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鱼类性反转后雌雄性别的鉴定动物遗传育种与繁殖 张宇鹏纲要性反转鱼类的性别鉴定 1、生理性别的鉴定；2、遗传性别的鉴定；3、问题与展望。1 1.1 1 体外性别特征分辨法体外性别特征分辨法 体外性别特征分辨法是最直接和快速简单的鉴定鱼类性别的一种方法，许多鱼类雌雄个体之间存在着明显的生物学性状诸如生长率、成熟年龄、繁殖方式、体色、体型、个体大小等差异,因此，可以通过一系列的外部形态特征鉴别雌雄性别。在相同的培育条件下，一般雄性大鲵的体型与雌性相比略显瘦长，尤其在接近繁殖季节会更加明显。仔细观察大鲵后肢前的躯干部位，雄性大鲵从前至后会均匀缩小，而雌性大鲵该部位会稍向身体两侧突出，表现为有一定弧度的缩小。大鲵性别可从泄殖孔的特征来鉴别，尤其在繁殖季节更为明显，这也是目前对大鲵性别进行鉴定的最有效的方法之一。在繁殖季节，雄性大鲵的泄殖腔腺成饱满的大豆瓣状，形成隆起的纵椭圆环形，甚为明晰，将泄殖孔包绕于其中，并且泄殖孔外缘有一圈不规则的白色肉质状小突起。雌性生殖孔多为圆形，孔径相对较小，生殖孔两侧无白色突起，孔外缘平滑，内缘可见两侧的皮层形成向腔面突出的皱褶。实际操作时，只要籽大鲵尾部向上翻提起，用手轻拔开泄殖孔。即可辨认。1.2 外科手术性腺检查法 外科手术性腺检查法可以兼顾性腺取材的目的，不需要特殊的仪器设备或试剂，而且一次性操作即可完成性别鉴定和分池培育，是目前人们在生产中普遍采用的方法，其缺点是对鱼类产生不同程度的伤害，特别是存在致死风险，要求操作者有一定的熟练程度。通过外科手术性腺检查法鉴定性别，有一个时机的问题，年龄（体重）太小，性腺尚未发育到肉眼可分辩性别的程度；年龄太大，不便于及早分池培育，而且人工操作（如转运等）的难度增加。用具有头兜的帆布担架捞取实验鱼，体重10kg以下的受试鱼在手术前经25mg/L的丁香油麻醉1015min。将担架置于手术支架上，鱼呈仰卧姿势，由鳃部供水。手术器具包括医用手术刀、手术剪、海绵钳、止血钳、弧形缝合针、缝合线（医用丝线）等，使用前经70%乙醇浸泡15min。在生殖孔前36块腹骨板之间的腹中线或偏离腹中线14cm处，切开长（3.87.5）cm的切口。扒开切口观察性腺，辨认卵巢与精巢。然后用手术剪等工具取下体积约0.5cm3的性腺组织材料。切口缝合采用交叉缝合法或一针一结缝合法，根据切口长度缝38 针。缝合完毕，用红霉素软膏涂抹伤口处。肉眼检出的卵巢呈淡黄色，表面质地较软，富有皱折和分叶，卵粒隐约可见；精巢白色，表面丰满光滑，质地较硬，呈棒状或块状。附着在精巢上的脂肪所占的比例比卵巢大。1.31.3 内窥镜技术内窥镜技术1、技术简介 内窥镜技术是将窥镜轴从受检鱼的生殖孔插入，使其前端紧贴性腺组织，通过目镜或外接成像系统进行观察。Kynard等16利用内窥镜技术对短吻鲟(Abrevirostrum)、闪光鲟(AsteUatus)及俄罗斯鲟(Agueldenstaedtii)进行了性别及卵巢发育时期的鉴别，取得了较好的结果。2、局限性：在性腺发育早期，由于雌雄性腺没有明显特征，且往往会被脂肪所包被，内窥镜技术极难鉴别。通常来讲，内窥镜技术成功对雌雄鱼性别进行鉴别的时间要晚于微创手术法，且要求操作者具有一定的实践经验。