生物化学实验课件2(动态).ppt

生物化学实验生物化学实验河南工业大学生物工程学院河南工业大学生物工程学院生物技术系生物技术系 2015.3 Henan University of Technology实验内容实验内容1.1.淀粉含量测定淀粉含量测定2.2.氨基酸的纸上层析氨基酸的纸上层析3.蛋白质分子量测定蛋白质分子量测定4.淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定5.蛋白质含量测定蛋白质含量测定1.6.甲醛滴定测氨基氮甲醛滴定测氨基氮2.7.酵母酵母RNA的提取、组分鉴定和含量测定的提取、组分鉴定和含量测定3.8.赖氨酸含量测定赖氨酸含量测定9.凝胶层析法分离蛋白质凝胶层析法分离蛋白质10.蔗糖酶的提取与部分纯化蔗糖酶的提取与部分纯化11.蔗糖酶活力的测定蔗糖酶活力的测定12.Bradford法测定蛋白质含量法测定蛋白质含量教学目的教学目的生生物物化化学学是是专专业业基基础础实实验验课课，其其先先修修课课程程为为无无机机化化学学、分分析析化化学学和和有有机机化化学学。其其目目的的是是：学习和掌握生物技术，培养动手观察和思维能力。学习和掌握生物技术，培养动手观察和思维能力。学习方法学习方法1 1、预预习习：实实验验前前必必须须进进行行充充分分的的预预习习和和准准备备，并并写写出出预预习习报报告告，做做到到心心中中有数，这是做好实验的前提有数，这是做好实验的前提。2 2、操操作作：应应按按拟拟定定的的实实验验操操作作计计划划与与方方案案进进行行。做做到到轻轻（动动作作轻轻、讲讲话话轻轻），细细（细细心心观观察察、细细致致操操作作），准准（试试剂剂用用量量准准确确、结结果果及及其其记记录录准准确确），洁（使用的仪器清洁，实验桌面整洁，实验结束把实验室打扫清洁）。，洁（使用的仪器清洁，实验桌面整洁，实验结束把实验室打扫清洁）。3 3、在在实实验验全全过过程程中中，应应集集中中注注意意力力，独独立立思思考考解解决决问问题题。自自己己难难以以解解释释时时可请老师解答。可请老师解答。4 4、写写实实验验报报告告：做做完完实实验验后后，应应解解释释实实验验现现象象，并并作作出出结结论论，或或根根据据实实验验数数据据进进行行计计算算和和处处理理。主主要要包包括括：a a、目目的的，b b、原原理理，c c、操操作作步步骤骤及及实实验验性性质质、现现象象，d d、数数据据处处理理（含含误误差差原原因因及及分分析析），e e、讨讨论论，f f、思思考考题回答。题回答。实验室守则实验室守则生物化学实验室守则是学生实验正常进行的保证，学生进入实验室必须遵守生物化学实验室守则是学生实验正常进行的保证，学生进入实验室必须遵守以下规则：以下规则：1.进入实验室，须遵守实验室纪律和制度，听从老师指导进入实验室，须遵守实验室纪律和制度，听从老师指导2.未穿实验服、未写实验预习报告者不得进入实验室进行实验。未穿实验服、未写实验预习报告者不得进入实验室进行实验。3.进入实验室后，要熟悉周围环境，熟悉防火及急救设备器材的使用方法和存放位置，进入实验室后，要熟悉周围环境，熟悉防火及急救设备器材的使用方法和存放位置，遵守安全规则。遵守安全规则。4.实验前，清点、检查仪器、明确仪器规范操作方法及注意事项，否则不得动手操作。实验前，清点、检查仪器、明确仪器规范操作方法及注意事项，否则不得动手操作。5.使用药品时，要求明确其性质及使用方法后，据实验要求规范使用。禁止使用不明确使用药品时，要求明确其性质及使用方法后，据实验要求规范使用。禁止使用不明确药品或随意混合药品药品或随意混合药品。6.实验中，保持安静，认真操作，仔细观察，积极思维，实验中，保持安静，认真操作，仔细观察，积极思维，实验过程中必须有原始记录实验过程中必须有原始记录，不得擅自离开岗位。不得擅自离开岗位。7.实验室公用物品（包括器材、药品等）用完后，应归放回原指定位实验室公用物品（包括器材、药品等）用完后，应归放回原指定位置。置。实验废液、废实验废液、废物按要求放入指定收集器皿。物按要求放入指定收集器皿。8.爱护公物，注意卫生，保持整洁，节约用水、电、气及器材。爱护公物，注意卫生，保持整洁，节约用水、电、气及器材。9.实验完毕后，要求整理、清洁实验台面，检查水、电、气源，打扫实验室卫生。实验完毕后，要求整理、清洁实验台面，检查水、电、气源，打扫实验室卫生。10.实验记录经教师签名认可后，方可离开实验室。实验记录经教师签名认可后，方可离开实验室。实验一淀粉含量测定实验一淀粉含量测定一、实验目的一、实验目的1.掌握旋光仪的操作使用。掌握旋光仪的操作使用。2.了解旋光法测粗淀粉的基本原理。了解旋光法测粗淀粉的基本原理。二、实验原理二、实验原理 v在在加加热热及及稀稀盐盐酸酸的的作作用用下下，淀淀粉粉水水解解并并转转入入盐盐酸酸溶溶液液中中。