章DNA的复制和修复(2).ppt

一、填空题 1、嘧啶核苷酸从头合成的第一个核苷酸是（），嘌呤核苷酸从头合成的第一个核苷酸是（）。2、dTMP的直接前体是（）。3、人类对嘌呤代谢的终产物是（）4、嘧啶合成中氨甲酰磷酸的合成以（）作为氨的供体，尿素循环中氨甲酰磷酸由（）作为氨的供体。5、与嘌呤环和嘧啶环的原子来源都有关的氨基酸是（）。6、治疗痛风可用（）来作为黄嘌呤氧化酶的自杀性底物。7、5-FU的抗癌作用机理是（）。二、选择题1.下列哪种物质不是嘌呤核苷酸从头合成的直接原料？A.甘氨酸 B.天冬氨酸 C.苯丙氨酸 D.CO2 E.一碳单位2.在细胞中自UMP合成dTMP的有关反应涉及A.四氢叶酸衍生物传递一碳单位 B.四氢叶酸氧化成二氢叶酸 C.中间产物为dUDP D.受5-氟尿嘧啶的抑制 E.受6-巯基嘌呤的抑制3、嘌呤环1号N来源于（）A、Gln的酰胺N B、Gln的-氨基N C、Asn的酰胺N D、Asp的-氨基N 4、鸟嘌呤是（）A、2-氧-4-氨基嘌呤 B、2-氨基-4-氧嘌呤 C、2-氨基-6-氧嘌呤 D、2-氧-6-氨基嘌呤 5、催化5-磷酸核糖和ATP作用生成5-PRPP的酶是（）A、核糖激酶 B磷酸核糖激酶C三磷酸核苷酸激酶D磷酸核糖焦磷酸激酶6、下列哪种化合物对嘌呤核苷酸的生物合成不产生直接反馈抑制作用（）A、TMP B、IMP C、AMP D、GMP7、最直接联系核苷酸代谢与糖代谢的物质是（）A、葡萄糖 B、6-磷酸葡萄糖 C、1，6二磷酸葡萄糖D、5-磷酸核糖8、AMP分子中第六位碳原子上的氨基来源于（）A谷氨酰胺 B谷氨酸 C天冬氨酸 D天冬酰胺9、催化dUMP转变为dTMP的酶是（）A核苷酸还原酶 B胸甘酸合成酶 C脱氧胸甘激酶 D核苷酸激酶三判断题1、嘌呤核苷酸的从头合成是先闭环，再形成N糖苷键。2、dUMP转变为dTMP的甲基供体是携带甲基的FH4。3、核苷酸的从头合成和补救途径都需要PRPP。4、氮杂丝氨酸的化学结构与Gln相似，它干扰Gln在核苷酸合成中提供氨基作用。5、黄嘌呤氧化酶只能以黄嘌呤作为唯一底物。6、脱氧核苷酸是由核糖核苷三磷酸经还原生成的。DNADNA的复制和修复的复制和修复 复制：复制：以亲代以亲代DNADNA或或RNARNA为模板，根据为模板，根据碱基配对碱基配对的原则的原则，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代的子代DNADNA或或RNARNA的过程。的过程。几个基本概念：几个基本概念：逆转录：逆转录：以以RNARNA为模板，在为模板，在逆转录酶逆转录酶的作用下，的作用下，生成生成DNADNA的过程。的过程。翻译：翻译：亦叫转译，以亦叫转译，以mRNAmRNA为模板，将为模板，将mRNAmRNA的密的密码解读成蛋白质的码解读成蛋白质的氨基酸顺序氨基酸顺序的过程。的过程。转录：转录：以以DNADNA为模板，按照碱基配对原则合成为模板，按照碱基配对原则合成RNARNA，即将即将DNADNA所含的遗传信息传给所含的遗传信息传给RNARNA，形成一条形成一条与与DNADNA链互补的链互补的RNARNA的过程。的过程。DNA是生物界遗传的主要物质基础。生是生物界遗传的主要物质基础。生物有机体的遗传特征以密码的形式编码在物有机体的遗传特征以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序即遗传信息。即遗传信息。在细胞分裂前通过在细胞分裂前通过DNA的复制，将遗传的复制，将遗传信息由亲代传递给子代，在后代的个体发育信息由亲代传递给子代，在后代的个体发育过程中，遗传信息自过程中，遗传信息自DNA转录给转录给RNA，并指并指导蛋白质合成，以执行各种生命功能，使后导蛋白质合成，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。代表现出与亲代相似的遗传性状。80年代以后在某些致癌年代以后在某些致癌RNA病毒中发病毒中发现遗传信息也可存在于现遗传信息也可存在于RNA分子中，由分子中，由RNA通过逆转录的方式将遗传信息传递给通过逆转录的方式将遗传信息传递给DNA。遗传信息的传递方向即生物界遗传信息遗传信息的传递方向即生物界遗传信息传递的中心法则。传递的中心法则。1964-1970 1964-1970 发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转录发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转录 19531953年，年，WatsonWatson和和CrickCrick提出中心法则：遗传信息的单向流动。