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仪器分析实验课件仪器分析实验课件第1页，本讲稿共13页可乐、咖啡、茶叶中咖啡因的高效液相可乐、咖啡、茶叶中咖啡因的高效液相色谱分析色谱分析n n一、目的要求一、目的要求n n1、理解反相色谱的原理和应用；、理解反相色谱的原理和应用；n n2、掌握标准曲线定量法。、掌握标准曲线定量法。第2页，本讲稿共13页n n二、原理二、原理n n咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称为咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称为咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称为咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称为1,3,71,3,7三甲基黄嘌吟，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生三甲基黄嘌吟，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生三甲基黄嘌吟，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生三甲基黄嘌吟，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。物碱。它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。物碱。它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。物碱。它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。n n咖啡中含咖啡因约为咖啡中含咖啡因约为咖啡中含咖啡因约为咖啡中含咖啡因约为1.2%1.8%1.2%1.8%，茶叶中约含，茶叶中约含，茶叶中约含，茶叶中约含2.0%4.7%2.0%4.7%。可乐饮料、。可乐饮料、。可乐饮料、。可乐饮料、APCAPC药片等中均含咖啡因。药片等中均含咖啡因。药片等中均含咖啡因。药片等中均含咖啡因。n n分子式为分子式为分子式为分子式为C C8 8HH1010OO2 2NN4 4，结构式为：，结构式为：，结构式为：，结构式为：第3页，本讲稿共13页n n样品在碱性条件下，用氯仿定量提取，采样品在碱性条件下，用氯仿定量提取，采用用Econosphere C18反相液相色谱柱进行分反相液相色谱柱进行分离，以紫外检测器进行检测，以咖啡因标离，以紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度做工作准系列溶液的色谱峰面积对其浓度做工作曲线，再根据样品中的咖啡因峰面积，由曲线，再根据样品中的咖啡因峰面积，由工作曲线算出其浓度。工作曲线算出其浓度。第4页，本讲稿共13页三、仪器与试剂n n仪器仪器仪器仪器 Agilent 1100Agilent 1100液相色谱仪（美国），液相色谱仪（美国），液相色谱仪（美国），液相色谱仪（美国），Econosphere Econosphere C18C18反相色谱柱，反相色谱柱，反相色谱柱，反相色谱柱，l 0cm*4.6cml 0cm*4.6cm；平头微量注射器。；平头微量注射器。；平头微量注射器。；平头微量注射器。