催化反应动力学多底物.ppt

酶酶 学学彭益强彭益强 Enzymology国国 立立 华华 侨侨 大大 学学 生生 物物 工工 程程 与与 技技 术术 系系第一页，编辑于星期五：二点 二十三分。第一节第一节 单底物反应动力学单底物反应动力学第二节第二节 抑制作用动力学抑制作用动力学第三节第三节 多底物反应动力学多底物反应动力学第四节第四节 别构酶动力学别构酶动力学第五节第五节 pH和温度对酶催化反应速度的影响和温度对酶催化反应速度的影响主要内容主要内容第四章第四章 酶催化反应动力学酶催化反应动力学第二页，编辑于星期五：二点 二十三分。第三节第三节 多底物动力学多底物动力学大多数酶促反应是多底物反应大多数酶促反应是多底物反应,其动力学机理复杂。其动力学机理复杂。第三页，编辑于星期五：二点 二十三分。一、酶促反应分类一、酶促反应分类底物数目底物数目酶分类酶分类催化反应催化反应比例（比例（%）单底物单底物单向单底物单向单底物假单底物假单底物双底物双底物三底物三底物异构酶异构酶裂合酶裂合酶水解酶水解酶氧化还原酶氧化还原酶基团转移酶基团转移酶连接酶连接酶 略略 5 12 26 27 24 6第四页，编辑于星期五：二点 二十三分。大多数酶催化反应是两个或多个底物参与的反应大多数酶催化反应是两个或多个底物参与的反应(以双底物反应物系统为例讨论以双底物反应物系统为例讨论),),以转移反应为主以转移反应为主,占总酶促反应的占总酶促反应的50%50%左右；左右；真正的单底物反应只有真正的单底物反应只有异构反应异构反应(异构酶催化的反应异构酶催化的反应),),只占总酶促反应的只占总酶促反应的5%,5%,将单向的单底物反应将单向的单底物反应(裂合酶反裂合酶反应应)计算在内计算在内,也不超也不超20%20%；第五页，编辑于星期五：二点 二十三分。二、多底物的命名、表示方法二、多底物的命名、表示方法l以双底物双产物例以双底物双产物例:l（1 1）底物按与酶结合次序分）底物按与酶结合次序分A A、B B、C C、D D；l（2 2）产物按脱离次序分）产物按脱离次序分P P、Q Q、R R、S S；l（3 3）抑制剂）抑制剂I I；l（4 4）中间产物分稳态和过渡态（非）中间产物分稳态和过渡态（非/中心过渡态）；中心过渡态）；l稳态稳态:酶与底物共价结合酶与底物共价结合,可与另一底物发生双分子反应可与另一底物发生双分子反应;l过渡态过渡态:(:(1)1)酶活中心未完全占据酶活中心未完全占据;(2);(2)酶活中心已完全占据酶活中心已完全占据.l（5 5）稳态中间物用）稳态中间物用E E、F F、G G表示，过渡态用表示，过渡态用EAEA、EBEB、EABEAB表示，通表示，通常只假定存在着一种中心过渡态中间物（常只假定存在着一种中心过渡态中间物（EA EPEA EP）表示其异）表示其异构化构化（一）（一）Cleland命名和表示方法命名和表示方法第六页，编辑于星期五：二点 二十三分。Cleland命名和表示方法命名和表示方法（6 6）单（）单（Uni),Uni),双（双（Bi),Bi),三（三（Tri),Tri),四（四（Quad)Quad)等表示等表示l如，如，BiBi:BiBi:双底物双产物；双底物双产物；UniBi:UniBi:单底物双产物。单底物双产物。l按反应动力学分：按反应动力学分：l有序：指所有底物与酶结合必须在任何产物释放之前！有序：指所有底物与酶结合必须在任何产物释放之前！