提出中心法则：遗传信息的单向流动。中心法则：中心法则：病毒（复制）病毒（复制）复制复制转录转录DNA RNA 蛋白质蛋白质翻译逆转录逆转录RNARNA的复制存在于的复制存在于RNARNA病毒病毒 DNA DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在码的形式编码在DNADNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过通过DNADNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自遗传信息自DNADNA转录给转录给RNA,RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。DNADNA复复制的可制的可能方式能方式的假设的假设全保留与全保留与全新复制全新复制分散复制分散复制半保留半保留复制复制一、一、DNADNA的半保留复制的半保留复制2.2.半保留复制的实验证据半保留复制的实验证据:1.1.定义定义：19581958年年MeselsonMeselson和和StahlStahl用同位素用同位素1515N N标记标记大大肠杆菌肠杆菌DNADNA,首先证明了首先证明了DNADNA的半保留复制。的半保留复制。以以亲代亲代DNADNA双链双链为模板以为模板以碱基互补碱基互补方式合方式合成子成子代代DNADNA，这样这样新形成的子代新形成的子代DNADNA中，一条链来自亲中，一条链来自亲代代DNADNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫式叫半保留复制半保留复制。第一节第一节 DNA的复制的复制DNADNA半保留复制图示：半保留复制图示：半保留复制的证明：半保留复制的证明：MeselsonMeselson 和和StahlStahl将同位将同位素素1515N N标记的标记的1515NHNH4 4ClCl加入大肠杆加入大肠杆菌的培养基中培养菌的培养基中培养1212代，使大代，使大肠杆菌的肠杆菌的DNADNA都带上都带上1515N N的标记，的标记，然后将该大肠杆菌转入然后将该大肠杆菌转入1414N N的普的普通培养基中培养后，分离子一通培养基中培养后，分离子一代、子二代、子三代、子四代代、子二代、子三代、子四代DNADNA，进行进行氯化铯氯化铯密度梯度离密度梯度离心，实验证明了心，实验证明了DNADNA的半保留的半保留复制。复制。1515N-DNAN-DNA的密度大于的密度大于1414N-DNAN-DNA的密度的密度DNADNA的半保留复制的生物学意义：的半保留复制的生物学意义：DNADNA在代谢上的稳定性并非指在代谢上的稳定性并非指DNADNA是一是一种惰性物质种惰性物质，是处于不断变异和发展之中是处于不断变异和发展之中 DNADNA的半保留复制表明的半保留复制表明DNADNA在代谢上在代谢上的的稳定性稳定性，是是保证亲代的遗传信息稳保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代必要措施。定地传递给后代必要措施。二、二、DNADNA复制的半不连续性复制的半不连续性1）冈崎片段和半不连续复制问题的提出：已知DNA两条链反向且都能作为模板；已知DNApol聚合方向53；冈崎等提出DNA的不连续复制模型，认为：3 5走向的DNA是由许多53方向合成的DNA片段连接而成的。冈崎片段：冈崎片段：以 5 3 走向DNA为模板合成的小片段。约1000-2000bp。半不连续复制的发现半不连续复制的发现 同位素实验，用含同位素实验，用含3 3H H的的dTdT标记用标记用T T4 4噬菌体感染的大肠噬菌体感染的大肠杆菌杆菌 短时间内分离的短时间内分离的DNADNA均为均为DNADNA小片段小片段一段时间后一段时间后检测到检测到 DNADNA大片段。当用大片段。当用DNADNA连接酶的缺失的变异株连接酶的缺失的变异株时，检测到大量时，检测到大量DNADNA片段的积累。片段的积累。证明证明DNADNA复制中有小复制中有小片段合成。片段合成。测定测定DNADNA小片段，远远大于合成小片段，远远大于合成DNADNA的一半。似乎两条的一半。