14内药物分析法.pptx

第七章第七章 内药物分析法内药物分析法药物的体内过程：药物的体内过程：研究生物体中药物代谢及其研究生物体中药物代谢及其代谢物代谢物和和内源性物质内源性物质的质和量变化规律的分析的质和量变化规律的分析方法学。方法学。给药给药吸收吸收分布分布代谢代谢排泄排泄 第一节第一节 体内样品种类体内样品种类体内样品：体内样品：各种体液和组织。主要包各种体液和组织。主要包括血液、尿液、唾液。最为常用的样括血液、尿液、唾液。最为常用的样本是血液。本是血液。采集时间：采集时间：根据临床治疗药物监测的根据临床治疗药物监测的不同目的确定。不同目的确定。目的目的取样时间取样时间确定、调整用药方案确定、调整用药方案用药稳态后用药稳态后临床治疗药物检测临床治疗药物检测用药稳态后用药稳态后急性药物中毒诊断急性药物中毒诊断用药后立即用药后立即药动学、药效学药动学、药效学给药前、给药后多给药前、给药后多时间点时间点一一.血样（血样（全血全血-Wholeblood,血浆血浆-Plasma,血清血清-Serum）1.血样采集：患者（静脉），动物实验血样采集：患者（静脉），动物实验（动脉、心脏）。（动脉、心脏）。2.全血采集：采集后放置于含抗凝剂全血采集：采集后放置于含抗凝剂（肝素肝素、乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸EDTA、草酸盐草酸盐、枸缘酸盐枸缘酸盐）的试管中，混合均匀即得。）的试管中，混合均匀即得。3.血浆血浆的制备：的制备：全血全血抗凝剂试管抗凝剂试管混混合合1000 xg力力离心离心5100min上清上清液液即为血浆。即为血浆。4.血清的制备：全血血清的制备：全血室温室温放置放置0.51h凝固出现血饼凝固出现血饼600 xg力力离心离心510min上清液上清液即为血清。即为血清。5.注意事项注意事项血样采集后应及时分离血样采集后应及时分离血浆血浆和和血清血清，最好最好立即分析立即分析。全血：血液于抗凝管中，冷冻储存或全血：血液于抗凝管中，冷冻储存或直接分析。短期直接分析。短期4，长期，长期-20或或-80保存。保存。二二.尿样尿样1.尿液测定用途：药物剂量回收研究、尿液测定用途：药物剂量回收研究、药物尿清除率、生物利用度、判断患药物尿清除率、生物利用度、判断患者用药是否遵医嘱、者用药是否遵医嘱、预测药物的代谢预测药物的代谢过程和代谢类型过程和代谢类型。2.尿药浓度尿药浓度改变不直接反映改变不直接反映血药浓度血药浓度，受试者肾功能将影响药物的排泄，所受试者肾功能将影响药物的排泄，所以尿液样品的采集和测定应当与肾功以尿液样品的采集和测定应当与肾功能指标进行关联分析。能指标进行关联分析。3.尿液的尿液的分类分类：随时尿、晨尿、白天尿、：随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿、时间尿。夜间尿、时间尿。4.尿液的采集（尿液的采集（自然排尿自然排尿）：）：测定尿液中药物浓度时应采用测定尿液中药物浓度时应采用时间尿时间尿。测定尿液中药物的总量时，应收集用测定尿液中药物的总量时，应收集用药后一定时间内的药后一定时间内的全部尿液全部尿液，进行分，进行分析。析。5.尿液的处理方法：尿液的处理方法：处理：采集后应立即测定。处理：采集后应立即测定。保存：低温保存，或加入保存：低温保存，或加入防腐剂防腐剂（盐（盐酸、二甲苯、三氯甲烷等）酸、二甲苯、三氯甲烷等）。三三.唾液唾液1.唾液：腮腺、颌下腺、舌下腺和口腔唾液：腮腺、颌下腺、舌下腺和口腔黏膜腺体分泌的黏液在口腔里混合而黏膜腺体分泌的黏液在口腔里混合而成的成的消化液消化液。2.