动速度快。这样，血清蛋白质在醋其他蛋白质移动速度快。这样，血清蛋白质在醋酸纤维素薄膜上就可以形成区带，用以分别和分酸纤维素薄膜上就可以形成区带，用以分别和分析蛋白质。析蛋白质。【试验试剂与器材】【试验试剂与器材】（一）仪器（一）仪器1、电泳仪；、电泳仪；2、电泳槽；、电泳槽；3、恒温水浴箱；、恒温水浴箱；4、721型分光光度计型分光光度计（二）材料（二）材料1、人血清或鸡血清、人血清或鸡血清2、醋酸纤维素薄膜、醋酸纤维素薄膜（三）试剂（三）试剂1、0.05mol/L巴比妥钠巴比妥钠-HCL缓冲液（缓冲液（pH8.6）：）：取巴比妥钠取巴比妥钠10.3g，加蒸馏水约，加蒸馏水约800ml溶解后，溶解后，加入加入lmol/LHCL9.55ml，补加蒸馏水至，补加蒸馏水至1000ml，测试其，测试其pH应应为为8.6。2、染色液：取氨基黑、染色液：取氨基黑10B1.0g，磺基水杨酸，磺基水杨酸10g，加冰，加冰醋酸醋酸20ml，蒸馏水，蒸馏水400ml，摇匀溶解。，摇匀溶解。3、漂洗液：、漂洗液：2.5醋酸醋酸4、洗脱液：、洗脱液：0.02mol/LNaOH溶液溶液5、透亮液：无水乙醇、透亮液：无水乙醇7份，冰醋酸份，冰醋酸3份混合即成。份混合即成。【试验步骤】【试验步骤】1薄膜准备薄膜准备2点样点样3电泳电泳4染色和漂洗染色和漂洗5薄膜和透亮薄膜和透亮6定量定量（1）洗脱法）洗脱法留意！白蛋白因加入留意！白蛋白因加入NaOH的量比其他管多，其光的量比其他管多，其光密度值应乘以稀释倍数，得到数值再代入上式中计算。密度值应乘以稀释倍数，得到数值再代入上式中计算。+白蛋白白蛋白(A)21（2）光密度计法）光密度计法（3）用本法定量，正常人数值为：）用本法定量，正常人数值为：白蛋白白蛋白54.0%73.0%540730g/L1球蛋白球蛋白2.8%5.1%2851g/L2球蛋白球蛋白6.3%10.6%63106g/L球蛋白球蛋白5.2%11.0%52110g/L球蛋白球蛋白12.5%20.0%125200g/L【留意事项】【留意事项】1醋酸纤维素薄膜的质量对结果影响很大，最醋酸纤维素薄膜的质量对结果影响很大，最好选用同一批号、薄膜厚度匀整、质量良好的醋好选用同一批号、薄膜厚度匀整、质量良好的醋酸纤维素薄膜。酸纤维素薄膜。2血清或其他电泳样品应簇新。血清或其他电泳样品应簇新。3点样应细窄、匀整、集中。点样量不宜过多，点样应细窄、匀整、集中。点样量不宜过多，点样位置要合适。点样位置要合适。4盐桥要放置平整，保证电场匀整。盐桥要放置平整，保证电场匀整。5电泳槽盖应密封，盖内空间不宜过大。电泳槽盖应密封，盖内空间不宜过大。6较低温度下电泳一般能获得较好的图谱，故较低温度下电泳一般能获得较好的图谱，故室温不宜过高。室温不宜过高。7选择合适的缓冲液离子强度。选择合适的缓冲液离子强度。8两电泳槽内缓冲液面应在同一水平。两电泳槽内缓冲液面应在同一水平。9要限制好电流，电压和电泳时间。要限制好电流，电压和电泳时间。10电泳槽内缓冲液可以多次运用。但操作时应尽量削电泳槽内缓冲液可以多次运用。但操作时应尽量削减缓冲液的污染、水分蒸发、减缓冲液的污染、水分蒸发、pH及离子强度的变更，及离子强度的变更，并应防止霉菌的滋长。并应防止霉菌的滋长。11染色、漂洗及洗脱时间要限制好，才能获得重复性染色、漂洗及洗脱时间要限制好，才能获得重复性良好的定量结果。良好的定量结果。【思索题】【思索题】1.电泳后，泳动在最前面的为何种蛋白质？分析缘由。电泳后，泳动在最前面的为何种蛋白质？分析缘由。2.点样时，置于电场的正极还是负极，为什么？点样时，置于电场的正极还是负极，为什么？试验四试验四 动物肝肝脏动物肝肝脏DNADNA的分别与鉴定的分别与鉴定 【试验目的】【试验目的】学习常用的学习常用的DNADNA分别方法分别方法 。