蛋白质分离纯化.ppt

2.6 2.6 蛋白质的分离、纯化蛋白质的分离、纯化l研究蛋白质的结构、性质和功能，首研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。先需要得到纯的蛋白质样品。l(1)(1)蛋白质来源：微生物细胞、动物蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；细胞和植物细胞；l(2)(2)随时测定蛋白质活性并检测蛋白随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。质含量。l(3)(3)分离和纯化过程都必须在温和的分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。条件下进行。一、蛋白质分离纯化的一般原则一、蛋白质分离纯化的一般原则l(1)(1)生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨法、超生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等。声波法、冻融法和酶解法等。l(2)(2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。l水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用稀碱水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。l(3)(3)粗提粗提:离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。l(4)(4)精制：可用层析法、电泳法等进行精制。精制：可用层析法、电泳法等进行精制。l(5)(5)成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。蛋白质的分离步骤蛋白质的分离步骤四、蛋白质的纯化方法四、蛋白质的纯化方法l根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境发生改变时，蛋白质会发生沉淀作用发生改变时，蛋白质会发生沉淀作用(Precipitation)。l因为蛋白质分子量大小不同、表面所代因为蛋白质分子量大小不同、表面所代电荷不同、表面的亲水和疏水区域不同，电荷不同、表面的亲水和疏水区域不同，所以可以通过可逆沉淀法将蛋白质分离所以可以通过可逆沉淀法将蛋白质分离出来。出来。l沉淀法具有部分纯化、浓缩特点。沉淀法具有部分纯化、浓缩特点。蛋白质的纯化方法 蛋白质的纯化方法l蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水化层被破坏和表面电荷被中和，容易发生化层被破坏和表面电荷被中和，容易发生沉淀沉淀l阴离子化合物的效果是：阴离子化合物的效果是：NHNH4 4+KK+NaNa+l阳离子化合物的效果是：阳离子化合物的效果是：POPO4 43-3-SOSO4 42-2-ClCl-l常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由于所常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不同，盐析时所需的带的电荷和水化程度不同，盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以将不同的蛋盐的浓度也不相同，因而可以将不同的蛋白质加以分离。白质加以分离。盐析盐析 蛋白质的纯化方法l在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水的亲和力的有机溶剂，由于这些溶剂与水的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化层，使蛋白质强，能够破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。的溶解度降低而沉淀。l常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等。常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等。为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，有机溶剂浓度不能太高有机溶剂浓度不能太高(30%-50%)(30%-50%)，而且，而且需要在低温条件下进行。需要在低温条件下进行。l5 5，2525乙醇沉淀卵清蛋白。乙醇沉淀卵清蛋白。有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 蛋白质的纯化方法l蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，分蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。形成沉淀。l当蛋白质混合物溶液的当蛋白质混合物溶液的pH pH 被调到某一成分被调到某一成分的等电点时，则该蛋白质大部或全部将沉的等电点时，则该蛋白质大部或全部将沉淀出来。而那些等电点高于或低于该淀出来。而那些等电点高于或低于该pH pH 的的蛋白质仍然留在溶液中。蛋白质仍然留在溶液中。l该法适用于在等电点该法适用于在等电点pHpH稳定的蛋白质。稳定的蛋白质。等电点沉淀法等电点沉淀法 蛋白质的纯化方法lDialysisDialysis此法是利用蛋白质分子不能透过半透此法是利用蛋白质分子不能透过半透膜，而使它与其它小分子化合物，如无机盐、膜，而使它与其它小分子化合物，如无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽以及表面活性剂等单糖、双糖、氨基酸、小肽以及表面活性剂等分离。分离。l常用的半透膜有玻璃纸或高分子合成材料，截常用的半透膜有玻璃纸或高分子合成材料，截止分子量一般为一万。止分子量一般为一万。透析法透析法 蛋白质的纯化方法l透析是将待纯化的蛋白质溶液装在用半透膜制透析是将待纯化的蛋白质溶液装在用半透膜制成的透析袋内，再将透析袋放入透析液（通常成的透析袋内，再将透析袋放入透析液（通常是蒸馏水或缓冲液）中进行透析。是蒸馏水或缓冲液）中进行透析。l通透动力为半透膜两侧的物质浓度差。通透动力为半透膜两侧的物质浓度差。透析法透析法 蛋白质的纯化方法l超过滤技术是在一定的密封容器，施加超过滤技术是在一定的密封容器，施加一定压力使一定分子量的物质透过超滤一定压力使一定分子量的物质透过超滤膜。膜。l其中包括有：中空纤维超滤器、圆筒式其中包括有：中空纤维超滤器、圆筒式超滤器板式超滤器。超滤器板式超滤器。超过滤法超过滤法 蛋白质的纯化方法离子交换层析法离子交换层析法 蛋白质的纯化方法l此法又称为分子筛层析（此法又称为分子筛层析（gel-filtration gel-filtration chromatographychromatography）。凝胶过滤所用的介质是由。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。