l（1 1）序列有序：酶与底物结合严格按一定顺序进行；）序列有序：酶与底物结合严格按一定顺序进行；l（2 2）序列随机：底物与酶结合顺序随意；）序列随机：底物与酶结合顺序随意；l乒乓：一部分底物与酶结合后即释放一部分产物再结合另一部乒乓：一部分底物与酶结合后即释放一部分产物再结合另一部分底物再释放一部分产物！分底物再释放一部分产物！（7 7）酶促反应历程用直线表示（除随机）酶促反应历程用直线表示（除随机）（8 8）随机机制用菱形表示；）随机机制用菱形表示；（9 9）KmKm表示米氏常数，表示米氏常数，KiKi表示抑制常数。表示抑制常数。第七页，编辑于星期五：二点 二十三分。（二）多底物反应动力学分类（二）多底物反应动力学分类本节主要讨论本节主要讨论BiBiBiBi反应；反应；按反应方式历程按反应方式历程(是否形成三元络合物是否形成三元络合物)分为分为两大类两大类:（序列与乒乓）（序列与乒乓）1、形成三元络合物、形成三元络合物（1）序列有序机制）序列有序机制（2）序列随机机制）序列随机机制第八页，编辑于星期五：二点 二十三分。底物与酶结合有一定严格顺序，先底物与酶结合有一定严格顺序，先A A后后B,B,产物产物释放也有同样规定次序，先释放也有同样规定次序，先P P（B B产物）后产物）后Q Q（A A产物）产物）.以以NADNAD+、NADPNADP+为辅酶的脱氢酶为辅酶的脱氢酶为此类机制；为此类机制；例：例：NADNAD+CH+CH3 3CHCH2 2OH CHOH CH3 3CHO+NADH+HCHO+NADH+H+（A A）（B B）（P P）（Q Q）（1）序列有序反应）序列有序反应cleland表示法表示法第九页，编辑于星期五：二点 二十三分。说明说明l（1 1）中心过渡态）中心过渡态EABEAB可转变为可转变为EPQEPQ，也可直接分解为产，也可直接分解为产物，或此中间物有一系列推导出的方程一样；物，或此中间物有一系列推导出的方程一样；l（2 2）若酶本身发生异构化，则为异型序列）若酶本身发生异构化，则为异型序列BiBiBiBi，推导出，推导出的方程与（的方程与（1 1）有所不同）有所不同;l（3 3）特殊序列有序机制：）特殊序列有序机制：EABEAB形成很慢分解极快在动力形成很慢分解极快在动力学上可忽略。为学上可忽略。为Theorell-ChanceTheorell-Chance机制机制EEEAEQABPQ第十页，编辑于星期五：二点 二十三分。（2）序列随机机制序列随机机制底物与酶结合的先底物与酶结合的先后是随机的，产物后是随机的，产物释放也是随机的。释放也是随机的。少数脱氢酶和一些少数脱氢酶和一些转磷酸基团的激酶转磷酸基团的激酶属于这一类。属于这一类。如肌酸激酶反应如肌酸激酶反应,Cleland表示法表示法肌酸肌酸+ATP 磷酸肌酸磷酸肌酸+ADP(A)(B)(P)(Q)第十一页，编辑于星期五：二点 二十三分。2、反应过程不形成三元络合物、反应过程不形成三元络合物l即乒乓机制；即乒乓机制；l双置换反应双置换反应(double-displacement reactions)；l特征特征:酶酶E E与底物与底物A A生成复合体，产物生成复合体，产物P P的脱离在的脱离在另一底物另一底物B B加入之前。加入之前。E+AEAEPFEQE+QFBPB第十二页，编辑于星期五：二点 二十三分。乒乓机制乒乓机制图解图解A和和Q竞争自由酶竞争自由酶E形式形式,B和和P竞争修饰酶竞争修饰酶E即即第十三页，编辑于星期五：二点 二十三分。