【试验原理】【试验原理】在浓氯化钠在浓氯化钠(1-2mol/L)(1-2mol/L)溶液中，脱氧溶液中，脱氧核糖蛋白的溶解度很大，核糖蛋白的溶解很小。核糖蛋白的溶解度很大，核糖蛋白的溶解很小。在稀氯化钠在稀氯化钠(0.14mol/L)(0.14mol/L)溶液中，脱氧核糖核蛋溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖此，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白核蛋白和核糖核蛋白 从样品中分别抽提出来。从样品中分别抽提出来。将抽提的核蛋白用将抽提的核蛋白用SDS(SDS(十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠)处理，处理，DNA(或或RNA)即与蛋白质分开，可用氯仿即与蛋白质分开，可用氯仿-异戊醇将蛋白异戊醇将蛋白质沉淀除去，而质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向溶液则溶解于溶液中。向溶液中加入适中加入适量乙醇，量乙醇，DNA即析出。即析出。为了防止为了防止DNA(或或RNA)酶解，提取时加入酶解，提取时加入EDTA(乙二乙二胺四乙酸）。胺四乙酸）。【试验试剂与器材】【试验试剂与器材】15mol/LNaCl溶液：将溶液：将292.3gNaCl溶于水，稀释至溶于水，稀释至1000ml。20.14molNaCl-0.15molEDTA-Na溶液：溶液：溶溶8.18gNaCl及及37.2gEDTANa于蒸馏水，稀释至于蒸馏水，稀释至1000ml。325SDS溶液：溶溶液：溶25g十二烷基硫酸钠于十二烷基硫酸钠于100ml45乙醇。乙醇。0.015mol/LNaCl-0.0015mol柠檬酸三钠溶液柠檬酸三钠溶液,氯氯化化钠钠0.828g及柠檬酸三钠及柠檬酸三钠0.341g溶于蒸馏水溶于蒸馏水,稀释至稀释至1,000ml。5氯仿氯仿-异戊醇混合液异戊醇混合液:氯仿氯仿:异戊醇异戊醇=24:1(V/V)。61.5mol/LNaCl-015mol柠檬酸三钠溶液柠檬酸三钠溶液:氯化氯化钠钠82.8g及柠檬酸三钠及柠檬酸三钠34.1g溶于蒸馏水溶于蒸馏水,稀释至稀释至1,000ml。73mol/L乙酸钠乙酸钠-0.001molEDTA-Na溶液：称取溶液：称取乙乙酸钠酸钠408g、EDTA-Na0.372g溶于蒸馏水溶于蒸馏水,稀释至稀释至1,000ml。870%乙醇、乙醇、80%乙醇、乙醇、95%乙醇、无水乙醇。乙醇、无水乙醇。9二苯胺试剂。二苯胺试剂。101mol过氯酸溶液，将过氯酸溶液，将10ml过氯酸过氯酸(70%)用蒸馏用蒸馏水稀释至水稀释至11ml。11试验材料与仪器试验材料与仪器大白鼠肝脏、匀浆器、离心机大白鼠肝脏、匀浆器、离心机5000r/min、量筒、量筒50ml(1)、25ml(1)、10ml(1)、吸管、吸管5ml(2)、水浴锅、真空干燥器。、水浴锅、真空干燥器。【试验步骤】【试验步骤】1DNA的分别纯化：的分别纯化：（1）将簇新猪肝用）将簇新猪肝用0.14mol/LNaCl-0.15molEDTA溶液洗去血液，剪碎，加入溶液洗去血液，剪碎，加入50ml0.14mol/LNaCl-0.15molEDTA溶液溶液,置匀浆器中置匀浆器中研磨研磨.待研磨成糊状后，将糊状物离心待研磨成糊状后，将糊状物离心10min(4000r/min)，弃去上清液，沉，弃去上清液，沉淀用淀用0.14mol/LNaCl-0.15molEDTA溶液洗二、三次。溶液洗二、三次。所得沉淀为脱氧核糖核蛋白制品。所得沉淀为脱氧核糖核蛋白制品。