在在一一定定的的水水解解条条件件下下，不不同同谷谷物物淀淀粉粉的的比比旋旋光光度度是是不不同同的的。其其在在171195之之间间，因因此此可可用用旋旋光法测定粗淀粉的含量。光法测定粗淀粉的含量。三、实验仪器和试剂三、实验仪器和试剂1、主要、主要仪器：仪器：（1）旋光仪旋光仪（2）电子）电子天平（感量天平（感量0.0001g）2、试剂：试剂：1盐酸溶液盐酸溶液30硫酸锌溶液。硫酸锌溶液。15亚铁氰化钾溶液。亚铁氰化钾溶液。四、实验步骤四、实验步骤1.样品的处理样品的处理在电子天平上称取小麦粉在电子天平上称取小麦粉2.5000g置于三角瓶中置于三角瓶中加入加入50mL1%HCl混成浆状（不能有结块）混成浆状（不能有结块）沸水浴中准确加热沸水浴中准确加热15min先加先加1mL30%ZnSO4混匀混匀再加再加1mL15%亚铁氰亚铁氰化钾混匀化钾混匀移至移至100mL容量瓶中加水定容混匀后过滤容量瓶中加水定容混匀后过滤弃去弃去最初最初15mL收集其余滤液收集其余滤液。2.旋光度测定旋光度测定取滤液取滤液20mL置于旋光管中，先用置于旋光管中，先用1%HCl调节旋光仪调节旋光仪“0”点，然后将样品溶液放入旋光仪中测点，然后将样品溶液放入旋光仪中测v五五、结果计算结果计算其中其中：六、思考题六、思考题v样样品品加加盐盐酸酸处处理理时时，煮煮沸沸时时间间少少于于或或多多于于15min会会对对测测定定结果产生什么影响？结果产生什么影响？实验二实验二氨基酸的纸上层析氨基酸的纸上层析一、实验目的一、实验目的通过对氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。通过对氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。二、实验原理二、实验原理纸纸层层析析是是以以滤滤纸纸作作为为惰惰性性支支持持物物的的分分配配层层析析，滤滤纸纸纤纤维维上上的的OH具具有有亲亲水水性性，因因此此能能吸吸附附一一层层水水作作为为固固定定相相，而而通通常常把把有有机机溶溶剂剂作作为为流流动动相相。有有机机溶溶剂剂自自上上而而下下流流动动，称称为为下下行行层层析析；自自下下而而上上流流动动，称称为为上上行行层层析析。流流动动相相流流经经支支持持物物时时与与固固定定相相之之间间连连续续抽抽提提，使使物物质质在在两两相相之之间间不不断断分分配配而而得得到到分离。分离。三、仪器和试剂三、仪器和试剂1、主要、主要仪器：仪器：（1）层析缸）层析缸（2）微量进样器微量进样器（3）喷雾器）喷雾器2、试剂试剂：（1）展）展开开剂：剂：乙醇：水：冰乙酸乙醇：水：冰乙酸50:10:1（2）氨基酸溶液：）氨基酸溶液：0.5%的赖氨酸、脯氨酸、的赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸苯丙氨酸溶液溶液及它们的混合液及它们的混合液（3）显色剂：）显色剂：0.1%水合茚三酮丙酮溶液。水合茚三酮丙酮溶液。四、实验步骤四、实验步骤1、平平衡衡：将将展展开开剂剂（乙乙醇醇：水水：冰冰乙乙酸酸50:10:1）放放入入培培养养皿中置于密闭容器内使其充满展开剂（皿中置于密闭容器内使其充满展开剂（24h左右）左右）2、点点样样：取取滤滤纸纸1张张用用铅铅笔笔在在距距下下方方2cm处处划划线线并并将将所所得得线线段段分分成成5等等分分从从而而得得到到4个个标标记记点点，用用微微量量进进样样器器分分别别取取5L下下列列样样品品phelyspro混混合合Aa向向4个个标标记记点点上上加加样样（样样品品扩扩散中散中1cm）3、展展层层：将将滤滤纸纸卷卷成成筒筒状状且且不不能能够够重重叠叠，并并用用棉棉线线扎扎紧紧然然后后垂垂直直放放入入培培养养皿皿中中进进行行展展层层2h（当当展展开开剂剂沿沿到到达达滤滤纸纸长长度度三三分分之之二时，即可取出）测量展开剂前沿移动距离（二时，即可取出）测量展开剂前沿移动距离（a）4、显显色色：用用0.1%茚茚三三酮酮-丙丙酮酮溶溶液液朝朝点点样样面面喷喷雾雾（不不要要喷喷得得太太多多）然然后后将将滤滤纸纸置置于于电电炉炉上上方方20cm处处加加热热直直至至斑斑点点出出现现为为止止，测量各斑点中心到点样点距离（测量各斑点中心到点样点距离（b）v1计算出各种氨基酸的计算出各种氨基酸的Rf值，并根据值，并根据Rf值鉴定出混值鉴定出混合氨基酸中的各组分，在层析图谱上标出各氨基酸合氨基酸中的各组分，在层析图谱上标出各氨基酸名称。名称。v2对氨基酸移动快慢的原因给予简要分析。对氨基酸移动快慢的原因给予简要分析。