lSephadex-Sephadex-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G10-G200G10-G200lSepharose-Sepharose-琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶2 2B,4B,6BB,4B,6BlSephacryl-Sephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶丙烯酰胺葡聚糖凝胶S100,S200,S300,S400S100,S200,S300,S400凝胶过滤法凝胶过滤法分子筛层析（gel-filtration chromatography）原理原理基质基质 葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（sephadex）琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（sepharose）应用应用 测定分子量测定分子量:lgMr=a-bVe 脱盐和浓缩脱盐和浓缩 分离提纯生物大分子分离提纯生物大分子 l这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理是不这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上的特殊配基同的蛋白质分子对于固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。具有不同的识别和结合能力。l选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价连配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价连接。将这种连接有配基的载体装入层析柱中。接。将这种连接有配基的载体装入层析柱中。l当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。被特异性结合在上，而其它蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。脱。亲和层析法亲和层析法亲和层析（affinity chromatography）应用应用 分离纯化酶、分离纯化酶、抗原、抗体抗原、抗体 分离纯化核酸分离纯化核酸 研究酶的结构与功能研究酶的结构与功能+待纯化分子待纯化分子配体配体a.待纯化分子和配体间具有亲和性待纯化分子和配体间具有亲和性+基质基质b.活性基质与配体结合产生亲和吸附剂活性基质与配体结合产生亲和吸附剂+杂质杂质c.待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d.偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子原理：原理：基质基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、sepharose、sephadex 蛋白质的纯化方法l在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。蛋白质相反的电极移动，这种现象称为电泳。蛋白质溶液的溶液的pHpH值不等于等电点时，蛋白质颗粒均带值不等于等电点时，蛋白质颗粒均带有不同的电荷。由于不同蛋白质的分子量不同，有不同的电荷。由于不同蛋白质的分子量不同，所带的电荷不同，因而在电场中移动的速度也所带的电荷不同，因而在电场中移动的速度也不相同。不相同。l在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在电场在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（中移动的速度（v v）取决于电场强度）取决于电场强度(E)(E)，所带，所带的净电荷的净电荷(q)(q)以及与介质的摩擦系数以及与介质的摩擦系数(f)(f)。蛋白质的纯化方法lSDSSDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面活（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约大约1 1 2 2比例结合。比例结合。l这样，每一个蛋白质分子都因为结合了许多的这样，每一个蛋白质分子都因为结合了许多的SDSSDS而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的电荷则可以忽略。由于所有的蛋白质颗粒都带有电荷则可以忽略。由于所有的蛋白质颗粒都带有大量的负电荷，而且它们的电荷密度也大体相同，大量的负电荷，而且它们的电荷密度也大体相同，因此，因此，E E q q值接近一个常数。所以该法主要利用值接近一个常数。所以该法主要利用了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白质。了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白质。l用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出不同蛋白质的分子量。不同蛋白质的分子量。SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法离心技术离心技术1离心机类别离心机类别 普通离心机普通离心机 6000转转/分分 高速离心机高速离心机 2-3万转万转/分分 超速离心机超速离心机 3万转万转/分分2沉降系数（沉降系数（S）概念）概念沉降系数（沉降系数（S）生生物物大大分分子子在在单单位位离离心心力力场场作作用用下下的的沉沉降降速速度度称称为为沉沉降降系系数数。即即沉沉降降系系数数是是微微颗颗粒粒在在离离心心力力场场的的作作用用下下，从从静静止止状状态态到到达达极极限限速速度度所所需需要要的的时时间间。其其单单位位用用SvedbergSvedberg，即，即S S表示，表示，S=110S=110-13-13秒。秒。沉降系数（沉降系数（S S）与分子量（）与分子量（M M）的关系）的关系M=RTSD(1-)Svederg方程方程:五、蛋白质含量的测定l定氮法：灵敏度较低定氮法：灵敏度较低lFolin-LowryFolin-Lowry法：在碱性条件下磷钼酸、磷钨法：在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反应，生成蓝酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反应，生成蓝色化合物，将其与双羧脲法结合起来，蛋白质色化合物，将其与双羧脲法结合起来，蛋白质形成两种颜色的混合物老绿色，在形成两种颜色的混合物老绿色，在650nm650nm具有具有特定的吸收。灵敏度较高特定的吸收。灵敏度较高2525 g-250g-250 g/ml.g/ml.考马斯亮蓝法（考马斯亮蓝法（BradfordBradford法）法）考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250G250是一种带有负电荷的染料，是一种带有负电荷的染料，在酸性条件下，可与蛋白质上的正电荷结合，在酸性条件下，可与蛋白质上的正电荷结合，形成蓝色化合物，在形成蓝色化合物，在595595nmnm具有特定吸收，反具有特定吸收，反应简便、快速、灵敏度高，应简便、快速、灵敏度高，5-50 5-50 g/mlg/ml。l紫外吸收法紫外吸收法l由于核酸在由于核酸在260nm260nm具有光吸收，对测定干扰较具有光吸收，对测定干扰较大，可采用大，可采用280280nmnm、260nm260nm同测法。同测法。l蛋白质浓度蛋白质浓度蛋白质纯度等的测定l纯度和分子量的测定：采用电泳（如聚丙烯酰纯度和分子量的测定：采用电泳（如聚丙烯酰胺凝胶电泳，梯度凝胶电泳等）、高速离心、胺凝胶电泳，梯度凝胶电泳等）、高速离心、分子筛层析、高效液相色谱等技术测定。分子筛层析、高效液相色谱等技术测定。l等电点的测定：利用等电聚焦方法测定。等电点的测定：利用等电聚焦方法测定。l亚基个数的测定：采用亚基个数的测定：采用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定。泳方法测定。