采集：安静状态，采集：安静状态，漱口漱口后后15min进行，进行，采集时间为采集时间为10min，采用一些物理或，采用一些物理或化学方法刺激唾液分泌。化学方法刺激唾液分泌。3.保存与处理：取样后，保存与处理：取样后，除去泡沫除去泡沫，用，用1000 xg力力离心离心10min，取，取上清液上清液，冻，冻存或直接分析。唾液采集后在存或直接分析。唾液采集后在4下保下保存，往往需要在取样时存，往往需要在取样时测定测定pH值。值。第二节第二节 体内样品处理体内样品处理目的：不破坏测定成分的前提下，用目的：不破坏测定成分的前提下，用适当的方法适当的方法分离纯化或浓缩待测药物分离纯化或浓缩待测药物，以减少干扰、提高检测灵敏度和特异以减少干扰、提高检测灵敏度和特异性、降低对仪器的污染和损害。性、降低对仪器的污染和损害。常用方法：常用方法：去除蛋白质法去除蛋白质法缀合物水解法缀合物水解法分离纯化与浓集法分离纯化与浓集法化学衍生化法化学衍生化法影响因素：影响因素：样品种类样品种类、被测药物的性被测药物的性质质、浓度浓度、测定方法的选择测定方法的选择。样品种类：如血浆或血清需要清除蛋样品种类：如血浆或血清需要清除蛋白，使药物从蛋白结合物中释出；尿白，使药物从蛋白结合物中释出；尿液样品则常采用酸或酶水解使药物从液样品则常采用酸或酶水解使药物从缀合物中释出；唾液样品主要采用离缀合物中释出；唾液样品主要采用离心去除黏蛋白沉淀。心去除黏蛋白沉淀。测定方法：测定方法的耐受污染程度测定方法：测定方法的耐受污染程度和抗干扰能力越强、专属性越好、灵和抗干扰能力越强、专属性越好、灵敏度越高，则对前处理的要求越低。敏度越高，则对前处理的要求越低。一一.去除蛋白法：去除蛋白法：蛋白沉淀法蛋白沉淀法和和蛋白分解蛋白分解法法1.蛋白沉淀法：加入有机溶剂、强酸和蛋白沉淀法：加入有机溶剂、强酸和无机盐无机盐加入与水混溶的有机溶剂加入与水混溶的有机溶剂原理原理:水溶性的有机溶剂可使蛋白质分水溶性的有机溶剂可使蛋白质分子内及分子间的子内及分子间的氢键变化氢键变化，使蛋白质使蛋白质凝聚凝聚，进而使与之结合的药物释放。，进而使与之结合的药物释放。常用有机溶剂常用有机溶剂:乙腈、甲醇、乙醇、丙乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃醇、丙酮、四氢呋喃体积比：体积比：1：13,90去除去除方法：超速离心（方法：超速离心（10000r/min）实例实例:乙腈乙腈沉淀蛋白质为沉淀蛋白质为絮状絮状，易于离，易于离心去除；心去除；甲醇甲醇沉淀蛋白则为沉淀蛋白则为细小颗粒细小颗粒状状，需高速离心去除。使用乙腈或甲，需高速离心去除。使用乙腈或甲醇时上清液醇时上清液pH为为8.59.5，使用丙酮，使用丙酮时上清液时上清液pH为为910。加入强酸加入强酸原理：当溶液原理：当溶液pH低于低于蛋白质的蛋白质的等电等电点点时，蛋白质以时，蛋白质以阳离子阳离子形式存在，可形式存在，可与酸根阴离子形成与酸根阴离子形成不溶性盐不溶性盐而沉淀。而沉淀。常用强酸：常用强酸：10三氯醋酸、三氯醋酸、6高氯高氯酸、硫酸钨酸混合液、酸、硫酸钨酸混合液、5偏磷酸偏磷酸体积比：体积比：1：0.4，90去除去除所得上清液呈强酸性（所得上清液呈强酸性（pH04）。）。加入无机盐加入无机盐原理：加入无机盐后，溶液的原理：加入无机盐后，溶液的离子强离子强度度发生变化，发生变化，抑制蛋白质解离抑制蛋白质解离，无机，无机盐具有比蛋白质更强的盐具有比蛋白质更强的亲水性和电解亲水性和电解能力能力，使蛋白质，使蛋白质盐析脱水盐析脱水而沉淀。而沉淀。