五、结果计算五、结果计算六、思考题六、思考题实验三蛋白质分子量测定实验三蛋白质分子量测定一、实验目的一、实验目的掌掌握握电电泳泳基基本本原原理理、分分类类、影影响响因因素素,SDS-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶电泳用途胶电泳用途,凝胶制备凝胶制备。二、实验原理二、实验原理 聚丙烯聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量的方法，酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量的方法，主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。在聚丙烯酰胺凝胶在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），使所有蛋），使所有蛋白质颗粒表面覆盖一层白质颗粒表面覆盖一层SDS分子，导致蛋白质分子间原有的分子，导致蛋白质分子间原有的电荷差异消失，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于电荷差异消失，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小。当蛋白质的分子量在它的分子量大小。当蛋白质的分子量在15000200000之间之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关系时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关系。三、仪器和试剂三、仪器和试剂1主要仪器主要仪器（1）电泳仪电泳仪（2）电泳槽电泳槽2.试剂试剂（1）电极缓冲液）电极缓冲液（2）pH7.2凝胶缓冲液凝胶缓冲液（3）1%TEMED，（4）30%凝胶凝胶储储液，液，（5）10%过硫酸铵过硫酸铵（6）0.1%考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250染色液染色液（7）10%乙酸乙酸脱色液脱色液四、实验步骤四、实验步骤1.电泳槽的安装：取两块玻璃板电泳槽的安装：取两块玻璃板将带玻璃条的板（高板）放置桌面上将带玻璃条的板（高板）放置桌面上在上面放置在上面放置“U”型橡胶条型橡胶条最后将凹槽玻璃板（低板）压在高板上，置最后将凹槽玻璃板（低板）压在高板上，置于电泳槽内，用锲子压紧。于电泳槽内，用锲子压紧。2.凝胶液的制备与灌装：配置凝胶液的制备与灌装：配置20mL凝胶液：在小烧杯中依次加入凝胶液：在小烧杯中依次加入5mL30%凝胶凝胶储储液，液，10mLpH7.2凝胶缓冲液凝胶缓冲液(用前混匀再取用前混匀再取)，2mL1%TEMED，2.6mL重蒸重蒸水，水，0.4mL10%过硫酸铵混匀过硫酸铵混匀后后立即沿高板立即沿高板内侧倒凝胶液于两板之间直至低板上沿内侧倒凝胶液于两板之间直至低板上沿插上梳子插上梳子置于置于30C培养箱中培养箱中放放置置15min，待胶凝后取下，待胶凝后取下“U”条条重新将胶板放置于电泳槽内重新将胶板放置于电泳槽内向外槽向外槽内加三分之一槽深电极缓冲液内加三分之一槽深电极缓冲液向内槽加入电极缓冲液没过低板向内槽加入电极缓冲液没过低板最后最后拔出梳子。拔出梳子。3.加样：用微量进样器加入加样：用微量进样器加入10L标准蛋白于中间胶槽内标准蛋白于中间胶槽内其余槽内加入其余槽内加入10L下列样品下列样品牛血清蛋白牛血清蛋白绿豆分绿豆分离离蛋白蛋白4.电泳：连接电极线，高板外侧接正极，低板内侧槽接负极，打开电源电泳：连接电极线，高板外侧接正极，低板内侧槽接负极，打开电源调电流调电流120mA电泳电泳2h（当指示剂前沿超过二分之一胶长时停止）（当指示剂前沿超过二分之一胶长时停止）5.剥胶：取下胶板倒去电极缓冲液剥胶：取下胶板倒去电极缓冲液测测量指示剂迁移距离和染色前胶长，量指示剂迁移距离和染色前胶长，然后将胶板置于水龙头下方冲玻板四周直至胶与玻璃板然后将胶板置于水龙头下方冲玻板四周直至胶与玻璃板分分离离6.染色与固定：将胶板放入染色盒内染色与固定：将胶板放入染色盒内向其中加入向其中加入0.1%考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250使使其浸没置于摇床上染色过夜其浸没置于摇床上染色过夜7.脱色：用脱色：用10%乙酸溶液脱色至谱带清晰，测定脱色后胶长及各谱带迁移乙酸溶液脱色至谱带清晰，测定脱色后胶长及各谱带迁移距离。距离。五五、结果计算结果计算1、计算相对迁移率：、计算相对迁移率：2、以相对迁移率、以相对迁移率MR为横坐标、为横坐标、LgMr为纵坐标，为纵坐标，作出分子量标准曲线。作出分子量标准曲线。