属于乒乓机制的酶大多数是具有辅酶的，如转氨酶等属于乒乓机制的酶大多数是具有辅酶的，如转氨酶等(催化从氨基酸转移氨基到酮酸催化从氨基酸转移氨基到酮酸)，一些糖苷转移酶也是；，一些糖苷转移酶也是；如转氨酶先与氨基酸（如转氨酶先与氨基酸（A A）作用产生）作用产生EAEA释放酮酸（产物释放酮酸（产物P P），期间辅酶结构转变酶），期间辅酶结构转变酶E E变成酶变成酶F F，F F再与底物再与底物B B（另（另一酮酸）作用释放产物（相应氨基酸）一酮酸）作用释放产物（相应氨基酸）第十四页，编辑于星期五：二点 二十三分。三、双底物反应恒态动力学三、双底物反应恒态动力学l对特定反应历程要得到其稳态动力学一般步骤对特定反应历程要得到其稳态动力学一般步骤:l(1)(1)写出反应历程的方程式写出反应历程的方程式l(2)(2)再写出包含各种酶形式的微分方程再写出包含各种酶形式的微分方程,建立稳态后建立稳态后各种酶存在的形式浓度变化可做等于各种酶存在的形式浓度变化可做等于0 0l(3)(3)根据质量守恒条件去寻找各种酶存在形式的浓度代数根据质量守恒条件去寻找各种酶存在形式的浓度代数解解,最终得到酶促反应的速度方程最终得到酶促反应的速度方程l19561956年年KingKing和和AltmanAltman在矩阵理论基础上提出了一个简在矩阵理论基础上提出了一个简便方法后经便方法后经WongWong和和HanesHanes加以规则化加以规则化1、King-Altman方法推导速度方程方法推导速度方程第十五页，编辑于星期五：二点 二十三分。King-AltmanKing-Altman方法大体步骤方法大体步骤(1)(1)写出反应历程写出反应历程,安排成封闭的几何图形安排成封闭的几何图形图图1 1 式式1 1的的K-AK-A图图式式1第十六页，编辑于星期五：二点 二十三分。(2)(2)写出写出n-1n-1线的所有可能的图形线的所有可能的图形n n代表角数代表角数(即酶的存即酶的存在形式在形式!),!),m m为完整图为完整图形的线数形的线数,则它的则它的n-1n-1线图形总数为线图形总数为图图2：图图1的的n-1线图形线图形第十七页，编辑于星期五：二点 二十三分。封闭圈问题！封闭圈问题！l当反应历程构成的基本图形不止一个封当反应历程构成的基本图形不止一个封闭圈时闭圈时,在写在写n-1 n-1 线图时线图时,应把含有封团应把含有封团圈的图形扣除圈的图形扣除!第十八页，编辑于星期五：二点 二十三分。(3)(3)按按K-AK-A图形写出各种酶存在的浓图形写出各种酶存在的浓度和总酶浓度的比例度和总酶浓度的比例,基本表达式基本表达式:争对每种酶形式争对每种酶形式,按按图图2 2表示的表示的n-1n-1线图中线图中3 3个形式分别写出其个形式分别写出其形成过程形成过程,可得到可得到:EE0 0 为总酶浓度为总酶浓度,有有(1)(2)第十九页，编辑于星期五：二点 二十三分。(4)(4)可方便写出速度方程可方便写出速度方程(3)将将(1)、（、（2）式代入（）式代入（3）可得式，简化之得）可得式，简化之得第二十页，编辑于星期五：二点 二十三分。这个方程式和用数学法推导出的单底物单产物速这个方程式和用数学法推导出的单底物单产物速度方程形式相同。两例中酶的形式数不同，结果度方程形式相同。两例中酶的形式数不同，结果相同，这是因为反应历程中相同，这是因为反应历程中EAEAEPEP为中心复合为中心复合物。图解法推导时中心复合物是可以当作一物。图解法推导时中心复合物是可以当作一个酶形式来处理的，虽然此处它们被当作两个酶形式来处理的，虽然此处它们被当作两个酶形式来处理的，但导出的公式和做为一个酶形式来处理的，但导出的公式和做为一个酶形式来处理是完全相同的。