常用中性盐：饱和硫酸铵、硫酸钠、常用中性盐：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐、枸橼酸盐镁盐、磷酸盐、枸橼酸盐比例：比例：1：2混合混合，90去除去除方法：超速离心（方法：超速离心（10000r/min）所得上清液近中性，所得上清液近中性，pH为为7.07.7。2.蛋白分解法蛋白分解法原理：在测定某些与蛋白结合牢固、原理：在测定某些与蛋白结合牢固、且对酸不稳定的药物时，常需用且对酸不稳定的药物时，常需用酶解酶解法法使蛋白分解而释放出药物。使蛋白分解而释放出药物。枯草菌溶素枯草菌溶素不仅可使组织酶解，且可不仅可使组织酶解，且可使药物析出。使药物析出。应用：主要用于脏器组织中药物的测应用：主要用于脏器组织中药物的测定。定。二二.缀合物水解法：缀合物水解法：酸水解法和酶水解法酸水解法和酶水解法1.酸水解法酸水解法：使用无机酸如盐酸、磷酸：使用无机酸如盐酸、磷酸特点：简单、快速、专属性差特点：简单、快速、专属性差2.酶水解法酶水解法：常用：常用葡萄糖酸酐酶或硫酸葡萄糖酸酐酶或硫酸酯酶酯酶，或者二者的混合物，或者二者的混合物用时应按不同酶的要求控制条件、用时应按不同酶的要求控制条件、PH值在值在4.5-7.0，37培育数十小时，进培育数十小时，进行水解。行水解。如果如果尿液尿液在采用酶水解，应先除去尿在采用酶水解，应先除去尿中能抵制酶的中能抵制酶的阳离子阳离子。特点：特点：高选择性高选择性，专属性强专属性强，低降解低降解性性，酶水解比酸水解温和，一般不会，酶水解比酸水解温和，一般不会引起被测物分解，引起被测物分解，缺点：水解时间稍长，费用大，酶制缺点：水解时间稍长，费用大，酶制剂可能引进粘液蛋白，易引起乳化或剂可能引进粘液蛋白，易引起乳化或色谱柱阻塞。色谱柱阻塞。应用范围：应用范围：遇酸及受热不稳定的药物遇酸及受热不稳定的药物三三.分离纯化与浓集法：分离纯化与浓集法：萃取法萃取法1.液液-液提取法（液提取法（LLE）关键要考虑三个方面的因素：关键要考虑三个方面的因素：有机溶剂的特性有机溶剂的特性有机溶剂相和水相的体积有机溶剂相和水相的体积水相的水相的pH值值优点：简单，选择性好，去除内源性优点：简单，选择性好，去除内源性物质干扰能力强，应用广泛。物质干扰能力强，应用广泛。2.固相萃取（固相萃取（SPE）原理：将具有原理：将具有吸附吸附、分配分配或或离子离子交换交换性质的大比表面积吸附填料作为萃取性质的大比表面积吸附填料作为萃取剂填成小柱，剂填成小柱，柱色谱分离方法柱色谱分离方法。决定因素：药物与固定相表面的决定因素：药物与固定相表面的活性活性基团基团、药物与溶剂分子间的、药物与溶剂分子间的分子间作分子间作用力用力。优点优点：引入的杂质少；可以完全避免：引入的杂质少；可以完全避免乳化的形成；有较高的萃取回收率，乳化的形成；有较高的萃取回收率，重现性好；小柱可弃，没有污染；需重现性好；小柱可弃，没有污染；需要的样品量少；洗脱溶剂多为水溶性要的样品量少；洗脱溶剂多为水溶性的，易于实现自动。的，易于实现自动。缺点缺点：价格昂贵，技术要求高，小柱：价格昂贵，技术要求高，小柱各批之间有差异，柱子容易堵塞，影各批之间有差异，柱子容易堵塞，影响分离效果。响分离效果。四四.化学衍生化法化学衍生化法1.目的：目的：改变待测药物的色谱行为；增改变待测药物的色谱行为；增强药物的稳定性；改善（手性拆分）强药物的稳定性；改善（手性拆分）分离能力；提高检测灵敏度。分离能力；提高检测灵敏度。2.GC法法硅烷化法（应用最广）硅烷化法（应用最广）硅烷化硅烷化：与葡萄糖醛酸结合的药物：与葡萄糖醛酸结合的药物烷基化烷基化：有活性氢原子的药物：有活性氢原子的药物酰化酰化：具有：具有-NH2、-OH的药物的药物3.HPLC法法柱前衍生化法、柱后衍柱前衍生化法、柱后衍生化法生化法柱前衍生化法柱前衍生化法：分离前使药物与衍生：分离前使药物与衍生化试剂发生反应。