3、求分子量、求分子量五、注意事项五、注意事项v130%Acr-Bis是神经毒化合物，操作时要小心，做好个是神经毒化合物，操作时要小心，做好个人防护人防护v2过硫酸铵需现用现配过硫酸铵需现用现配v3过硫酸铵和过硫酸铵和TEMED在灌胶前加入即可在灌胶前加入即可v4用微量加样器上样时，勿刺破胶面用微量加样器上样时，勿刺破胶面根据本实验所学知识，自行设计豌豆凝集素的分离纯化实验。根据本实验所学知识，自行设计豌豆凝集素的分离纯化实验。六、思考题六、思考题实验四淀粉酶活力测定实验四淀粉酶活力测定一、实验目的一、实验目的学学习习和和掌掌握握测测定定淀淀粉粉酶酶（包包括括-淀淀粉粉酶酶和和-淀淀粉粉酶酶）活活力力的原理和方法。的原理和方法。二、实验原理二、实验原理淀淀粉粉酶酶主主要要包包括括-淀淀粉粉酶酶和和-淀淀粉粉酶酶两两种种。-淀淀粉粉酶酶可可作作用用于于淀淀粉粉中中的的-1,4-糖糖苷苷键键，生生成成葡葡萄萄糖糖、麦麦芽芽糖糖、麦麦芽芽三三糖糖、糊糊精精等等还还原原糖糖，-淀淀粉粉酶酶可可从从淀淀粉粉的的非非还还原原性性末末端端进进行行水水解解，生生成成麦麦芽芽糖糖。淀淀粉粉酶酶催催化化产产生生的的这这些些还还原原糖糖能能使使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基氨基-5-硝基水杨酸硝基水杨酸。其反应如其反应如右图右图：淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。糖的量表示酶活力。淀粉酶存在于萌发后的禾谷类种子中，其中主要是淀粉酶存在于萌发后的禾谷类种子中，其中主要是-淀粉酶淀粉酶和和-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，-淀粉酶不耐酸，在淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。以下迅速钝化。-淀粉酶不耐热，在淀粉酶不耐热，在7015min钝化。钝化。根据它们的这种特性，采用加热的方法钝化根据它们的这种特性，采用加热的方法钝化-淀粉酶，测出淀粉酶，测出-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（-淀粉酶淀粉酶活力活力+-淀粉酶活力），再减去淀粉酶活力），再减去-淀粉酶的活力，就可求出淀粉酶的活力，就可求出-淀粉酶的活力。淀粉酶的活力。三、仪器和试剂三、仪器和试剂v主要主要仪器：仪器：v（1）离心机）离心机v（2）分光光度计）分光光度计v试剂试剂v（1）标准麦芽糖溶液（）标准麦芽糖溶液（2mg/mL）v（2）1%3,5-二硝基水杨酸试剂二硝基水杨酸试剂v（3）1%淀粉淀粉四、操作步骤四、操作步骤以麦芽糖含量以麦芽糖含量（mg）为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。1标准曲线的制作标准曲线的制作（每（每2组组4人做人做1标准曲线）标准曲线）2.淀粉酶液的制备：淀粉酶液的制备：在电子天平上称取小麦芽（在在电子天平上称取小麦芽（在9428冰箱内，用后放回）冰箱内，用后放回）0.5g置于研钵中置于研钵中加加20mL水研成浆状水研成浆状转移至离心管中转移至离心管中2000转转/分离心分离心5min（注意离心前（注意离心前对称放置的离心管应在天平上平衡）对称放置的离心管应在天平上平衡）取上清液于取上清液于100mL容量瓶中加水容量瓶中加水定容混匀定容混匀即得淀粉酶原液即得淀粉酶原液用于用于-淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定吸取原液吸取原液5mL于于100mL容量瓶中加水定容即得淀粉酶稀释液容量瓶中加水定容即得淀粉酶稀释液用于总酶用于总酶活力测定。活力测定。3.淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定-淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定吸取原液吸取原液1mL于具塞试管中于具塞试管中70保温保温15min用于钝化用于钝化-淀粉酶淀粉酶加加1mL1%淀粉置于淀粉置于40水浴中保温水浴中保温5min加加1%3.5一二硝基水杨酸一二硝基水杨酸2mL沸水加热沸水加热5min后加水至后加水至20mL混匀测混匀测A1（用用1#管调零管调零）总酶活力测定总酶活力测定吸取稀释液吸取稀释液1mL于具塞试管中于具塞试管中加加1mL1%淀粉淀粉40保存保存5min加入加入1%3.5一二硝基水杨酸一二硝基水杨酸2mL沸水加热沸水加热5min后加水至后加水至20mL混匀测混匀测A2（用用1#管管调零调零）五、结果计算五、结果计算-淀粉酶活力（淀粉酶活力（）淀粉酶总活力）淀粉酶总活力-淀淀粉酶活力粉酶活力六、附六、附注注v1样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定。