似乎两条链都是不连续合成的，后发现是由于链都是不连续合成的，后发现是由于U U替代替代dTdT渗入渗入DNADNA中，中，而被尿嘧啶而被尿嘧啶-N-N-糖基酶切除所致。糖基酶切除所致。在缺少尿嘧啶在缺少尿嘧啶-N-N-糖基酶的突变植株中，糖基酶的突变植株中，DNADNA的的U U不再不再被切除，则被切除，则检测到一半检测到一半3 3H H标记出现在小片段（冈崎片段）标记出现在小片段（冈崎片段）中。中。1968 1968日本学者冈崎：日本学者冈崎：前导链前导链滞后链滞后链冈崎片段冈崎片段前导链：前导链：以以3 5 方向的亲方向的亲代链为模板连续合成的子代链。代链为模板连续合成的子代链。滞后链：滞后链：以以5 3方向的亲方向的亲代链为模板的子代链先逆复制代链为模板的子代链先逆复制叉移动方向合成冈崎片段，再叉移动方向合成冈崎片段，再连接成滞后链。连接成滞后链。其复制过程的复制起点呈现叉子的形式,故称复制叉 三、与三、与DNADNA复制有关的酶和蛋白质复制有关的酶和蛋白质n原料原料：四种脱氧核苷三磷酸四种脱氧核苷三磷酸 （dATPdATP、dGTPdGTP dCTPdCTP dTTPdTTP)n需要需要模板模板：以以DNADNA为模板链，合成子代为模板链，合成子代DNADNA，模板可模板可以是双链，也可以是单链以是双链，也可以是单链DNADNA。合成产物与模板互补。合成产物与模板互补。n 需要需要引物引物：一小段一小段RNA(RNA(或或DNADNA）为引物，在大肠杆为引物，在大肠杆 菌中，菌中，DNADNA的合成需要一段的合成需要一段RNARNA链作为引物链作为引物，引物含，引物含3 3 -OHOH.n合成方向：合成方向：5 5 3 3 (一一)DNADNA聚合酶：聚合酶：19561956年年KornbergKornberg等在大肠杆菌中等在大肠杆菌中首先发现首先发现DNADNA聚合酶，其后发现该酶在许多生物中广聚合酶，其后发现该酶在许多生物中广泛存在。泛存在。该酶的催化性质如下：该酶的催化性质如下：（二）大肠杆菌（二）大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶（1 1）5 5 3 3 聚合酶聚合酶功能（功能（但持续合成但持续合成DNADNA的能力差的能力差）；）；（2 2）3 3 5 5外切酶外切酶活性活性（对双链无作用，在正常聚合对双链无作用，在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链条件下，此活性不能作用于生长链，只作用于生长中不配，只作用于生长中不配对的单链，对的单链，校对功能。）校对功能。）；（3 3）还具有）还具有5 5 3 3外切酶外切酶活性（双链有效活性（双链有效）；）；1 1、DNADNA聚合酶聚合酶:19561956年年KornbergKornberg首先从首先从大肠杆菌大肠杆菌中分中分离。该酶为离。该酶为单体酶单体酶,含一个锌原子含一个锌原子。为多功能酶，。为多功能酶，具有具有:该酶缺失时大肠杆菌仍具有该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNADNA合成酶活性，只是对合成酶活性，只是对DNADNA损伤的修复能力损伤的修复能力下降，容易导致变异和死亡。推测该下降，容易导致变异和死亡。推测该酶酶主要是对主要是对DNADNA损伤的修复，以及损伤的修复，以及在在DNADNA复制时复制时RNARNA引物切引物切除及其除及其缺口缺口的填补的填补。a.聚合作用聚合作用 在引物的在引物的3-OH末端，以末端，以dNTP为底物，为底物，按模板按模板DNA上的指令由上的指令由DNA pol逐个聚合逐个聚合上核苷酸。上核苷酸。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进生变化，促进3-OH与与5-PO4结合生成磷酸结合生成磷酸二酯键。二酯键。DNADNA聚合酶催化的反应：聚合酶催化的反应：b.35外切酶活性（校对作用外切酶活性（校对作用）35外外切切酶酶活活性性是是从从35方方向向识识别别和和切除不配对的切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。生长链末端的核苷酸。错错误误核核苷苷酸酸进进入入pol的的结结合合位位点点不不能能与与模模板板配配对对，无无法法改改变变酶酶的的构构象象而而被被35外切酶活性位点所识别并切除。外切酶活性位点所识别并切除。c.53外切酶活性（切除修复作用）外切酶活性（切除修复作用）53外外切切酶酶活活性性是是从从53方方向向水水解解DNA生生长长链链前前方方的的DNA链链。