吸光光度法教学.ppt

第十一章吸光光度法一一 光的基本性质光的基本性质吸光光度法吸光光度法 是基于被测物质的是基于被测物质的分子分子 对对光光 具有选择吸收具有选择吸收的特性而建立的分析方法。的特性而建立的分析方法。光是一种电磁波，具有波粒二象性，不同波长的光具有不同光是一种电磁波，具有波粒二象性，不同波长的光具有不同的能量。的能量。射射线线x射射线线紫紫外外光光红红外外光光微微波波无无线线电电波波10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm可可 见见 光光第一节第一节第一节第一节 物质对光的吸收物质对光的吸收物质对光的吸收物质对光的吸收基本原理基本原理基本原理基本原理光的波粒二象性光的波粒二象性光的波粒二象性光的波粒二象性波动性波动性波动性波动性粒子性粒子性粒子性粒子性 E E光的折射光的折射光的折射光的折射光的衍射光的衍射光的衍射光的衍射光的偏振光的偏振光的偏振光的偏振光的干涉光的干涉光的干涉光的干涉光电效应光电效应光电效应光电效应E E：光子的能量（：光子的能量（：光子的能量（：光子的能量（J,J,焦耳）焦耳）焦耳）焦耳）：光子的频率（：光子的频率（：光子的频率（：光子的频率（HzHz,赫兹）赫兹）赫兹）赫兹）：光子的波长（：光子的波长（：光子的波长（：光子的波长（cmcm）c c：光速：光速：光速：光速（2.99792.9979 10101010 cm.s cm.s-1-1）h h：PlankPlank常数（常数（常数（常数（6.62566.6256 1010-34-34 J.s J.s 焦焦焦焦耳耳耳耳.秒秒秒秒）单色光、复合光、光的互补单色光、复合光、光的互补单色光单色光复合光复合光光的互补光的互补单一波长的光单一波长的光由不同波长的光组合而成的光由不同波长的光组合而成的光若两种不同颜色的单色光按一定的强度比若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。为互补色光，这种现象称为光的互补。蓝蓝黄黄紫红紫红绿绿紫紫黄绿黄绿绿蓝绿蓝橙橙红红蓝绿蓝绿物质的颜色与光的关系物质的颜色与光的关系完全吸收完全吸收完全透过完全透过吸收黄色光吸收黄色光光谱示意光谱示意表观现象示意表观现象示意复合光复合光吸收光谱吸收光谱光作用于物质时，物质吸收了可见光，而光作用于物质时，物质吸收了可见光，而光作用于物质时，物质吸收了可见光，而光作用于物质时，物质吸收了可见光，而显示出特征的颜色，这一过程与物质的显示出特征的颜色，这一过程与物质的显示出特征的颜色，这一过程与物质的显示出特征的颜色，这一过程与物质的 性性性性质及光的性质有关。质及光的性质有关。质及光的性质有关。质及光的性质有关。物质对光的吸收物质对光的吸收物质对光的吸收物质对光的吸收物质对光的吸收满足物质对光的吸收满足物质对光的吸收满足物质对光的吸收满足Plank Plank 条件条件条件条件A 物质对光的选择吸收物质对光的选择吸收物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。成了物质对光的选择吸收基础。例：例：A 物质物质B 物质物质同理，得：同理，得：1 ev=1.6 10-19 J.吸收光谱的获得吸收光谱的获得Absorption Spectra测量某物质对不同波长单色光的测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长（吸收程度，以波长（）为横坐为横坐标，吸光度（标，吸光度（A）为纵坐标，绘）为纵坐标，绘制吸光度随波长的变化可得一曲制吸光度随波长的变化可得一曲线，此曲线即为吸收光谱。线，此曲线即为吸收光谱。(a)(b)(c)(d)220 240 260 280 nm A0000(a)联苯（己烷溶剂）；联苯（己烷溶剂）；一些典型的紫外光谱一些典型的紫外光谱(b)苯（己烷溶剂）；苯（己烷溶剂）；(c)苯蒸汽；苯蒸汽；(d)Na蒸汽。蒸汽。第第二节二节 光光吸吸收基本定律收基本定律一、朗伯一、朗伯-比尔定律比尔定律透光率定义：透光率定义：T 取值为取值为0.0%100.0%全部吸收全部吸收T=0.0%全部透射全部透射T=100.0%入射光入射光 I0透射光透射光 It二、朗伯二、朗伯-比尔定律的推导比尔定律的推导I0dbbItII-dIdI N IN：薄层中的吸光粒子数：薄层中的吸光粒子数N=N0 c dS dbN0：阿伏加德罗常数：阿伏加德罗常数 dS：捕获面积，薄层中被光照射的面积。