料酶活性的大小而定。v2为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准确记录时间，到达确记录时间，到达5min时取出试管，立即加入时取出试管，立即加入3,5-二硝基二硝基水杨酸以终止酶反应，以便尽量减小因各试管保温时间不水杨酸以终止酶反应，以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。同时恒温水浴温度变化应不超过同而引起的误差。同时恒温水浴温度变化应不超过0.5。v3如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，例如萌如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，例如萌发发1d、2d、3d、4d的小麦种子，比较测定结果，以了解的小麦种子，比较测定结果，以了解萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化。萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化。七、思考题七、思考题v1为什么要将试管中的淀粉酶原液置为什么要将试管中的淀粉酶原液置70水浴中水浴中保温保温15min？v2为什么要将各试管中的淀粉酶原液和为什么要将各试管中的淀粉酶原液和1%淀粉淀粉溶液分别置于溶液分别置于40水浴中保温？水浴中保温？实验五蛋白质含量的测定实验五蛋白质含量的测定一、实验目的一、实验目的学习凯氏定氮法的原理和操作技术。学习凯氏定氮法的原理和操作技术。二、实验原理二、实验原理含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定浓度的过量硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中氢离子浓度降馏到一定浓度的过量硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直到恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最低，然后用标准无机酸滴定，直到恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测后根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测物中的总氮量。物中的总氮量。二、实验原理二、实验原理含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。用生成硫酸铵。浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定浓度的过量硼酸溶液中，硼酸吸收氨将产生的氨蒸馏到一定浓度的过量硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直到后使溶液中氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直到恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测物中的总氮尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测物中的总氮量。量。三、实验试剂、器材三、实验试剂、器材1主要仪主要仪器器v(1)凯氏定氮蒸馏装置凯氏定氮蒸馏装置v(2)消化炉消化炉v(3)电子电子天平天平2试剂试剂v(1)浓硫酸（化学纯）浓硫酸（化学纯）v(2)硫酸钾硫酸钾-硫酸铜混合硫酸铜混合催化剂催化剂v(3)甲基红甲基红-溴甲酚绿混合指剂溴甲酚绿混合指剂v(4)2%硼酸溶液硼酸溶液v(5)0.01mol/LHCl标准盐酸溶液标准盐酸溶液v(6)40%NaOH四、操作步骤四、操作步骤v1、消化：在电子天平上称取小麦粉、消化：在电子天平上称取小麦粉0.2000g-0.4000g置于凯氏试管底部置于凯氏试管底部加混加混合混合催化剂合混合催化剂0.5g和和3mL浓硫酸置于消化炉中高温加热至淡绿色透明（浓硫酸置于消化炉中高温加热至淡绿色透明（2h左右）左右）取出放入通风橱内至不冒白烟，向其中加取出放入通风橱内至不冒白烟，向其中加20mL水，并移至水，并移至100mL容量瓶定容容量瓶定容即得样品消化液。