它它只只作作用用具具切切口口的双螺旋的双螺旋DNA，并在切口以外的配对区切割。并在切口以外的配对区切割。53外外切切酶酶活活性性在在DNA损损伤伤的的修修复复中中可可能能起起着着重重要要作作用用。对对冈冈崎崎片片段段5-末末端端RNA引物的去除依赖此种外切酶活性。引物的去除依赖此种外切酶活性。DNADNA聚合酶聚合酶的功能的功能2 2、DNADNA聚合酶聚合酶：多亚基酶，聚合作用，聚合活力比多亚基酶，聚合作用，聚合活力比DNADNA聚聚合酶合酶高；持续合成高；持续合成DNADNA的能力差。该酶缺的能力差。该酶缺失时大肠杆菌仍具有失时大肠杆菌仍具有DNADNA合成能力，推测该合成能力，推测该酶仍然不是真正的酶仍然不是真正的DNADNA聚合酶。该酶聚合酶。该酶具有具有3 3 5 5外切酶活性外切酶活性。其功能可能在其功能可能在修复修复紫外光引起的紫外光引起的DNADNA损伤损伤中起作用。中起作用。3 3、DNADNA聚合酶聚合酶 多亚基酶，含多亚基酶，含十种亚基十种亚基:（），其中（其中（）称为称为核心酶核心酶，2 2称为夹子，（称为夹子，（2 2）组组成成复合物复合物，其主要功能是帮助，其主要功能是帮助亚基夹住亚基夹住DNADNA，故称为故称为夹子装配器夹子装配器，该酶，该酶DNADNA合成的合成的持续能力强持续能力强，主要与该结构有关。另外，该酶合成主要与该结构有关。另外，该酶合成速度大，活性速度大，活性高，高，缺失时大肠杆菌因缺失时大肠杆菌因DNADNA复制抑制而致死。因此复制抑制而致死。因此认为该酶认为该酶DNADNA的真正复制酶的真正复制酶。DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶结构基因结构基因不同种类的亚不同种类的亚基数目基数目相对分子质量相对分子质量35外切酶外切酶53外切酶外切酶聚合速度（核聚合速度（核苷酸苷酸/分）分）持续合成能力持续合成能力功能功能Pol A1103,0001,000-1,2003-200切除引物，修复Pol B788,0002,4001,500修复Pol C10830,00015,000-60,000500,000复制大肠杆菌三种大肠杆菌三种DNA聚合酶比较聚合酶比较(三）三）DNADNA连接酶：连接连接酶：连接DNADNA双链中的单链切口双链中的单链切口作用特点：作用特点：大肠杆菌和其它细菌的大肠杆菌和其它细菌的DNADNA连接酶连接酶要求要求NADNAD+提供能量提供能量；在高等生物和噬菌体中，在高等生物和噬菌体中，则要求则要求ATPATP提供能量。提供能量。T T4 4噬菌体的噬菌体的DNADNA连接连接酶不仅能连接酶不仅能连接双链双链DNADNA上上的的粘性粘性切口，而切口，而且能连接无粘性末端的平头双链且能连接无粘性末端的平头双链DNADNA。DNA DNA连接酶连接酶在在DNADNA复制、损伤修复、重组复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。等过程中起重要作用。1、拓扑异构酶、拓扑异构酶 拓扑异构酶：拓扑异构酶：催化催化DNADNA的拓扑连环数发生的拓扑连环数发生变化的酶，在变化的酶，在DNADNA重组修复和其重组修复和其它它转变方面转变方面起重要作用。起重要作用。除连环数不同外其它性质均相同的除连环数不同外其它性质均相同的DNADNA分分子称为子称为拓扑异构体拓扑异构体，引起拓扑异构体反应的，引起拓扑异构体反应的酶称为酶称为拓扑异构酶拓扑异构酶。(四四)与与DNADNA合成有关的其它蛋白因子合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中大肠杆菌中)两类拓扑异构酶作用特点两类拓扑异构酶作用特点:口2 2、解螺旋酶解螺旋酶 （解链酶）（解链酶）通过水解通过水解ATPATP将将DNADNA两条链打开。两条链打开。E.coliE.coli中的中的reprep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I I、IIII、IIIIII。每解开一对碱基需要水解每解开一对碱基需要水解2 2个个ATPATP分子。分子。稳定稳定DNADNA解开的单链，防止复性和保护单解开的单链，防止复性和保护单链部分不被核酸酶水解。链部分不被核酸酶水解。