鲟鱼内窥镜检查剖面图(引自KYNARD B，KIEFFER MUse of a borescope to determine the sex and egg maturity stage of sturgeous and the effect of borescope use on reproductive structuresJJAppl1ehthy01，2002(18)：505508)A.eyepiece；Bhandle with battery for light；Cborescope shaft；Dfiber-optic shaft；E.light of borescope1 1.4 4 性腺活体压片一醋酸洋红染色法性腺活体压片一醋酸洋红染色法 Guerrero等(1974)最早提出的性腺活体压片一醋酸洋红染色方法，是一种成本低廉、操作简便和准确率较高的稚幼鱼性别鉴定技术。将试验鱼用丁香酚深度麻醉，测量并记录全长和体重，然后解剖，将包括肝脏和消化道在内的游离内脏团整体取出，可以看到试验鱼的性腺。对于肉眼可以清楚区分卵巢和精巢的幼鱼，直接确定性别和用相机拍照，并随机抽取卵巢和精巢各5个进行活体压片观察。对于肉眼不能清楚区分卵巢和精巢的幼鱼，用镊子小心将1对性腺取下，从性腺顶端连接处分开，将一叶性腺放置在干净的载玻片上，用解剖剪将性腺剪成厚约14 mm的薄片加上醋酸洋红染液数滴，用干净的盖玻片盖住，轻轻挤压使性腺组织破裂和分散，然后转移到显微镜下进行性别鉴定和拍照。韩伟国等综合运用肉眼观察、活体压片一醋酸洋红染色和组织切片一HE染色3种方法对大菱鲆幼鱼进行性别鉴定。结果表明，在所有采集的1 217尾全8.321.5cm、体重9.o183.9 g的大菱鲆幼鱼样品中，体重90 g的269尾幼鱼和体重1090 g的790尾幼鱼，可用肉眼直接观察鉴定性别；体重1090 g的另外154尾幼鱼，可采用活体压片方法鉴定性别；体重10 g的幼鱼，均可以采用活体压片方法准确地鉴定出性别，其准确率可以达到100。1.雌鱼；2.雄鱼;3.卵巢放大;4.同一卵巢活体压片一醋醴洋红船色;5.精巢放大;6.同一精巢压片-醋瞳洋红染色;B:膀胱;o:卵巢;oc:卵母细胞;T:精巢;sc:精母细胞；图版1-1、4标尺均为50 um图版I 大菱拜幼鱼卵巢、精巢的解剖肉眼观察和活体压片-醋酸洋红染色特征l、2分别为同一卵巢的组织切片HE染色和活体压片一精酸洋红染色;3、4分别为同一精巢的组织切片HE染色和活体压片一醋酸洋红染色;00：卵母细胞;SSC:精原细臆包囊;Sc：精母细胞;比例尺50um图版 肉眼无法辨别的大菱鲆幼鱼卵巢和精巢的组织切片一HE染色和活体压片一醋酸洋红染色特征1.5 超声波鉴定法 超声鉴别操作方法同医用超声波仪临床使用方法基本一致。检查前先在超声波传感器上涂一层专用胶，然后套上一个塑料外套。检查过程中，焦深、输出电源及帧捕获率保持不变，其它设置做小范围调整，以获得受检鱼内脏各脏器的清晰图像。该方法对鱼类不产生任何损伤，病毒感染率低，检测快速。王斌等利用超声波技术2龄或3龄鲟鱼的性别及成熟度进行检测，2龄或3龄西伯利亚鲟的检测。结果表明：准确率为92.0%100%,2龄俄罗斯鲟(A.gueldenstaedtii)准确率为83.0%,3龄史氏鲟(A.schrenckii)准确率为58.0%。图片引自：王斌 et al.利用超声波技术鉴定幼龄鲟鱼的性别J.动物学杂志,2009,44(2):5763.左图：手持传感器的姿势；右图：图2 成熟雄性西伯利亚鲟的超声波正面切图与解剖图对照1 1.6 6 激素指标判别法激素指标判别法 鱼类中雌雄性别的个体的雌二醇、孕酮和睾酮等生殖激素指标含量方面会有一定的差异，鱼类性腺在发育之前，血浆中性激素水平保持在较低的水平。当雄性减数分裂和雌性卵母细胞开始发育时，睾酮(T)和11一酮基睾酮(KT)的含量开始增加，并且在卵巢或精巢成熟时保持较高的水平。在雌鱼中，当卵黄发生时雌二醇(E2)含量开始增加。因此，可通过测定鱼类的生殖激素指标来辨别雌雄。从大鲵尾静脉抽取血液2mL取血后离心分离出血清，送至科研或医疗机构检验生殖激素。雌雄大鲵在雌二醇、孕酮和睾酮等生殖激素指标含量方面会有一定差异，参考生殖激素指标含量的高低可进行大鲵雌雄的鉴别。