即得样品消化液。v同时每同时每4组组8人做人做1空白实验：空白实验：0.5g混合催化剂混合催化剂+3mL浓硫酸置于凯氏试管中放入浓硫酸置于凯氏试管中放入消化炉加热至淡绿色（消化炉加热至淡绿色（1h左右）左右）冷却后加水移入冷却后加水移入100mL容量瓶中定容得空白容量瓶中定容得空白消化液。消化液。v2.蒸馏与吸收：吸取蒸馏与吸收：吸取10mL2%的硼酸于三角瓶中的硼酸于三角瓶中加加4d甲基红甲基红-溴甲酚绿混合溴甲酚绿混合指示剂（若变绿色则用指示剂（若变绿色则用0.01mol/LHCl调至紫红色）。将其置于冷凝管下端并使调至紫红色）。将其置于冷凝管下端并使管尖插入液面以下，再吸取管尖插入液面以下，再吸取5mL消化液从漏斗上方加入蒸馏室内用水洗两次，消化液从漏斗上方加入蒸馏室内用水洗两次，并加入并加入10mL40%NaOH后水封（注意：勿使漏斗内玻杆取下以防漏气），然后后水封（注意：勿使漏斗内玻杆取下以防漏气），然后打开通气阀进行加热蒸馏，直至吸收液由紫红色变成绿色，计时蒸馏打开通气阀进行加热蒸馏，直至吸收液由紫红色变成绿色，计时蒸馏3min先先移去吸收液再停止加热以防倒吸。移去吸收液再停止加热以防倒吸。v3.滴定：用滴定：用0.01mol/LHCl滴定吸收液由绿色退去变红色为止，记下耗去标准滴定吸收液由绿色退去变红色为止，记下耗去标准盐酸的体积盐酸的体积(V1.V0)。vC：标准盐酸溶液摩尔浓度：标准盐酸溶液摩尔浓度(0.01)。vV1：滴定样品用去的盐酸溶液平均毫升数。：滴定样品用去的盐酸溶液平均毫升数。vV0：滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均毫升数。：滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均毫升数。vW：样品重量（：样品重量（mg）。）。v14.01：氮的原子量。：氮的原子量。vK=5.7vM=12.5%vV2=100mLvV3=5mL五、结果计算五、结果计算实验六实验六甲醛滴定测氨基氮甲醛滴定测氨基氮 一、实验目的一、实验目的v1加深对氨基酸两性解离的认识。加深对氨基酸两性解离的认识。v2掌握甲醛滴定法的原理及应用。掌握甲醛滴定法的原理及应用。三、实验仪器、试剂及材料三、实验仪器、试剂及材料1.实验仪器：实验仪器：v微量碱式滴定管（微量碱式滴定管（10mL）、）、2.试剂：试剂：v(1)0.5酚酞指示剂：。酚酞指示剂：。v(2)1甘氨酸甘氨酸即即1克加克加100mL水配制而成水配制而成v(3)0.1molL标准氢氧化钠溶液（使用前需标定）。标准氢氧化钠溶液（使用前需标定）。v(4)中性甲醛溶液：取分析纯甲醛中性甲醛溶液：取分析纯甲醛(3637)溶液溶液20mL，加，加0.5酚酞指示剂约酚酞指示剂约3滴滴，滴加，滴加0.100molL的氢的氢氧化钠溶液，使溶液呈微粉红色（临用前中和）。氧化钠溶液，使溶液呈微粉红色（临用前中和）。v氨基酸为两性离子，在水溶液中有下列平衡：氨基酸为两性离子，在水溶液中有下列平衡：vRCHCOO-+2HCHORCHCOO-+H+vvNH3+N(CH2OH)2vv常温下甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合生成亚羟甲基化合物，常温下甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合生成亚羟甲基化合物，使上述平衡右移促使使上述平衡右移促使NH3+释放释放H+，从而使溶液酸度增加，从而使溶液酸度增加，滴定终点移至酚酞的变色域内（滴定终点移至酚酞的变色域内（pH值值9.0左右），左右），根据滴定根据滴定终点时所消耗标准碱的量即可算出反应体系中存在的游离氨终点时所消耗标准碱的量即可算出反应体系中存在的游离氨基即氨基氮的含量如果样品为一种已知的氨基酸，即可算出基即氨基氮的含量如果样品为一种已知的氨基酸，即可算出该氨基酸的含量。如果样品为未知氨基酸或几种氨基酸的混该氨基酸的含量。如果样品为未知氨基酸或几种氨基酸的混合物，则只能算出其氨基氮的含量。合物，则只能算出其氨基氮的含量。二、实验原理二、实验原理四、操作方法四、操作方法v已知氨基酸溶液中氨基酸含量的测定已知氨基酸溶液中氨基酸含量的测定:v取取3只三角瓶编号只三角瓶编号2mL1%甘氨酸甘氨酸2mL1%甘甘氨酸氨酸2mL水（空白）水（空白）v均加均加5mL水和水和5mL中性甲醛（用前加中性甲醛（用前加2滴滴0.5%酚酚酞滴加酞滴加0.1mol/LNaOH调至淡红色），及调至淡红色），及4滴滴0.5%酚酞混匀酚酞混匀用用0.1mol/L滴至粉红色出现为止滴至粉红色出现为止分别分别记下耗去标准碱的体积记下耗去标准碱的体积(V1.V2.V0）五、结果处理与计算五、结果处理与计算式中：式中：V：滴定样品所消耗标准碱的：滴定样品所消耗标准碱的平均平均体积（体积（mL）。）