3 3、单链结合蛋白：、单链结合蛋白：引发体可以沿模板链引发体可以沿模板链5 5 3 3方向移动方向移动,具有具有识识别合成起始位点别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发的功能，移动到一定位置上即可引发RNARNA引物的合成。移动和引发均需要引物的合成。移动和引发均需要ATPATP提供能量，提供能量，nn蛋白具有蛋白具有ATPATP酶的活力。引发体的移动与复制叉移酶的活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与动的方向相同，与冈崎片段冈崎片段的合成方向相反。的合成方向相反。4 4、引物合成酶与引发前体、引物合成酶与引发前体 引物合成酶：引物合成酶：催化引物催化引物RNARNA的生成的生成 引发前体引发前体:它由多种蛋白质它由多种蛋白质dnaAdnaA、dnaBdnaB、dnaCdnaC、n n、nn、n n和和i i组成。引发前体再与引发酶结组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。合组装成引发体。蛋白质蛋白质功能功能相对分子相对分子量（量（10103 3）分子分子/细细胞胞DNADNA旋转酶（或拓旋转酶（或拓扑异构酶）扑异构酶）DNADNA解链酶解链酶单链结合蛋白单链结合蛋白引物合成酶引物合成酶引入或松开引入或松开超螺旋超螺旋使双链使双链DNADNA解链解链稳定单链区稳定单链区合成合成RNARNA引引物物4004006565747460605050300300100100（五）、参（五）、参与与DNA复制复制的酶与蛋白的酶与蛋白因子总览图因子总览图四、四、DNADNA的复制过程的复制过程1、复制的起点与方向、复制的起点与方向（一）复制的起始（一）复制的起始 大肠杆菌双链大肠杆菌双链环状环状DNADNA的复制（的复制（一个一个复制起点，复制起点，双向复制）双向复制）3 真核细胞真核细胞线状染色体线状染色体DNADNA的复制方式（的复制方式（多个多个复制起复制起点，双向复制）点，双向复制）单向单向滚环式滚环式复制（噬菌体复制（噬菌体 X174DNAX174DNA单链环状）单链环状）从复制原点到终点，组成一个从复制原点到终点，组成一个复制单位复制单位，叫，叫复制子复制子（基因组独立进行复制的单位）。（基因组独立进行复制的单位）。DNADNA的复制有特定的起始位点，叫做的复制有特定的起始位点，叫做复制原点复制原点。常用。常用oriori C(C(或或o o）表示。大肠杆菌的复制原点表示。大肠杆菌的复制原点oriori C C由由245245个个bpbp构成，关键序列含两组保守的重复序列：三个构成，关键序列含两组保守的重复序列：三个1313bpbp的序列的序列（富含（富含A A、T T的序列）和四个的序列）和四个9 9bpbp的序列；许多生物的复制的序列；许多生物的复制原点也都是原点也都是富含富含A A、T T的区段的区段。复制原点复制原点由由DnaADnaA蛋白识别，蛋白识别，在原点由在原点由DnaBDnaB蛋白（解螺旋蛋白（解螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链补链(DNADNA双链的解开还需双链的解开还需DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶 、SSB),SSB),在原在原点处形成一个眼状结构，叫点处形成一个眼状结构，叫复制眼复制眼。2、起点的识别和双链的解开、起点的识别和双链的解开（1 1）拓扑异构酶解开超螺旋。）拓扑异构酶解开超螺旋。（2 2）DnaDna A A蛋白识别并在蛋白识别并在ATPATP存存在下结合于四个在下结合于四个9 9bpbp的重复序列。的重复序列。（3 3）在类组蛋白（）在类组蛋白（HUHU、ATPATP参与参与下下,Dan ADan A蛋白变性蛋白变性1313个个bpbp的重的重复序列复序列,形成开链复合物。形成开链复合物。（4 4）DnaDna B B借助于水解借助于水解ATPATP产生产生的能量在的能量在DnaDna C C的帮助下沿的帮助下沿5 5 3 3 方向移动，解开方向移动，解开DNADNA双链，双链，形成前引发复合物。形成前引发复合物。（5 5）单链结合蛋白结合于单链。）单链结合蛋白结合于单链。（6 6）引物合成酶（）引物合成酶（DnaDna G G蛋白）蛋白）开始合成开始合成RNARNA引物。引物。