2.1染色体组型分析 目前，有近100种鱼类被认为有性染色体，但是在细胞遗传学研究上能分辨出来的、具有较好性染色体形态分化的鱼类只有40种左右。16目前一般认为的鱼类性别的染色体决定类型主要有8种：XX/XY、WZ/ZZ、WXY、XX/XO、ZO/ZZ、X1X1X2-X2/X1X2Y、ZZ/ZW1W2、XY1Y2/XX。2.2 染色体的带型分析染色体分带技术可以揭示染色体的精细结构,检测出性染色体之间细微的结构差异。而其中C-带是鱼类染色体分带中较为稳定和常用的方法,它特异显示结构异染色质的位置。Andreata应用C-带技术证实了甲鲇科的Pseudatocinclustetensis的性染色体组成为XX/XY型18。2.3 分子标记 找出性别特异的DNA片段,作为性决定遗传基础的分子标记是一种较简捷的鉴别鱼类雌雄性别的方法。Wevlin等人应用差减DNA杂交方法,从大鳞大麻哈鱼基因组DNA中分离到了一个Y染色体特异的重复序列,大鳞大麻哈鱼Y染色体上的串联重复DNA是鉴定具有Y染色体的可靠标志20。虹鳟中的OmyP9是性染色体特异的序列21。图4不Iq温度处理的半滑舌鳎性反转个体的鉴定F：雌抖；MS：忡逆转雄性；M：雄性(图片引自：邓思平 et al.半滑舌鳎的性腺分化和温度对性别决定的影响)2.4 性反转动物杂交 性反转在鱼类中是极其普遍的。在鱼类中存在由于环境因素如温度和性激素诱发的性反转。这些性反转个体与正常个体杂交,其后代性决定仍由性染色体决定。如果雌性是同配性别的,它反转成为雄性后与正常雌性个体杂交生出的后代应由单一雌性组成;而如果雌性是异配性别时,经类似的杂交生出的后代中应同时出现雌雄个体的雌雄比为1:3。通过这类实验证明金鱼是雄性异配的即XX/XY型;鲤鱼、莫桑比克罗非鱼也是一样23。2.5 性连锁性状 遗传研究表明在许多物种中,有一些表型性状是与性别联系在一起的。鱼类中也不例外,并可根据其与性别连锁的关系进而推断其性决定体系。虹鳟雄性体色鲜艳,有多种不同形式,而雌性则是单一灰色。经典遗传研究证明,使雄性身体产生红色斑点,背鳍上出现黑色斑点是由Ma基因控制的,这一性状限于雄性中;还有许多体色基因具有类似的遗传方式,由此说明是XY型性决定。2.6 基因鉴别法 Dmrt基因被认为是脊椎动物中最原始的性别决定基因，位于常染色体上，但雌雄中的表达不同，该基因的功能可能与精巢的足细胞发育有关。26Dmrtl在罗非鱼和虹鳟中表达都呈现出雄性特异现象(Raymond et a1，1998；Guan et a1，2000；Marchand et a1，2000)。DMY基因是迄今鱼类在Y染色体上找到的、与精巢发生与分化直接相关证据最充分的一个性别决定功能基因,与SRY在哺乳类的作用类似。DMY仅在青鳉XY性腺体细胞内表达,是雄性正常发育所必需的;且其表达量需达到一定的阈值,减少也将产生XY雌性个体;其开放阅读框一个点突变也能诱导XY雌性个体产生。27 除此之外，还有Sox基因、SRY基因以及H-Y抗原等，但都不像哺乳动物一样有一个适用于全体的基因。因此，基因鉴定法还没有真正的应用于实践中，还处于实验室研究阶段。问题与展望 目前在性别鉴定过程中还存在以下问题:最佳鉴定时间的确定、科学的量化指标还不够完善、鉴别方法劳动强度大等等。通过深入研究鱼类性腺发生、分化的特点和规律，从解剖学和细胞学上掌握性腺分化的具体时间。以确定的性腺分化时间为中心，对分化前后血清生化及激素指标进行检测分析，获得鱼类特定环境下的量化指标。检测性腺分化前后不同基因的表达量。从而建立简便、快捷、准确的鉴别技术，及早地对鱼类的性别进行有效鉴别，有选择性地进行单性别养殖将会极大地降低养殖成本，促进渔业的迅速发展。Thanks