化试剂发生反应。柱后衍生化法柱后衍生化法：药物经色谱分离后在：药物经色谱分离后在流出液中进行衍生化。一般用紫外检流出液中进行衍生化。一般用紫外检测器测器 第三节第三节 体内样品的测定体内样品的测定一一.体内样品测定的常用方法体内样品测定的常用方法免疫分析法免疫分析法:色谱分析法色谱分析法:测定方法测定方法免疫分析法免疫分析法色谱分析法色谱分析法灵敏度灵敏度+专属性专属性+适用范围适用范围临床治疗药临床治疗药物监测物监测药代动力学药代动力学研究研究1.免疫分析法免疫分析法(Immunoassay，IA)原理：原理：特异性抗原特异性抗原-抗体反应抗体反应为基础为基础应用：应用：测定生物利用度和药物代谢动力学参测定生物利用度和药物代谢动力学参数等重要数据。数等重要数据。监测药物血液浓度。监测药物血液浓度。快速测定有效组分的含量。快速测定有效组分的含量。对药品中是否存在特定的微量有害杂对药品中是否存在特定的微量有害杂质进行评价。质进行评价。2.色谱分析法：色谱分析法：GC/HPLC/GC-MS二二.定量分析方法验证定量分析方法验证1.体内样品定量分析方法验证的指标：体内样品定量分析方法验证的指标：特异性特异性标准曲线与线性范围标准曲线与线性范围定量下限定量下限精密度与准确度精密度与准确度样品稳定性样品稳定性提取回收率提取回收率质控样品与质量控制质控样品与质量控制2.特异性特异性定义：必须证明所测定的物质是定义：必须证明所测定的物质是原型原型药物药物或者或者特定活性代谢物特定活性代谢物。要求：要求：6 6个不同来源的空白体内样品个不同来源的空白体内样品色谱图、空白体内样品外加标准物质色谱图、空白体内样品外加标准物质色谱图以及用药后的体内样品色谱图。色谱图以及用药后的体内样品色谱图。3.标准曲线（标准曲线（standardcurve）定义：生物样品中所测定药物浓度与定义：生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性（响应的相关性（比例的程度比例的程度）要求：要求：至少至少6个浓度建立标准曲线个浓度建立标准曲线应使用与待测样品相同的生物介质应使用与待测样品相同的生物介质通常用通常用线性回归方程线性回归方程来评价来评价4.线性范围（线性范围（linearrang）定义：标准曲线的定义：标准曲线的最高与最低浓度的最高与最低浓度的区间区间要求：要求：至少含至少含6个浓度点个浓度点(不包括空白点不包括空白点)可覆盖可覆盖全部全部待测生物样品中的待测生物样品中的药物浓药物浓度度偏差偏差%（回归值标示值）标示（回归值标示值）标示值值100%5.定量下限定量下限定义：标准曲线上的定义：标准曲线上的最低浓度点最低浓度点要求：要求：S/N应大于应大于5满足测定满足测定35个消除半衰期后生物样个消除半衰期后生物样品中的药物浓度是品中的药物浓度是Cmax的的105至少至少5个标准样品测试结果证明。个标准样品测试结果证明。6.精密度与准确度精密度与准确度样品选择：样品选择：3个浓度，低浓度为定量个浓度，低浓度为定量下限下限3倍以内，高浓度接近标准曲线倍以内，高浓度接近标准曲线的上限附近，中间选一个浓度。每一的上限附近，中间选一个浓度。每一浓度每批至少测定浓度每批至少测定5个样品。个样品。精密度：批内、批间精密度。精密度：批内、批间精密度。RSD15%，最低定量限附近，最低定量限附近20%。准确度：相对回收率表示。准确度：相对回收率表示。在在85115%，最低定量限附近在，最低定量限附近在80120%。