3、RNA引物的合成引物的合成（二）（二）链的延链的延伸伸1、冈崎片段的、冈崎片段的合成合成 真核生物的真核生物的冈崎片段为：冈崎片段为：100-200100-200bpbp 原核生物的原核生物的冈崎片段为：冈崎片段为：1000-20001000-2000bpbp2 2、DNADNA链的延伸链的延伸 在在DNADNA聚合酶聚合酶的催化下，的催化下，以四种以四种5-5-脱氧核苷三磷脱氧核苷三磷酸为底物，在酸为底物，在RNARNA引物的引物的33端以磷酸二酯键连接上端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。焦磷酸。DNADNA链的延伸同时链的延伸同时进行前导链和滞后链的合进行前导链和滞后链的合成。两条链方向相反。成。两条链方向相反。前导链前导链 滞后链滞后链 冈崎片段冈崎片段 半不连续复制半不连续复制冈崎模型冈崎模型（三）（三）DNA复制的终止复制的终止DNA复制的终点复制的终点在在DNA上上存存在在着着复复制制终终止止位位点点，某某些些蛋蛋白白因因子子可可识识别别终终止止位位点点的的序序列列，使使DNA复复制制在在终终止止位点终止。位点终止。E.coli的的DNA复制终点序列：复制终点序列：AATTAGTATGTTGTAACTAAAGTTTAATCATACAACATTGATTTCA大大肠肠杆杆菌菌的的两两个个复复制制叉叉在在相相距距终终点点100kb时时，复复制制速速度度减减慢慢，从从而而协协调调2个个复复制制叉叉到到达达的的时时间。间。大大肠肠杆杆菌菌的的两两个个复复制制叉叉在在相相 距距 终终 点点100kb时时，复复制制速速度度减减慢慢，从从而而协协调调 2个个 复复 制制叉叉到到达达的的时时间。间。DNA复复制制时时，当当RNA引引物物被被切切除除后后，中中间间所所遗遗留留的的间间隙隙由由DNA聚聚合合所所填填充充，最最后后由由连连接接酶酶封封口口。形形成成两两条条与与亲亲代代链链完完全全相相同同的的两两条条子代链。子代链。（四）、真核生物（四）、真核生物DNADNA复制复制的特点的特点4 4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核生物染色体开始复制；而在快速生长的原核生物染色体DNADNA复制复制中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用往往采用更多的复制起点更多的复制起点。1 1、真核生物染色体有多个复制起点，称为真核生物染色体有多个复制起点，称为自主复自主复制序列（制序列（ARSARS）或复制基因或复制基因(replicatorreplicator););多复制眼，多复制眼，呈双向复制，多复制子。呈双向复制，多复制子。2 2、冈崎片段长约冈崎片段长约200200bpbp。3 3、真核生物真核生物DNADNA复制速度复制速度比原核比原核慢慢，速度为，速度为1000100030003000bpbp/min(/min(仅为原核生物的仅为原核生物的1/201/201/501/50）。）。7 7、RPARPA：真核生物的单链结合蛋白。真核生物的单链结合蛋白。5 5、真核生物有真核生物有多种多种DNADNA聚合酶聚合酶,DNADNA聚合酶聚合酶（）是）是真正的复制酶，在真正的复制酶，在PCNAPCNA存在下有持续的合成能力。存在下有持续的合成能力。PCNAPCNA称为称为增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原，相当于大肠杆菌，相当于大肠杆菌DNADNA聚合聚合酶酶的的-夹子，夹子，RFCRFC蛋白相当于夹子装配器。蛋白相当于夹子装配器。6 6、真核生物线性染色体两端有真核生物线性染色体两端有端粒结构端粒结构，它是由许，它是由许多成串的重复短序列组成，端粒功能是稳定染色体末多成串的重复短序列组成，端粒功能是稳定染色体末段结构，防止染色体间的末端连接，并可补偿滞后链段结构，防止染色体间的末端连接，并可补偿滞后链5-5-末段在消除末段在消除RNARNA引物后造成的空缺，使染色体引物后造成的空缺，使染色体保保持持一定长度一定长度。端粒酶端粒酶是含一段是含一段RNARNA的逆转录酶的逆转录酶.逆转录（逆转录（reverse transcription reverse transcription）19701970年年TeminTemin等等和和BaltimoreBaltimore分别从分别从劳氏肉瘤病毒劳氏肉瘤病毒和小白鼠和小白鼠白血病病毒白血病病毒等致病等致病RNARNA病毒中分离出病毒中分离出逆转录逆转录酶酶，迄今已知的，迄今已知的致癌致癌RNARNA病毒都含有逆转录酶。