个酶形式来处理是完全相同的。说明说明:第二十一页，编辑于星期五：二点 二十三分。初速度方程初速度方程所得到的速度方程的一般形式及初速度方程和以前数学推导的结果完全相同。第二十二页，编辑于星期五：二点 二十三分。2.Alberty表达式表达式许多双底物酶促反应在固原定一个底物浓度而改变另一个底许多双底物酶促反应在固原定一个底物浓度而改变另一个底物浓度时服从米氏方程式；物浓度时服从米氏方程式；对许多双底物酶促反应，在总酶浓度固定并远小于两个底物对许多双底物酶促反应，在总酶浓度固定并远小于两个底物浓度时，浓度时，AlbertyAlberty根据根据K-AK-A图形法推导出其方程一般形式为：图形法推导出其方程一般形式为：go back第二十三页，编辑于星期五：二点 二十三分。讨论l1 1、BB0 0 浓度很高时，简化为：浓度很高时，简化为：l与米氏方程一样！水解酶类的酶促反应就与米氏方程一样！水解酶类的酶促反应就如此；如此；l2 2、BB0 0 固定但未饱和固定但未饱和:这也是米氏方程一种形式！这也是米氏方程一种形式！l3 3、序列有序机制时、序列有序机制时,混合常数为混合常数为K KA AS SK KB Bm m,非非K KA Am mK KB Bm m;l4 4、序列随机机制中则都适用、序列随机机制中则都适用;l5 5、乒乓机制乒乓机制初速度内初速度内P P极低极低,逆过程忽略逆过程忽略,K,KA AS S=0,=0,简化为简化为:第二十四页，编辑于星期五：二点 二十三分。双倒数图讨论双倒数图讨论l由上分析由上分析,当固定一底物浓度改变另一底物浓度时遵守米氏方程当固定一底物浓度改变另一底物浓度时遵守米氏方程;l相应双倒数图为线性相应双倒数图为线性,分酶完全饱和和半饱和。分酶完全饱和和半饱和。1/A01/v0斜率斜率=KAm/vmax1/vmax1/A01/v0斜率斜率=(KAm+KAsKBm/B0)/vmax(1+KBm/B0)/vmaxB0饱和时饱和时1/v01/A0B0固定固定KBm时时1/v01/A0(b)(a)AA0 0 固定或饱和亦然！固定或饱和亦然！第二十五页，编辑于星期五：二点 二十三分。附附1：Alberty方程系数求解（方程系数求解（不饱和）不饱和）l用二次作图法！用二次作图法！l1 1、先双倒数作图：、先双倒数作图：1/v1/v1/A1/A0 0,此时固定不此时固定不同的同的BB0 0 例：甘油脱氢酶催化甘例：甘油脱氢酶催化甘油的反应是依赖油的反应是依赖NAD+NAD+的的有序有序BiBiBiBi反应：反应：1/v1/A0B0NAD+Gly NADH +DHAGDHAB第二十六页，编辑于星期五：二点 二十三分。l2 2、再分别以截矩对、再分别以截矩对1/1/BB0 0 作图：作图：1/B01/B01/B0其二次作图的竖轴截矩为其二次作图的竖轴截矩为1/V1/Vm m，斜率为，斜率为K Km mB B/V/Vm m，横轴截矩为，横轴截矩为K Km mB B1/VmKmB/Vm以斜率对以斜率对1/B1/B0 0 作图：作图：亦然！亦然！KmB第二十七页，编辑于星期五：二点 二十三分。附附2：稳态法推导多底物反应方程例：稳态法推导多底物反应方程例用稳态法推导，可获得稳态法方程用稳态法推导，可获得稳态法方程:序列机制的底物动力学的推导序列机制的底物动力学的推导第二十八页，编辑于星期五：二点 二十三分。序列随机机制稳态推导序列随机机制稳态推导kAEA=k-AEAk1AEBA=k-1AEBAk1BEAB=k-1BEBA设设第二十九页，编辑于星期五：二点 二十三分。