（2）向上述沉淀物加入）向上述沉淀物加入0.14mol/LNaCl-0.15molEDTA溶液，使总体积为溶液，使总体积为44ml，然后，然后滴加滴加25%SDS溶液溶液3ml，边加边搅拌。加毕，置，边加边搅拌。加毕，置60水浴保温水浴保温10min(不停搅拌不停搅拌)溶液变得粘稠并溶液变得粘稠并略透亮，取出冷至室温。此步操作略透亮，取出冷至室温。此步操作系使核酸与蛋白质分别。系使核酸与蛋白质分别。（3）加入）加入5molNaCl溶液溶液10ml，使，使NaCl最终浓度最终浓度达到达到1mol/L，搅拌，搅拌10min，加入约一倍体积的氯仿，加入约一倍体积的氯仿-异戊异戊醇混合液，振摇醇混合液，振摇20min，离心，离心10min(4000r/min)。去掉。去掉沉淀，上层清夜缓缓加入沉淀，上层清夜缓缓加入152倍倍95%乙醇，乙醇，DNA沉沉淀即析出，用玻棒渐渐搅动，则淀即析出，用玻棒渐渐搅动，则DNA丝状物即缠在玻棒丝状物即缠在玻棒上。上。（4）将）将DNA粗品置于粗品置于27ml0.15mol/LNaCl-0.0015mol/柠檬酸三钠溶液中，再加入柠檬酸三钠溶液中，再加入3ml1.5mol/LNaCl-0.0015mol/柠檬酸三钠溶液，搅匀，加入一倍体积氯仿柠檬酸三钠溶液，搅匀，加入一倍体积氯仿-异戊醇混合液，振摇异戊醇混合液，振摇10min，离心，离心(4000r/min，10min)，倾出上层液，倾出上层液(沉淀弃去沉淀弃去)，加入，加入1.5倍体积倍体积95%乙醇，乙醇，DNA即沉淀析出。离心，弃去上清液，沉淀即沉淀析出。离心，弃去上清液，沉淀(粗粗DNA）。操作步骤）。操作步骤重复处理一次。重复处理一次。（5）将上步得沉淀溶于）将上步得沉淀溶于27ml0.015mol/LNaCl-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液中，然后以线状缓缓加入柠檬酸三钠溶液中，然后以线状缓缓加入2倍倍95%乙醇，边加边搅，乙醇，边加边搅，取出丝状取出丝状DNA，依次用，依次用70%、80%、95%及无水乙醇各洗一次，真空干燥。及无水乙醇各洗一次，真空干燥。2、鉴定：用二苯胺法测定、鉴定：用二苯胺法测定DNA试验五试验五 血液中葡萄糖的测定血液中葡萄糖的测定 【试验目的】【试验目的】（1 1）理解血糖在生物体内的重要意义。）理解血糖在生物体内的重要意义。（2 2）驾驭）驾驭Folin-WuFolin-Wu法测定血糖含量的原理和方法测定血糖含量的原理和方法。法。【试验原理】【试验原理】葡萄糖是血液主要的糖类，因此测血糖含量葡萄糖是血液主要的糖类，因此测血糖含量就是测血液中葡萄糖的含量。测定血液中葡萄糖就是测血液中葡萄糖的含量。测定血液中葡萄糖的含量，即测困难组分中一种物质的量，依据生的含量，即测困难组分中一种物质的量，依据生化试验基本技术的原理，可接受分光光度法（比化试验基本技术的原理，可接受分光光度法（比色法）进行测定。色法）进行测定。血液中的葡萄糖与碱性硫酸铜溶液共热，铜血液中的葡萄糖与碱性硫酸铜溶液共热，铜离子即被血液中的葡萄糖还原成氧化亚铜，后者离子即被血液中的葡萄糖还原成氧化亚铜，后者又可使钼酸试剂还原成低价的钼蓝（蓝色）。血又可使钼酸试剂还原成低价的钼蓝（蓝色）。血糖的含量与产生的氧化亚铜成正比，氧化亚铜的糖的含量与产生的氧化亚铜成正比，氧化亚铜的量与形成的钼化合物的量成正比，可以用比色的量与形成的钼化合物的量成正比，可以用比色的方法进行测定。方法进行测定。【试验试剂与器材】【试验试剂与器材】1、标准葡萄糖溶液、标准葡萄糖溶液（1）1%（m/V）葡萄糖母液）葡萄糖母液称取葡萄糖称取葡萄糖1.0g，溶于蒸馏水中，溶于蒸馏水中，然后用然后用100ml容量瓶定容至刻度。容量瓶定容至刻度。