。V0：滴定空白所消耗标准碱的体积（：滴定空白所消耗标准碱的体积（mL）。）。C：滴定时用标准氢氧化钠的浓度（：滴定时用标准氢氧化钠的浓度（0.1molL）.14.01：氮的：氮的摩尔摩尔质量。质量。v说明：说明：v1.本法优点是简单快速，缺点是不够准确，其准本法优点是简单快速，缺点是不够准确，其准确度仅达到氨基酸或氨基氮理论含量的确度仅达到氨基酸或氨基氮理论含量的90。而。而且，如果样品液中含有脯氨酸或酪氨酸时滴定误差且，如果样品液中含有脯氨酸或酪氨酸时滴定误差更大，因为脯氨酸与甲醛作用后生成不稳定化合物更大，因为脯氨酸与甲醛作用后生成不稳定化合物使结果偏低，酪氨酸的酚基结构又使结果偏高。使结果偏低，酪氨酸的酚基结构又使结果偏高。v2甲醛滴定法常用以测定蛋白质的水解程度。甲醛滴定法常用以测定蛋白质的水解程度。v3中性甲醛需临用前配制。放置一段时间后，中性甲醛需临用前配制。放置一段时间后，在使用前需重新中和。在使用前需重新中和。六、思考题六、思考题为什么说甲醛滴定法可以测定蛋白为什么说甲醛滴定法可以测定蛋白质的水解程度？除此之外还有哪些质的水解程度？除此之外还有哪些方法可以用来测定蛋白质的水解程方法可以用来测定蛋白质的水解程度？度？实验七酵母实验七酵母RNA的提取、组分鉴定和含的提取、组分鉴定和含量测定量测定一、实验目的一、实验目的v（1）了解并掌握稀碱法提取酵母）了解并掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。的原理和方法。v（2）了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。）了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。v（3）掌握地衣酚显色法测定酵母）掌握地衣酚显色法测定酵母RNA含量的原理和方法含量的原理和方法二、实验原理二、实验原理v酵母含酵母含RNA达达2.6710.0%，以酵母为原料使用稀碱使酵，以酵母为原料使用稀碱使酵母裂解，然后用酸中和母裂解，然后用酸中和,除去蛋白质和菌体后的上清液用乙除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀醇沉淀RNA。由此得到的。由此得到的RNA为变性的为变性的RNA，可用作制备，可用作制备核苷酸的原料。核苷酸的原料。用硫酸水解用硫酸水解RNA后后,可生成磷酸、戊糖和碱基可生成磷酸、戊糖和碱基,各成分用各成分用以下反应加以鉴定：以下反应加以鉴定：（1）磷酸与钼酸铵试剂作用可生成黄色磷钼酸铵沉淀。）磷酸与钼酸铵试剂作用可生成黄色磷钼酸铵沉淀。（2）核糖与地衣酚试剂作用呈鲜绿色。）核糖与地衣酚试剂作用呈鲜绿色。（3）嘌呤碱与硝酸银反应可生成白色的嘌呤银化物沉淀。）嘌呤碱与硝酸银反应可生成白色的嘌呤银化物沉淀。vRNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与成糠醛，后者与3，5-二羟甲苯（地衣酚或苔黑酚）反应呈二羟甲苯（地衣酚或苔黑酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁和氯化铜作催化剂，反应产鲜绿色，该反应需用三氯化铁和氯化铜作催化剂，反应产物在物在670nm处有最大吸收。处有最大吸收。RNA在在20250微克范围内，微克范围内，光吸收与光吸收与RNA浓度浓度成正比。成正比。三、仪器和试剂三、仪器和试剂v1.主要试剂主要试剂v（1）酵母粉）酵母粉v（2）0.04MNaOH溶液溶液v（3）1.5M硫酸硫酸v（4）无水乙醚）无水乙醚v（5）95乙醇乙醇v（6）浓氨水）浓氨水v（7）酸性乙醇溶液）酸性乙醇溶液v（8）浓硝酸）浓硝酸v（9）0.1MAgNO3v（10）三氯化铁）三氯化铁-盐酸溶液。盐酸溶液。v（11）钼酸铵试剂）钼酸铵试剂v（12）50ugmLRNA标准溶液标准溶液v（13）苔黑酚）苔黑酚(3,5-二羟基甲苯二羟基甲苯)乙醇溶液乙醇溶液v（14）地衣酚）地衣酚-铜离子试剂铜离子试剂v2、器材：、器材：v（1）离心机）离心机v（2）分光光度计）分光光度计v（3）抽滤装置。）抽滤装置。v（4）电子天平电子天平四、实验步骤四、实验步骤v1、酵母、酵母RNA提取提取v称称5g干酵母粉干酵母粉于研钵于研钵中中加入加入20mL0.04MNaOH溶液并研成浆状溶液并研成浆状后后转入转入三角烧瓶中三角烧瓶中，再用再用10mL0.04MNaOH溶液洗涤并转入三角烧瓶中，沸溶液洗涤并转入三角烧瓶中，沸水浴加热水浴加热30min，冷却，冷却后后转入离心管转入离心管并用并用5mL0.04MNaOH溶溶液洗涤液洗涤三角三角瓶瓶,3000r/min离心离心15min，将上清慢慢倾入，将上清慢慢倾入10mL酸性乙醇酸性乙醇的烧杯中的烧杯中，边加边搅动。