E0=E+EA+EB+EABV=kEABVm=kE0各项代入各项代入约去约去EAB，上下同乘，上下同乘AB（I）与与AlbertyAlberty表达式完全相同表达式完全相同!第三十页，编辑于星期五：二点 二十三分。酶对底物酶对底物A的米氏常数的米氏常数(B饱和时饱和时)酶对底物酶对底物B的米氏常数的米氏常数(A饱和时饱和时)AB都达饱和时最大反应速度都达饱和时最大反应速度为底物为底物A与与E结合的解离常数结合的解离常数 当当 则得式（则得式（II），与米氏方程相同），与米氏方程相同:Vm（II）（I）第三十一页，编辑于星期五：二点 二十三分。乒乓机制推导乒乓机制推导由于产物由于产物P P浓度极低浓度极低,逆过程可忽略逆过程可忽略,式（式（I I）中）中KsA=0故其速度方程为故其速度方程为:第三十二页，编辑于星期五：二点 二十三分。3.Dalziel表达式表达式lDalziel关于双底物的一般表达式：关于双底物的一般表达式：第三十三页，编辑于星期五：二点 二十三分。动力学系数动力学系数求解求解一次一次作图作图原方程变换如下式：原方程变换如下式：固定不同固定不同BB0 0，作作EE0 0/v/v0 01/A1/A0 0 得一系列直线：得一系列直线：B01/A0E0/v0斜率斜率第三十四页，编辑于星期五：二点 二十三分。l再二次作图：二次作图：l分别用一次作图截矩、一次作图斜率对分别用一次作图截矩、一次作图斜率对1/B0作图：作图：1/B0一一次次作作图图截截矩矩截矩截矩=0 0斜率斜率=B B1/B0一一次次作作图图斜斜率率截矩截矩=A A斜率斜率=ABAB第三十五页，编辑于星期五：二点 二十三分。实例实例l甲醛脱氢酶甲醛脱氢酶FADH FADH 催化甲酸转化为甲醛催化甲酸转化为甲醛.此反应为双底物酶促反应此反应为双底物酶促反应,式中式中为动力学系数为动力学系数;E;E0 0 为酶浓度为酶浓度;A;A0 0、BB0 0 为底物为底物A A、B B 浓度浓度.将方程写成以下形式将方程写成以下形式根据根据Dalziel Dalziel 提出的双底物酶促反应动力学方程式提出的双底物酶促反应动力学方程式,采用两步法作图即采用两步法作图即可求得反应过程的动力学常数可求得反应过程的动力学常数.截距截距Y Y1 1,斜率斜率Y Y2 2AB第三十六页，编辑于星期五：二点 二十三分。l先固定先固定B(B(甲酸甲酸)的浓度的浓度,以以EE0 0/V1/A /V1/A 作图作图,得到截距得到截距Y1 Y1 和和斜率斜率Y2;Y2;l在不同在不同B B 的浓度下可得到不同的的浓度下可得到不同的Y1Y1和和Y2(Y2(图图1A;1A;l再以再以Y11/B Y11/B 和和Y21/B Y21/B 进进行二次作图行二次作图(图图1B),1B),即可求得即可求得0,0,A,A,B,B,ABAB。图图1A 37,pH7.0 1A 37,pH7.0 下游离甲醛脱氢酶酶促反应图下游离甲醛脱氢酶酶促反应图图图1B 1B 图图1A 1A 截距截距Y1Y1 1/HCOOH 1/HCOOH、斜率、斜率Y2Y2 1/HCOOH 1/HCOOH 关系图关系图最后通过最后通过Dalziel Dalziel 方程和方程和Alberty Alberty 方方程之间的常数转换关系求得反应的米程之间的常数转换关系求得反应的米氏常数氏常数.第三十七页，编辑于星期五：二点 二十三分。