（2）标准葡萄糖溶液）标准葡萄糖溶液用移液管吸取用移液管吸取1%葡萄糖母液葡萄糖母液1.0ml，放入，放入100ml容量瓶内，然后定容至刻度。容量瓶内，然后定容至刻度。2、碱性硫酸铜溶液（、碱性硫酸铜溶液（A、B液）液）（1）A液：称取无水碳酸钠液：称取无水碳酸钠35.0g，酒石酸钠，酒石酸钠13.0g及碳酸氢钠及碳酸氢钠11.0g，用蒸馏水溶解，然后用，用蒸馏水溶解，然后用1000ml容量瓶定容至刻度。容量瓶定容至刻度。（2）B液：称取硫酸铜液：称取硫酸铜5.0g，用蒸馏水溶解，然后用，用蒸馏水溶解，然后用100ml容量容量瓶定容至刻度，加几滴浓硫酸作为保存剂。瓶定容至刻度，加几滴浓硫酸作为保存剂。碱性硫酸铜（现配现用）。碱性硫酸铜（现配现用）。取取A液液25ml，B液液5ml，混合后，再用，混合后，再用A液定容至液定容至50ml，摇匀。该混合液在，摇匀。该混合液在4冰箱里可保存数日，假如冰箱里可保存数日，假如暴露于阳光下，数小时即失效。暴露于阳光下，数小时即失效。3、酸性钼酸盐溶液、酸性钼酸盐溶液称取钼酸钠称取钼酸钠104.6g，置烧杯中用蒸馏水溶解，倒入，置烧杯中用蒸馏水溶解，倒入500ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，然后移入另一容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，然后移入另一较大的试剂瓶中，加溴水较大的试剂瓶中，加溴水0.5ml，摇匀，静置数小时。，摇匀，静置数小时。置于置于1000ml容量瓶中，缓慢加入容量瓶中，缓慢加入85%（V/V）H3PO4225ml，边加边摇匀。再加入，边加边摇匀。再加入25%（V/V）硫酸）硫酸150ml，置暗处至次日，用空气将剩，置暗处至次日，用空气将剩余的溴赶去，加入冰乙酸余的溴赶去，加入冰乙酸75ml，摇匀，加蒸馏水稀释，摇匀，加蒸馏水稀释至至1000ml，贮存于，贮存于棕色瓶中。棕色瓶中。4、10（m/V）钨酸钠溶液）钨酸钠溶液5、0.33mol/L硫酸溶液硫酸溶液6、动物血（家兔心脏取血）、动物血（家兔心脏取血）7、分光光度计、分光光度计8、血糖管、血糖管9、奥氏吸管、奥氏吸管10、水浴锅、水浴锅11、表面皿、表面皿【试验步骤】【试验步骤】1.无蛋白血滤液的制备无蛋白血滤液的制备先在烧杯中加先在烧杯中加0.8g左右的抗凝剂（草酸钾或左右的抗凝剂（草酸钾或草酸钠），从家兔心脏取血草酸钠），从家兔心脏取血10ml放入烧杯，振放入烧杯，振荡摇匀。荡摇匀。用奥氏吸管吸取已加抗凝剂的全血用奥氏吸管吸取已加抗凝剂的全血1ml，缓缓放，缓缓放入入20ml锥形瓶中，加水锥形瓶中，加水7ml，摇匀，血液变成红，摇匀，血液变成红色透亮时加色透亮时加10钨酸钠钨酸钠1ml，摇匀，再加，摇匀，再加0.33mol/L硫酸，随加随摇，加完放置硫酸，随加随摇，加完放置515min，至沉淀由鲜红变为暗棕色，滤纸过滤。每毫升，至沉淀由鲜红变为暗棕色，滤纸过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于无蛋白血滤液相当于0.1ml全血。全血。2.血糖的测定血糖的测定取具取具25ml刻度的血糖管刻度的血糖管3只，编号，用奥氏只，编号，用奥氏吸管吸取无蛋白血滤液吸管吸取无蛋白血滤液2ml，放入第一只血糖管，放入第一只血糖管中，于其次只中，于其次只血糖管中加血糖管中加2ml标准葡萄糖溶液。第三只血糖管中加标准葡萄糖溶液。第三只血糖管中加2ml蒸馏水。然后各加蒸馏水。然后各加2ml新配置的碱性硫酸铜溶液，新配置的碱性硫酸铜溶液，同时置沸水浴内煮同时置沸水浴内煮6min，取出，在流水中快速冷却，取出，在流水中快速冷却，各加入各加入4ml酸性钼酸盐溶液，酸性钼酸盐溶液，1min后以蒸馏水稀释至后以蒸馏水稀释至25ml，混匀，倒入比色杯，用，混匀，倒入比色杯，用722型风光光度计于型风光光度计于420440nm波长比色（先以空白管调整零点，然后波长比色（先以空白管调整零点，然后测标准管和样品管）。