7.样品稳定性样品稳定性定义：一种分析物在确定条件下，一定义：一种分析物在确定条件下，一定时间内在一定介质中的定时间内在一定介质中的化学稳定性化学稳定性。要求：对含药生物样品再要求：对含药生物样品再室温、冷冻室温、冷冻或冻融条件下以及不同存放时间或冻融条件下以及不同存放时间进行进行稳定性考察。稳定性考察。8.提取回收率提取回收率定义：反映出样品预处理过程中定义：反映出样品预处理过程中组分组分丢失丢失的情况，是评价萃取的情况，是评价萃取方案优劣方案优劣的的指标之一，以样品提取和处理过程前指标之一，以样品提取和处理过程前后分析物含量百分比表示。后分析物含量百分比表示。要求：考察高、中、低要求：考察高、中、低3个浓度的提个浓度的提取回收率，其值一般取回收率，其值一般低于低于100%（可（可能低至能低至60%），但重要的是），但重要的是重现性好重现性好。9.质控样品：将已知量的待测药物加入质控样品：将已知量的待测药物加入到生物介质中配制的样品，用于质量到生物介质中配制的样品，用于质量控制。控制。10.质量控制：每个分析批均应建立相应质量控制：每个分析批均应建立相应标准曲线标准曲线，并随行测定高、中、低，并随行测定高、中、低3个浓度的质控样品。个浓度的质控样品。要求：要求：6个个QC样品中至少样品中至少4个的测定个的测定结果的准确度在各自正常浓度结果的准确度在各自正常浓度80120，RSD20%，允许由，允许由2个个QC样品超出各自的样品超出各自的20。三三.应用应用1.治疗药物监测（治疗药物监测（TherapeuticDrugMonitoring,TDM）监测对象：治疗安全浓度范围窄、治疗监测对象：治疗安全浓度范围窄、治疗剂量与中毒剂量相近、毒副作用强、剂量与中毒剂量相近、毒副作用强、具有非线性药代动力学特征、长期使具有非线性药代动力学特征、长期使用药效和毒性不明确、以及联合用药用药效和毒性不明确、以及联合用药可能发生相互作用的药物。可能发生相互作用的药物。2.在药代动力学研究中的应用在药代动力学研究中的应用例如：地高辛的药代动力学研究，以毛例如：地高辛的药代动力学研究，以毛地黄毒苷为内标，用地黄毒苷为内标，用LC-MS测定人血测定人血浆和尿液中地高辛浓度。浆和尿液中地高辛浓度。本章小结本章小结1.1.体内样品种类：体内样品种类：血样、尿样和唾液的血样、尿样和唾液的采集和处理方法采集和处理方法。2.2.体内样品处理的常用方法：体内样品处理的常用方法：去除蛋白去除蛋白质法、缀合物水解法、萃取分离法、质法、缀合物水解法、萃取分离法、化学衍生化法的基本原理、优缺点和化学衍生化法的基本原理、优缺点和应用范围应用范围。3.3.体内样品测定：体内样品测定：常用方法的基本原理、常用方法的基本原理、验证指标以应用验证指标以应用。习题习题1.TDM的意思是指（的意思是指（）A、临床监护、临床监护B、种药物代谢酶、种药物代谢酶C、相对标准差、相对标准差D、治疗药物监、治疗药物监2.从机体采集的血液加抗凝剂经离心后从机体采集的血液加抗凝剂经离心后得到的上层清液称为（得到的上层清液称为（）A、血浆、血浆B、血清、血清C、血球、血球D、血样、血样3.血样的长期冷冻贮存是指（血样的长期冷冻贮存是指（）A、48B、-20以下以下C、-18以下以下D、044.表示生物介质中药物最低可测浓度的表示生物介质中药物最低可测浓度的是（是（）A、线性范围、线性范围B、定量下限、定量下限C、检测限、检测限D、可信限、可信限5.尿样的采集一般为（尿样的采集一般为（）A、服药后、服药后8hB、服药后、服药后212hC、服药后、服药后24hD、服药后一定时间内总量、服药后一定时间内总量第七章完第七章完