Dalziel与与Alberty比较比较比较两方程双倒数形式比较两方程双倒数形式,有有:vmax=E0/,得得:E:E0 0=vmax,将其代入将其代入Dalziel方程双倒数形式中方程双倒数形式中可可得：得：再与再与AlbertyAlberty双倒数方程比较有：双倒数方程比较有：K KA Am m=A A/K KB Bm m=B B/,K KA As s=ABAB/B B 1,DalzielDalziel方程可转化方程可转化为为AlbertyAlberty方程，并可方程，并可求得相应常数之间关系求得相应常数之间关系:第三十八页，编辑于星期五：二点 二十三分。2,DalzielDalziel表达式比表达式比表达式比表达式比AlbertyAlberty表达式中常数形式更直观表达式中常数形式更直观表达式中常数形式更直观表达式中常数形式更直观lDalziel形式（形式（4-61）lAlberty形式（形式（4-62）EEAPFEBQk1A0k3B0k-1k-3k2k4稳态乒乓稳态乒乓BiBiKing-Altman图图第三十九页，编辑于星期五：二点 二十三分。顺序机制的各直线交于纵顺序机制的各直线交于纵轴左侧一点轴左侧一点，但此法不能，但此法不能区别有序顺序机制和随机区别有序顺序机制和随机顺序机制顺序机制（1）顺序机制）顺序机制双倒数方程：双倒数方程：顺序机制顺序机制Lineweaver-Burk 作图法作图法1、底物动力学作图鉴别、底物动力学作图鉴别四、多底物酶促反应机制的鉴别四、多底物酶促反应机制的鉴别第四十页，编辑于星期五：二点 二十三分。速度方程倒数速度方程倒数乒乓机制是平行线乒乓机制是平行线作作 1/v1/A(或或1/v1/B)的图的图（2）乒乓机制）乒乓机制第四十一页，编辑于星期五：二点 二十三分。既可鉴别乒乓机制和顺序机制，还可既可鉴别乒乓机制和顺序机制，还可区分顺序机制中的区分顺序机制中的有序和随机机制有序和随机机制；例例1：反应初期产物抑制：反应初期产物抑制Cleland规则规则(除随机机制外除随机机制外)：规则规则1：变化底物与一种形式酶结合，产物与另一种形式：变化底物与一种形式酶结合，产物与另一种形式酶结合，双倒数图中纵轴截矩变化；酶结合，双倒数图中纵轴截矩变化；规则规则2：变化底物与产物同结合一种形式酶或产物结合酶：变化底物与产物同结合一种形式酶或产物结合酶与此酶可逆相联，则斜率变化；与此酶可逆相联，则斜率变化；2、抑制剂法抑制剂法PEEABQEAFPFFBEQ乒乓机制例乒乓机制例第四十二页，编辑于星期五：二点 二十三分。例例2：端点抑制剂：端点抑制剂l指抑制剂本身不是底产物，但可与一种或几种酶形式形成指抑制剂本身不是底产物，但可与一种或几种酶形式形成络合物形成死端；络合物形成死端；l其对双倒数图截矩与斜率之影响：其对双倒数图截矩与斜率之影响：l1 1，抑制剂与变化底物结合于不同形式酶，抑制作用不，抑制剂与变化底物结合于不同形式酶，抑制作用不可克服，可克服，纵轴截矩纵轴截矩变化；变化；l2 2，两种情况，两种情况,斜率变化斜率变化：l（1 1）抑制剂与变化底物结合相同形式酶）抑制剂与变化底物结合相同形式酶;l（2 2）变化底物在抑制剂后，两结合点关联）变化底物在抑制剂后，两结合点关联.l上述情况可对照书上表上述情况可对照书上表4-5,4-64-5,4-6进行理解进行理解!第四十三页，编辑于星期五：二点 二十三分。反应机制判断例反应机制判断例:所以所以:过程过程:第四十四页，编辑于星期五：二点 二十三分。习题课习题课l1、抑制动力学相关；、抑制动力学相关；l2、双底物反应（、双底物反应（Dalzil表达式）表达式）第四十五页，编辑于星期五：二点 二十三分。第四十六页，编辑于星期五：二点 二十三分。