静置边加边搅动。静置1min待待RNA沉淀完全后，沉淀完全后，3000r/min离心离心3min。弃去。弃去上清液上清液，用药勺将沉淀取出放入，用药勺将沉淀取出放入布氏漏斗布氏漏斗中（漏斗内有已中（漏斗内有已称重称重W1滤纸滤纸）抽滤抽滤，先，先用用95乙醇乙醇10mL洗涤沉淀洗涤沉淀，再用乙醚再用乙醚10mL洗涤沉淀，沉淀洗涤沉淀，沉淀在空气中干燥在空气中干燥30min后，再至于电炉上方后，再至于电炉上方20cm处干燥至恒重处干燥至恒重。称量所得。称量所得RNA粗品和滤纸重粗品和滤纸重W2。W2-W1即为粗即为粗提提RNA重量重量v2.RNA含量测定含量测定v（1）标准曲线的制作：（每）标准曲线的制作：（每4组组8人做人做1标准曲线）标准曲线）v以以RNA微克数为横坐标，以微克数为横坐标，以A670为纵坐标绘制标准曲线为纵坐标绘制标准曲线。v（2）样品的处理：）样品的处理：v称取称取10mg粗提的酵母粗提的酵母RNA加入加入10mL0.04MNaOH溶溶解后转移至解后转移至100mL容量瓶中加水定容容量瓶中加水定容混匀即得样混匀即得样品液品液.v（3）酵母）酵母RNA含量测定：含量测定：v取试管取试管1支加入支加入2mL样品液，再加样品液，再加2mL地衣酚地衣酚-铜试铜试剂沸水加热剂沸水加热25分钟冷却后测定分钟冷却后测定A(用用1号调零号调零)v3、酵母、酵母RNA水解水解v取取100mg粗提的酵母粗提的酵母RNA于三角瓶中，加入于三角瓶中，加入1.5M硫酸硫酸10mL,沸水浴加热沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。v4、RNA组份鉴定组份鉴定v（1）嘌呤碱：）嘌呤碱：v取水解液取水解液1mL于试管中滴加入于试管中滴加入2mL浓氨水。然后加入浓氨水。然后加入10滴滴0.1M硝酸银溶液，观察有无白色嘌呤碱银化合物沉淀。硝酸银溶液，观察有无白色嘌呤碱银化合物沉淀。v（2）核糖：）核糖：v取水解液取水解液1mL于试管中加入三氯化铁浓盐酸溶液于试管中加入三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑和苔黑酚乙醇溶液酚乙醇溶液4滴。放沸水浴中滴。放沸水浴中10min。注意观察核糖是否变。注意观察核糖是否变成绿色。成绿色。v（3）磷酸：）磷酸：v取水解液取水解液3mL于试管中加于试管中加5滴浓硝酸酸化，再加入滴浓硝酸酸化，再加入20滴钼酸滴钼酸铵溶液在沸水浴上加热，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀产生。铵溶液在沸水浴上加热，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀产生。v四、结果处理四、结果处理v1.酵母酵母RNA得率（得率（%）=（W2-W1）*100Wv其中其中W-干酵母粉重量（克）干酵母粉重量（克）v2.粗提的酵母粗提的酵母RNA含量（含量（%）=m*V1*100V2*W/v其中其中W/-酵母酵母RNA重量（重量（g）vm-从标准曲线上查得从标准曲线上查得RNA的微克数的微克数vV1-100mLvV2-2mL实验八赖氨酸含量测定实验八赖氨酸含量测定一、实验目的一、实验目的掌握谷物中赖氨酸含量的测定方法及原理。掌握谷物中赖氨酸含量的测定方法及原理。二、实验原理二、实验原理v蛋白质中赖氨酸的含量是谷物品质的主要指标之一。由于动物及蛋白质中赖氨酸的含量是谷物品质的主要指标之一。由于动物及人类不能合成，须从食物中得以补充，为此培育高含量赖氨酸的人类不能合成，须从食物中得以补充，为此培育高含量赖氨酸的谷物，对于提高营养价值有重要意义。本实验分别用茚三酮溶液谷物，对于提高营养价值有重要意义。本实验分别用茚三酮溶液显色法和染料结合法，测定显色法和染料结合法，测定小麦小麦种子中赖氨酸含量。种子中赖氨酸含量。v谷物蛋白中赖氨酸残基有自由的谷物蛋白中赖氨酸残基有自由的NH3与茚三酮试剂可发生颜与茚三酮试剂可发生颜色反应，生成紫红色物质，其颜色深浅与赖氨酸残基的数目成正色反应，生成紫红色物质，其颜色深浅与赖氨酸残基的数目成正相关，而其它氨基酸没有自由氨基，不能发生这一反应。选用碳相关，而其它氨基酸没有自由氨基，不能发生这一反应。选用碳原子数目与赖氨酸相同的亮氨酸，配成标准溶液，做出标准曲线，原子数目与赖氨酸相同的亮氨酸，配成标准溶液，做出标准曲线，可用以测定谷物蛋白内赖氨酸的含量。可用以测定谷物蛋白内赖氨酸的含量。三、实验仪器、