：捕获面积，薄层中被光照射的面积。c：吸光溶液的浓度吸光溶液的浓度N=k c db故故 dI N I=I k c dbdI=-I k c db,dI/I=-k c db积分积分得得或或得得三、吸光度与透光率三、吸光度与透光率T：透光率透光率A：吸光度吸光度1.00.50ACA100500T%TT=0.0%A=T=100.0%A=0.0A=0.434T=36.8%四、吸光系数四、吸光系数b：吸光液层的厚度，光程，：吸光液层的厚度，光程，cmc：吸光物质的浓度，吸光物质的浓度，g/L,mol/LK：比例常数：比例常数入射光波长入射光波长物质的性质物质的性质温度温度取值与浓度的单位相关取值与浓度的单位相关c：mol/LK 摩尔吸光系数，摩尔吸光系数，L mol 1 cm-1c：g/LK a吸光系数，吸光系数，L g 1 cm-1c：g/100 mLK 比比吸光系数吸光系数相互关系相互关系 Molar AbsorptivityAbsorptivity Specific extinction coefficient吸收定律与吸收光谱的关系吸收定律与吸收光谱的关系吸收定律与吸收光谱的关系吸收定律与吸收光谱的关系AC吸吸光光定定律律A或或 吸吸收收光光谱谱A C max吸收光的加合性吸收光的加合性多组分体系中，如果各组分之间无相互作用，其吸光度具多组分体系中，如果各组分之间无相互作用，其吸光度具有加合性，即有加合性，即对吸收定律偏离对吸收定律偏离AC主要原因主要原因物理因素物理因素化学因素化学因素物理因素物理因素化学因素化学因素吸收定定律律偏偏离离非单色光引起的偏离非平行光引起的偏离介质不均匀引起的偏离溶液浓度过高引起化学反应引起的偏离非单色光引起的对吸光定律的偏离非单色光引起的对吸光定律的偏离-物理因素物理因素设入射光由设入射光由 1 和和 2 两种波长组成，溶液的吸光质点对两种波长组成，溶液的吸光质点对两种波长的光的吸收均遵从吸收定律两种波长的光的吸收均遵从吸收定律 1 2 1+2 或或或或非单色光引起的对吸光定律的偏离非单色光引起的对吸光定律的偏离对吸收光谱而言，对吸收光谱而言，b 和和 c 固定，固定，反映了反映了 随波长变化的情况，单随波长变化的情况，单一波长，一波长，固定；不同波长，固定；不同波长，不同。因此，非单色光将导致不同。因此，非单色光将导致对吸光定律的偏离。对吸光定律的偏离。A或或 1 2在实际工作中，入射光通常具有一定的带通。为了避免非单色在实际工作中，入射光通常具有一定的带通。为了避免非单色光带来的影响，一般选用峰值波长进行测定。光带来的影响，一般选用峰值波长进行测定。1 对应的对应的 1较小较小 2 对应的对应的 2较大较大选用峰值波长，也可以得到较高的灵敏度。选用峰值波长，也可以得到较高的灵敏度。第三节 吸光光度法的仪器分光光度法（紫外分光光度法（紫外-可见分光光度法）可见分光光度法）UV-VIS0.575光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示显示I0It参比参比样品样品入射光入射光 I0透射光透射光 It请注意与定义比较请注意与定义比较未考虑吸收池和溶剂对光子的作用未考虑吸收池和溶剂对光子的作用一一 吸光分析法的仪器简介吸光分析法的仪器简介紫外紫外-可见分光光度计组件可见分光光度计组件光源光源单色器单色器样品池样品池检测器检测器信号输出信号输出氢灯，氘灯，氢灯，氘灯，185 350 nm；卤钨灯，卤钨灯，250 2000 nm.