n n试剂试剂试剂试剂 1 1、甲醇（色谱纯）；二次蒸馏水；氯仿（、甲醇（色谱纯）；二次蒸馏水；氯仿（、甲醇（色谱纯）；二次蒸馏水；氯仿（、甲醇（色谱纯）；二次蒸馏水；氯仿（A.R.A.R.）；）；）；）；lmol/L lmol/L NaOHNaOH；NaClNaCl（A.R.A.R.）；）；）；）；NaNa2 2SOSO4 4(A.R.)(A.R.)；咖啡因；咖啡因；咖啡因；咖啡因(A.(A.R.)R.)；可口可乐（；可口可乐（；可口可乐（；可口可乐（l.25Ll.25L瓶装）；雀巢咖啡；茶叶。瓶装）；雀巢咖啡；茶叶。瓶装）；雀巢咖啡；茶叶。瓶装）；雀巢咖啡；茶叶。2.2.咖啡因标准贮备溶液咖啡因标准贮备溶液咖啡因标准贮备溶液咖啡因标准贮备溶液第5页，本讲稿共13页n n四、实验步骤n n1 1、按操作说明书使色谱仪正常工作，色谱条件为：、按操作说明书使色谱仪正常工作，色谱条件为：、按操作说明书使色谱仪正常工作，色谱条件为：、按操作说明书使色谱仪正常工作，色谱条件为：柱温：室温柱温：室温柱温：室温柱温：室温流动相：甲醇水流动相：甲醇水流动相：甲醇水流动相：甲醇水 60/4060/40 流动相流量：流动相流量：流动相流量：流动相流量：1.0mL/min 1.0mL/min 检测波长：检测波长：检测波长：检测波长：275nm275nmn n2 2、咖啡因标准系列溶液配制：分别用吸量管吸取咖、咖啡因标准系列溶液配制：分别用吸量管吸取咖、咖啡因标准系列溶液配制：分别用吸量管吸取咖、咖啡因标准系列溶液配制：分别用吸量管吸取咖啡因标准贮备液于五只啡因标准贮备液于五只啡因标准贮备液于五只啡因标准贮备液于五只10mL10mL容量瓶中，用氯仿定容容量瓶中，用氯仿定容容量瓶中，用氯仿定容容量瓶中，用氯仿定容至刻度，浓度分别为至刻度，浓度分别为至刻度，浓度分别为至刻度，浓度分别为4040、6060、8080、100100、120mg/L120mg/L。第6页，本讲稿共13页n n3 3、样品处理如下：、样品处理如下：n n（1 1）将约）将约100mL100mL可口可乐置于一可口可乐置于一250mL250mL洁净、干燥的烧洁净、干燥的烧杯中，剧烈搅拌杯中，剧烈搅拌30min30min或用超声波脱气或用超声波脱气5min5min，以赶尽可，以赶尽可乐中二氧化碳。乐中二氧化碳。n n（2 2）准确称取）准确称取0.25g0.25g咖啡，用蒸馏水溶解，定量转移咖啡，用蒸馏水溶解，定量转移至至100mL100mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀。容量瓶中，定容至刻度，摇匀。n n（3 3）准确称取）准确称取0.30g0.30g茶叶，用茶叶，用30mL30mL蒸馏水煮沸蒸馏水煮沸l0minl0min，冷却后，将上层清液转移至冷却后，将上层清液转移至100mL100mL容量瓶中，并按此步容量瓶中，并按此步骤再重复二次，最后用蒸馏水定容至刻度。骤再重复二次，最后用蒸馏水定容至刻度。n n将上述三份样品溶液分别进行干过滤（即用干漏斗、将上述三份样品溶液分别进行干过滤（即用干漏斗、干滤纸过滤），弃去前过滤液，取后面的过滤液。干滤纸过滤），弃去前过滤液，取后面的过滤液。第7页，本讲稿共13页n n分别吸取上述三份样品滤液分别吸取上述三份样品滤液25.00mL25.00mL于于125mL125mL分液漏斗中，分液漏斗中，加入加入1.0mL1.0mL饱和氯化钠溶液，饱和氯化钠溶液，1mL lmol/L NaOH1mL lmol/L NaOH溶液，溶液，然后用然后用20mL20mL氯仿分三次萃取（氯仿分三次萃取（10mL10mL、5mL5mL、5mL5mL）。将）。