病毒都含有逆转录酶。定义定义:以以RNARNA为模板，按照为模板，按照RNARNA中的核苷酸顺序合中的核苷酸顺序合成成DNADNA的过程的过程称为逆转录，由逆转录酶催化进行。称为逆转录，由逆转录酶催化进行。用用特异抑制物特异抑制物（放线菌素（放线菌素D D）能抑制致癌能抑制致癌RNARNA病毒病毒的复制，而对一般的复制，而对一般RNARNA病毒的复制无影响。已知放病毒的复制无影响。已知放线菌素线菌素D D专门抑制以专门抑制以DNADNA为模板的反应，可见为模板的反应，可见致癌致癌RNARNA病毒的复制过程必然涉及到病毒的复制过程必然涉及到DNADNA。所以所以TeminTemin于于19641964年提出年提出前病毒前病毒的假说。的假说。返回第二节第二节 逆转录逆转录 以前病毒形式整合到宿主细胞以前病毒形式整合到宿主细胞DNADNA中而使细胞恶性转化中而使细胞恶性转化单链病毒单链病毒RNARNA RNA-DNA RNA-DNA杂交分子杂交分子 双链双链DNADNA（前病毒）前病毒）逆转录酶也和逆转录酶也和DNADNA聚合酶一样，沿聚合酶一样，沿5 53 3方向合成方向合成DNADNA，底物为四种底物为四种dNTPdNTP,并要求短链并要求短链RNARNA作引物。作引物。逆转录酶是多功能酶，兼有逆转录酶是多功能酶，兼有3 3种酶的活性：种酶的活性：RNARNA指导的指导的DNADNA聚合酶活性；聚合酶活性；DNADNA指导的指导的DNADNA聚合酶活性；聚合酶活性；核糖核酸酶核糖核酸酶H H的活性，专一水解的活性，专一水解RNA-DNARNA-DNA杂交分子杂交分子中的中的RNARNA，可沿可沿5533方向起核酸外切酶的作用；方向起核酸外切酶的作用；无校对功能，错误率高，易产生变异。无校对功能，错误率高，易产生变异。+RNA+RNA+DNA-DNA-RNA+RNA+DNA-DNA-DNA+DNA+致癌致癌RNARNA病毒的逆转录过程病毒的逆转录过程 cDNAcDNA：反义反义DNA DNA 几乎所有真核生物几乎所有真核生物mRNAmRNA分子的分子的3 3末端都末端都有一段有一段polyApolyA,当加入寡聚当加入寡聚dTdT作为引物时，作为引物时，mRNAmRNA就可作为模就可作为模板，在逆转录酶催化下在体外合成与板，在逆转录酶催化下在体外合成与该该mRNAmRNA互补的互补的DNADNA，称称为为cDNAcDNA。不能把不能把“中心法则中心法则”绝对化，遗传信息也可以从绝对化，遗传信息也可以从RNARNA传递传递到到DNADNA。促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索。目前逆转录酶已经成为研究这肿瘤的防治提供了新的线索。目前逆转录酶已经成为研究这些学科的工具。些学科的工具。19831983年年,发现人类免疫缺陷病毒发现人类免疫缺陷病毒(human immune human immune deficiencedeficience virus,HIV),virus,HIV),感染感染T T淋巴细胞后即杀死细胞淋巴细胞后即杀死细胞,造成造成宿主机体免疫系统损伤宿主机体免疫系统损伤,引起艾滋病引起艾滋病(acquired acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)immunodeficiency syndrome,AIDS)，该病毒为该病毒为逆转录病毒。逆转录病毒。逆转录酶发现的理论与实践意义：逆转录酶发现的理论与实践意义：第三节第三节 DNADNA损伤与修复损伤与修复 DNA DNA在复制时产生错配在复制时产生错配，病毒基因整合病毒基因整合，某些物化因某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，都可能使都可能使DNADNA的的结构结构及功能发生改变及功能发生改变。从而引起生物突变，甚至导致从而引起生物突变，甚至导致死亡。死亡。