基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定作用：将复合光色散成单色光作用：将复合光色散成单色光棱镜棱镜光栅光栅玻璃，玻璃，350 2500 nm,石英，石英，185 4500 nm平面透射光栅，平面透射光栅，反射光栅反射光栅玻璃，光学玻璃，石英玻璃，光学玻璃，石英作用：将光信号转换为电信号，并放大作用：将光信号转换为电信号，并放大光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄像管（多道分析器）像管（多道分析器）表头、记录仪、屏幕、数字显示表头、记录仪、屏幕、数字显示一、分光光度计的基本部件一、分光光度计的基本部件（一）光源（一）光源 分光光度计一般由光源、单色器（分光系统）、吸收池、检测系统和信号显示系统五部分组成 光源应能提供足够发射强度、稳定且波长连续变化的复合光，同时反射光的强度还应不随波长的变化而明显改变氙灯氢灯钨灯钨灯：4002500nm氢灯：185375nm氙灯：200800nm动画动画（二）单色器（分光系统）（二）单色器（分光系统）作用作用：从光源发出的复合光中分出所需要的单色光组成：组成：入射狭缝、准直镜、色散元件（棱镜或光栅）、聚焦镜、出射狭缝入射狭缝入射狭缝准直透镜准直透镜棱镜棱镜聚焦透镜聚焦透镜出射狭缝出射狭缝白光白光红红紫紫12800 600 500400棱镜：棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同。玻璃3603200nm,石英2004000 nm光栅：光栅：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光 在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400/mm)特点：特点：波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便光栅衍射示意图光栅衍射示意图出出射射狭狭缝缝光屏光屏透透镜镜平面透平面透射光栅射光栅1.平面透射光栅平面透射光栅2.反射光栅（广泛使用）反射光栅（广泛使用）（三）吸收池（三）吸收池（四）检测系统（四）检测系统可见光区：光学玻璃池；紫外区：石英池可见光区：光学玻璃池；紫外区：石英池用于盛待测及参比溶液（0.5、1、2、3cm）利用光电效应，将光能转换成电流讯号硒光电池，光电管，光电倍增管硒光电池，光电管，光电倍增管适用于300-800 nm,在500-600 nm范围最灵敏。较长时间连续使用会产生“疲劳”现象（五）信号显示系统（五）信号显示系统 早期的分光光度计：指针式系统 如：检流计（72型）、微安表（721型）、电位计（751型）现代的分光光度计：数字电压表、函数记录仪、示波器及数字处理台等01020 30405060 70809010000.10.20.30.40.50.60.70.81.01.5二、吸光度的检测原理二、吸光度的检测原理 分光光度计实际上测得的是光电流或电压，通过转换器将测得的电流或电压转换为对应的吸光度A1.调节检测器零点，即仪器的机械零点：A=2.应用不含待测组分的参比溶液调节吸光零点：A=03.待测组分吸光度的测定：Ax测定步骤：测定步骤：单波长单光束分光光度计单波长单光束分光光度计0.575光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示显示三、分光光度计的分类单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计比值比值光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示显示光束分裂器光束分裂器第四节第四节 吸光光度法分析条件的选择吸光光度法分析条件的选择一、显色反应及其条件的选择一、显色反应及其条件的选择（一）（一）显色反应和显色剂显色反应和显色剂显色反应：显色反应：在分光光度分析中，将试样中被测组分转变成有色化合物的反应显色剂：显色剂：与被测组分反应使之生成有色物质的试剂显色反应可分为：络合反应络合反应络合反应络合反应和氧化还原反应1、显色反应显色反应选择显色反应的一般标准选择显色反应的一般标准选择显色反应的一般标准选择显色反应的一般标准（1）选择性要好：）选择性要好：一种显色剂最好只与一种被测组分起显色反应，这样干扰就少。或者干扰离子容易被消除、或者显色剂与被测组分和干扰离子生成的有色化合物的吸收峰相隔较远1.（2）灵敏度要高：灵敏度要高：灵敏度高的显色反应对于微量组分的测定尤为重要。但应注意：灵敏度高的显色反应，并不一定选择性就好；对于高含量的组分不一定要选用灵敏度高的显色反应1.（3）对比度要大：）对比度要大：即如果显色剂有颜色，则有色化合物与显色剂的最大吸收波长的差别要大，一般要求在60nm以上1.