将氯仿提取液分离后经过装有无水硫酸钠小漏斗（在小漏氯仿提取液分离后经过装有无水硫酸钠小漏斗（在小漏斗的颈部放一团脱脂棉，上面铺一层无水硫酸钠）脱水，斗的颈部放一团脱脂棉，上面铺一层无水硫酸钠）脱水，过滤于过滤于25mL25mL容量瓶中，最后用少量氯仿多次洗涤无水硫容量瓶中，最后用少量氯仿多次洗涤无水硫酸钠小漏斗，将洗涤液合并至容量瓶中，定容至刻度。酸钠小漏斗，将洗涤液合并至容量瓶中，定容至刻度。第8页，本讲稿共13页n n4 4、绘制工作曲线：待液相色谱仪基线平直后，分别注入、绘制工作曲线：待液相色谱仪基线平直后，分别注入、绘制工作曲线：待液相色谱仪基线平直后，分别注入、绘制工作曲线：待液相色谱仪基线平直后，分别注入咖啡因标准系列溶液咖啡因标准系列溶液咖啡因标准系列溶液咖啡因标准系列溶液1010 L L重复二次，要求二次所得的重复二次，要求二次所得的重复二次，要求二次所得的重复二次，要求二次所得的咖啡因色谱峰面积基本一致，否则，继续进样，直咖啡因色谱峰面积基本一致，否则，继续进样，直咖啡因色谱峰面积基本一致，否则，继续进样，直咖啡因色谱峰面积基本一致，否则，继续进样，直至每次进样色谱峰面积重复，记下峰面积和保留时至每次进样色谱峰面积重复，记下峰面积和保留时至每次进样色谱峰面积重复，记下峰面积和保留时至每次进样色谱峰面积重复，记下峰面积和保留时间。间。间。间。n n5 5、样品测定：分别注入样品溶液、样品测定：分别注入样品溶液、样品测定：分别注入样品溶液、样品测定：分别注入样品溶液1010 L L，根据保留时，根据保留时，根据保留时，根据保留时间确定样品中咖啡因色谱峰的位置，再重复二次，记下间确定样品中咖啡因色谱峰的位置，再重复二次，记下间确定样品中咖啡因色谱峰的位置，再重复二次，记下间确定样品中咖啡因色谱峰的位置，再重复二次，记下咖啡因色谱峰面积。咖啡因色谱峰面积。咖啡因色谱峰面积。咖啡因色谱峰面积。n n6 6、实验结束后，按要求关好仪器。、实验结束后，按要求关好仪器。、实验结束后，按要求关好仪器。、实验结束后，按要求关好仪器。第9页，本讲稿共13页n n五、结果处理五、结果处理五、结果处理五、结果处理n n1 1、根据咖啡因标准系列溶液的色谱图，绘制咖啡因、根据咖啡因标准系列溶液的色谱图，绘制咖啡因、根据咖啡因标准系列溶液的色谱图，绘制咖啡因、根据咖啡因标准系列溶液的色谱图，绘制咖啡因峰面积与其浓度的关系曲线。峰面积与其浓度的关系曲线。峰面积与其浓度的关系曲线。峰面积与其浓度的关系曲线。n n2 2、根据样品中咖啡因色谱峰的峰面积，由工作曲线、根据样品中咖啡因色谱峰的峰面积，由工作曲线、根据样品中咖啡因色谱峰的峰面积，由工作曲线、根据样品中咖啡因色谱峰的峰面积，由工作曲线计算可口可乐、咖啡、茶叶中咖啡因含量（分别用计算可口可乐、咖啡、茶叶中咖啡因含量（分别用计算可口可乐、咖啡、茶叶中咖啡因含量（分别用计算可口可乐、咖啡、茶叶中咖啡因含量（分别用mg/Lmg/L、mg/gmg/g和和和和mg/gmg/g表示）。表示）。表示）。表示）。第10页，本讲稿共13页n n六、注意事项六、注意事项六、注意事项六、注意事项n n1 1、测定咖啡因的传统方法是先经萃取，再用分光光度法、测定咖啡因的传统方法是先经萃取，再用分光光度法、测定咖啡因的传统方法是先经萃取，再用分光光度法、测定咖啡因的传统方法是先经萃取，再用分光光度法测定。由于一些具有紫外吸收的杂质同时被萃取，所以，测定。由于一些具有紫外吸收的杂质同时被萃取，所以，测定。由于一些具有紫外吸收的杂质同时被萃取，所以，测定。由于一些具有紫外吸收的杂质同时被萃取，所以，测定结果具有一定误差。液相色谱法先经色谱柱高效分离测定结果具有一定误差。液相色谱法先经色谱柱高效分离测定结果具有一定误差。