DNA DNA的损伤的损伤基因修复“工程队”错配修复错配修复 直接修复直接修复 切除修复切除修复 重组修复重组修复 SOS修复修复 错配修复错配修复 通过一个酶系统修复通过一个酶系统修复DNADNA错配的碱基根据复制叉上错配的碱基根据复制叉上DNADNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子代链上的错配甲基化程度，切除尚未甲基化的子代链上的错配碱基碱基1 1、参与错配修复的酶与蛋白质、参与错配修复的酶与蛋白质DamDam甲基化酶甲基化酶;MutHMutH、MutLMutL、MutSMutS蛋白蛋白;解螺旋酶解螺旋酶;DNADNA聚合酶聚合酶 ;外切酶外切酶、；DNADNA连接酶连接酶 ；SSBSSB甲基化指导的甲基化指导的错配修复错配修复 甲基化指导甲基化指导的错配修复的错配修复(二二)碱基的切除修复碱基的切除修复 （1）碱基切除修复碱基切除修复(Base Excision Repair BER)DNA糖苷酶糖苷酶(glycosylase)识别损伤碱基并切开糖苷键识别损伤碱基并切开糖苷键 Ap内切酶切开内切酶切开Ap位点附近的磷酸二酯键位点附近的磷酸二酯键 DNA PolI除去除去DNA链的损伤部分链的损伤部分(5-3外切外切)并合成并合成 连接酶封闭连接酶封闭 （2）核苷酸切除修复）核苷酸切除修复(Nucleotide Excision Repair NER)uvrABC核酸酶切下含有损伤部位的一段核酸酶切下含有损伤部位的一段DNA片段片段(约约12Nt)，DNA PolI填补缺口，连接酶封闭切口填补缺口，连接酶封闭切口 切切除除修修复复对对多多种种 DNA损损伤伤包包括括碱碱基基脱脱落落形形成成的的无无碱碱基基位位点、嘧啶二聚体、碱基烷基化、单链断裂等都能起修复作用。点、嘧啶二聚体、碱基烷基化、单链断裂等都能起修复作用。DNADNA解螺旋酶解螺旋酶（三）直接修复（三）直接修复（四）重组修复（四）重组修复(recombinational repair)重重组组修修复复不不能能完完全全去去除除损损伤伤，损损伤伤的的DNA段段落落仍仍然然保保留留在在亲亲代代DNA链链上上，只只是是重重组组修修复复后后合合成成的的DNA分分子子是是不不带带有有损损伤伤的的，但但经经多多次次复复制制后后，损损伤伤就就被被“冲冲淡淡”了了，在在子代细胞中只有一个细胞是带有损伤子代细胞中只有一个细胞是带有损伤DNA的。的。（六）（六）SOSSOS反应和诱导修复（易错修复）反应和诱导修复（易错修复）SOS SOS反应：反应：细胞细胞DNADNA受到严重损伤或受到严重损伤或DNADNA复制系统受复制系统受到抑制的紧急状态下，为求生存而出现的应急反应。到抑制的紧急状态下，为求生存而出现的应急反应。SOS SOS反应包括反应包括:避免差错的修复能力增强避免差错的修复能力增强诱导产生无校正功能的诱导产生无校正功能的DNADNA聚合酶合成聚合酶合成抑制细胞分裂抑制细胞分裂 SOS SOS反应是生物反应是生物在不利环境中求得生存在不利环境中求得生存的一种基本的一种基本功能。对原核生物它产生高变异，对高等动物则是致功能。对原核生物它产生高变异，对高等动物则是致癌的。癌的。第四节第四节 DNADNA复制的精确性（高保真复制）复制的精确性（高保真复制）1 1、碱基的配对规律：、碱基的配对规律：摸板链与新生链之间的碱基配摸板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为对保证碱基配错几率约为1/101/104 41/101/105 5。2 2、DNADNA聚合酶的聚合酶的3 355外切酶活性的校对功能，外切酶活性的校对功能，使使碱基的错配几率又降低碱基的错配几率又降低10010010001000倍。倍。3 3、DNADNA的损伤修复系统。的损伤修复系统。DNA DNA复制必须具有复制必须具有高度精确性高度精确性，在大肠杆菌的细胞，在大肠杆菌的细胞DNADNA复制中其复制中其错误率约为错误率约为1/101/109 91/101/101010，即每即每10109 910101010个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色体体DNADNA复制复制100010001000010000次才出现一个核苷酸的错误。次才出现一个核苷酸的错误。这么高的精确性的保证主要与下列因素有关：这么高的精确性的保证主要与下列因素有关：（一）名词解释1.半保留复制；2.冈崎片段；(二)、单选题1DNA复制时，下列哪一种酶是不需要的ADNA指导的DNA聚合酶 BDNA连接酶 C拓朴异构酶 D解链酶 E限制性内切酶2.DNA复制时，子链的合成是A.一条链53，另一条链35 B两条链均为35 C两条链均为53 D两条链均为连续合成 E两条链均为不连续合成3.在E.coli细胞中DNA聚合酶的作用主要是A.DNA复制 B.E.coliDNA合成的起始 C.切除RNA引物 D.冈崎片段的连接