（4）有色化合物的组成要恒定,化学性质要稳定1.（5）显色反应的条件要易于控制要易于控制2、显色剂显色剂缺点：缺点：多数无机显色剂与金属离子形成的络合物的稳定性差、灵敏度和选择性都不高（1）无机显色剂）无机显色剂硫氰酸盐硫氰酸盐（测铁、钼、钨、铌）钼酸铵钼酸铵（测硅、磷、钒）氨水氨水（测铜、钴、镍）过氧化氢过氧化氢（测钛、钒、铌）优点：优点：有机显色剂与金属离子形成稳定的、具有特征颜色的鳌合物，灵敏度和选择性灵敏度和选择性都较高（2）有机显色剂）有机显色剂提高灵敏度的方法：提高灵敏度的方法：增大有机显色分子的共轭体系和在显色分子中引入取代基生色团助色团常用的有机显色剂：邻二氮菲、双硫腙、二甲酚橙、偶氮胂III、铬天青S等（二）显色反应条件的选择（二）显色反应条件的选择1、显色剂的用量显色剂的用量2、溶液的酸度溶液的酸度（1）对被测物质存在状态的影响（2）对显色剂浓度和颜色的影响（3）对络合物组成和颜色的影响（吡啶偶氮（吡啶偶氮+氨基甲苯）氨基甲苯）25100t/minA3、时间和温度时间和温度100硅钼酸法测硅 时间包括显显显显色色色色时时时时间间间间和稳稳稳稳定定定定时时时时间间间间，温度对二者均产生影响4、有机溶剂和表面活性剂有机溶剂和表面活性剂 表表表表面面面面活活活活性性性性剂剂剂剂的加入可以提高显色反应的灵敏度，增加有色化合物的稳定性。其作用原理一方面是胶束增溶，另一方面是可形成含有表面活性剂的多元络合物。有机溶剂有机溶剂有机溶剂有机溶剂可以降低有色络合物的解离度，从而提高显色反应的灵敏度；此外，有机溶剂还可以影响反应速率，络合物的颜色、溶解度及组成等 合适的有机溶解和表面活性剂及其用量均通过实验来确定5、共存离子的干扰及消除、共存离子的干扰及消除显色条件下，共存离子发生水解、析出沉淀，导致溶液混浊无法测定共存离子本身有颜色或与显色剂反应生成有色化合物，并在测量条件下有吸收，导致结果偏高KNRKMR，MRNRR（1）控制溶液的酸度1.（2）加入掩蔽剂 掩蔽剂的颜色以及它与干扰离子反应产物的颜色不应干扰被测组分的测定二、吸光光度法的测量误差及测量条件的选择二、吸光光度法的测量误差及测量条件的选择（一）（一）仪器测量误差仪器测量误差1086420204060800.70.40.20.1AT/%|Er|%(36.8)(36.8)0.4340.434仪器度数范围仪器度数范围：仪器最小误差：仪器最小误差：（二）测量条件的选择（二）测量条件的选择 1、测量波长的选择测量波长的选择原则：吸收最大、干扰最小原则：吸收最大、干扰最小钍钍-偶氮砷偶氮砷IIIIII 络合物络合物试剂试剂钴钴-亚硝基红盐亚硝基红盐 试试剂剂络合物络合物b、如果溶液已显色，则可通过改变比色皿的厚度来调节吸光度大小（光程长度（光程长度b）2、吸光度范围的控制吸光度范围的控制A：0.150.80；T：15%70%a、计算而且控制试样的称出量，含量高时，少取样，或稀释试液；含量低时，可多取样，或萃取富集（浓度（浓度（浓度（浓度c c）c、选择适当的参比溶液（示差分光光度法）（示差分光光度法）3、参比溶液的选择参比溶液的选择 参比溶液用来调节工作零点，以消除由于吸收池和溶液中某些共存物质对光的吸收、反射或散射所造成的误差RRMRRMR0.220.480.000.22+0.480.70RMR测定条件下干扰物质参比溶液组成1 无蒸馏水2 R或其它试剂R或其他试剂3 R和其它试剂；NR试样+ML+R+其它试剂参比溶液组成：参比溶液组成：参比溶液组成：参比溶液组成：在测量条件下对吸光度有影响的物质（除了被测组分MR外）KIO3氧化法显色法测 Mn2+(Co2+粉红)1、做标准曲线时：蒸馏水参比2、测样时：试液参比（不加显色剂）铬天氰S测Al3+(Ni2+,Cr3+)试样+(AlF63-)+铬天氰S+其它试剂第五节 吸光光度法的应用一、定量分析（一）单组分的测定（二）多组分的同时测定二、络合组成和酸碱解离常数的测定（一）络合物组成的测定（二）酸碱解离常数的测定定性分析与定量分析的基础定性分析与定量分析的基础定性分析基础定性分析基础定量分析基础定量分析基础物质对光的选择物质对光的选择吸收吸收ABA 在一定的实验条在一定的实验条件下，物质对光件下，物质对光的吸收与物质的的吸收与物质的浓度成正比。浓度成正比。A C增增大大