液相色谱法先经色谱柱高效分离测定结果具有一定误差。液相色谱法先经色谱柱高效分离后再检测分析，测定结果正确。实际样品成分往往比较复后再检测分析，测定结果正确。实际样品成分往往比较复后再检测分析，测定结果正确。实际样品成分往往比较复后再检测分析，测定结果正确。实际样品成分往往比较复杂，如果不先萃取而直接进样，虽然操作简单，但会影响杂，如果不先萃取而直接进样，虽然操作简单，但会影响杂，如果不先萃取而直接进样，虽然操作简单，但会影响杂，如果不先萃取而直接进样，虽然操作简单，但会影响色谱柱寿命。色谱柱寿命。色谱柱寿命。色谱柱寿命。n n2 2、不同牌号的茶叶、咖啡中咖啡因含量不大相同，称取、不同牌号的茶叶、咖啡中咖啡因含量不大相同，称取、不同牌号的茶叶、咖啡中咖啡因含量不大相同，称取、不同牌号的茶叶、咖啡中咖啡因含量不大相同，称取的样品量可酌量增减。的样品量可酌量增减。的样品量可酌量增减。的样品量可酌量增减。n n3 3、若样品和标准溶液需保存，应置于冰箱中。、若样品和标准溶液需保存，应置于冰箱中。、若样品和标准溶液需保存，应置于冰箱中。、若样品和标准溶液需保存，应置于冰箱中。n n4 4、为获得良好结果，标样和样品的进样量要严格保、为获得良好结果，标样和样品的进样量要严格保、为获得良好结果，标样和样品的进样量要严格保、为获得良好结果，标样和样品的进样量要严格保持一致。持一致。持一致。持一致。第11页，本讲稿共13页n n七、思考题七、思考题七、思考题七、思考题n n1 1、用标准曲线法定量的优缺点是什么？、用标准曲线法定量的优缺点是什么？、用标准曲线法定量的优缺点是什么？、用标准曲线法定量的优缺点是什么？n n2 2、根据结构式，咖啡因能用离子交换色谱法分析吗？、根据结构式，咖啡因能用离子交换色谱法分析吗？、根据结构式，咖啡因能用离子交换色谱法分析吗？、根据结构式，咖啡因能用离子交换色谱法分析吗？为什么？为什么？为什么？为什么？n n3 3、若标准曲线用咖啡因浓度对峰高作图，能给出准、若标准曲线用咖啡因浓度对峰高作图，能给出准、若标准曲线用咖啡因浓度对峰高作图，能给出准、若标准曲线用咖啡因浓度对峰高作图，能给出准确结果吗？与本实验的标准曲线相比何者优越？为什确结果吗？与本实验的标准曲线相比何者优越？为什确结果吗？与本实验的标准曲线相比何者优越？为什确结果吗？与本实验的标准曲线相比何者优越？为什么？么？么？么？n n4 4、在样品干过滤时，为什么要弃去前过滤液？这样、在样品干过滤时，为什么要弃去前过滤液？这样、在样品干过滤时，为什么要弃去前过滤液？这样、在样品干过滤时，为什么要弃去前过滤液？这样做会不会影响实验结果？为什么？做会不会影响实验结果？为什么？做会不会影响实验结果？为什么？做会不会影响实验结果？为什么？第12页，本讲稿共13页分组实验分组实验n n1.1.根据实验样品不同（可乐、咖啡、茶叶），六根据实验样品不同（可乐、咖啡、茶叶），六小组中每两个小组编成一大组做同一种样品，如：小组中每两个小组编成一大组做同一种样品，如：可乐。每小组分别取不同品牌的同一种样品。如：可乐。每小组分别取不同品牌的同一种样品。如：可口可乐、百事可乐。可口可乐、百事可乐。n n2.2.每个小组选一个代表做预实验（标准样品实验）每个小组选一个代表做预实验（标准样品实验）时间：时间：1212月月6 6日日n n3.3.1212月月1313日第一大组日第一大组“可乐可乐”、1212月月2020日第二大组日第二大组“咖啡咖啡”、1212月月2727日第三大组日第三大组“茶叶茶叶”。n n4.4.讨论后将具体分工安排交上来讨论后将具体分工安排交上来流动相、样品、进样、观察、分析流动相、样品、进样、观察、分析第13页，本讲稿共13页