测标准管和样品管）。3.计算计算按下式计算按下式计算100ml全血中所含的血糖质量（全血中所含的血糖质量（mg）。）。mA1C0A00.1100式中：式中：m：100ml血中所含的糖质量血中所含的糖质量C0：标准葡萄糖溶液浓度：标准葡萄糖溶液浓度A1：样品溶液吸光度：样品溶液吸光度A0：标准溶液吸光度：标准溶液吸光度【留意事项】【留意事项】1.欲得精确结果，所取血液的量必需精确。假如由吸欲得精确结果，所取血液的量必需精确。假如由吸管中放出血液的速度太快，会有大量血液粘在吸管内壁，管中放出血液的速度太快，会有大量血液粘在吸管内壁，容量不准，所以一般放出容量不准，所以一般放出1ml血液所用的时间不应少于血液所用的时间不应少于1min。2.沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸作用生成沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸作用生成钨酸，在适当酸度时，使血红蛋白变性、沉淀。如血沉钨酸，在适当酸度时，使血红蛋白变性、沉淀。如血沉淀放置后不变为棕红色或重滤后仍混浊，可在钨酸与血淀放置后不变为棕红色或重滤后仍混浊，可在钨酸与血混合液中加入混合液中加入10硫酸硫酸12滴，待变为暗棕色后滴，待变为暗棕色后再滤。再滤。3.血液中除葡萄糖外，尚有其他还原性物质，所以试验血液中除葡萄糖外，尚有其他还原性物质，所以试验结果可能偏高结果可能偏高20%30%。【思索题】【思索题】1移液管运用时应留意哪些问题移液管运用时应留意哪些问题?2全血中除了葡萄糖还有哪些还原性物质全血中除了葡萄糖还有哪些还原性物质?试验六试验六 血清中总胆固醇的测定血清中总胆固醇的测定 【试验目的】【试验目的】学习血清胆固醇的检测方法学习血清胆固醇的检测方法 。【试验原理】【试验原理】胆固醇及其酯在硫酸存在下与邻苯二胆固醇及其酯在硫酸存在下与邻苯二甲醛作用，产生紫红色物质，此物质对甲醛作用，产生紫红色物质，此物质对550nm550nm波波长的光有最大吸取，可用比色法定量测定。长的光有最大吸取，可用比色法定量测定。100ml100ml样品中胆固醇含量在样品中胆固醇含量在400mg400mg之内与吸光度呈之内与吸光度呈良好线性关系。良好线性关系。【试验试剂与器材】【试验试剂与器材】1、邻苯二甲醛试剂、邻苯二甲醛试剂2、90%醋酸醋酸3、混合酸、混合酸4、标准胆固醇贮液（、标准胆固醇贮液（1mg/ml）5、标准胆固醇应用液（、标准胆固醇应用液（0.1mg/ml）6、人血清、人血清7、试管、试管8、吸管、吸管9、容量瓶、容量瓶10、烧杯、烧杯11、电子分析天平、电子分析天平12、722型（或型（或7220型）分光光度计型）分光光度计【试验步骤】【试验步骤】1、标准曲线的绘制、标准曲线的绘制取清洁干燥试管取清洁干燥试管5支，编号，按表加入试剂。支，编号，按表加入试剂。加毕，混匀，静置加毕，混匀，静置10min，以，以550nm波长比色测波长比色测定，以吸光度值为纵坐标，胆固醇含量为横坐标，定，以吸光度值为纵坐标，胆固醇含量为横坐标，做标准曲线。做标准曲线。管号管号试剂试剂01234标准胆固醇应用液标准胆固醇应用液/ml00.10.20.30.4醋酸醋酸/ml0.40.30.20.10邻苯二甲醛试剂邻苯二甲醛试剂/ml0.20.20.20.20.2蒸馏水蒸馏水/ml0.010.010.010.010.01混合酸混合酸/ml4.04.04.04.04.0100ml样品中总胆固醇含量样品中总胆固醇含量/m