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酶双水相萃取双水相萃取本讲稿第一页，共二十一页Contents1、双水相系统的形成2、双水相系统的相图3、蛋白质双水相萃取的原理4、蛋白质双水相萃取的过程 5.蛋白质双水相萃取的优缺点本讲稿第二页，共二十一页1.1、双水相萃取的形成的概述双水相萃取的形成的概述熵增熵增混合混合自发自发分子间作用力分子间作用力随着随着Mr的增加的增加,而增大而增大.聚合物的不相容性聚合物的不相容性含含有聚合物分子的溶液发生有聚合物分子的溶液发生分相的现象分相的现象.形成原因形成原因 FirstSecond Third本讲稿第三页，共二十一页形形成成过过程程 当两种不同水溶性聚合物都溶于水中当两种不同水溶性聚合物都溶于水中且浓度达到一定值时，体系会自然的形成且浓度达到一定值时，体系会自然的形成互不相容的两相，两种聚合物分别溶于两互不相容的两相，两种聚合物分别溶于两相中，即构成双水相系统。这主要是由于相中，即构成双水相系统。这主要是由于聚合物分子的空间位阻作用，相互间无法聚合物分子的空间位阻作用，相互间无法渗透，而且有强烈的相分离倾向，在一定渗透，而且有强烈的相分离倾向，在一定条件下即可分为两相。一般认为，聚合物条件下即可分为两相。一般认为，聚合物水溶液的疏水性差异是产生相分离的主要水溶液的疏水性差异是产生相分离的主要推动力，且蔬水性差异越大，相分离倾向推动力，且蔬水性差异越大，相分离倾向也越大。也越大。形成条件构成两相的溶质达到一定浓度构成两相的溶质达到一定浓度本讲稿第四页，共二十一页作用力为作用力为斥力斥力作用力作用力为引力为引力作用力无强作用力无强烈引力和斥烈引力和斥力力形成双水相系统形成双水相系统形成两相，一相为两高形成两相，一相为两高聚物，一相为水相聚物，一相为水相完全互溶，形成均一相完全互溶，形成均一相双水相双水相均一相均一相两相两相1.21.2、双水相系统中作用力的表现、双水相系统中作用力的表现本讲稿第五页，共二十一页1.31.3、几种常见的双水相体系、几种常见的双水相体系类型类型形成上相的聚合物形成上相的聚合物形成下相的聚合物形成下相的聚合物非离子型聚合物非离子型聚合物/非离子型非离子型聚合物聚合物聚乙二醇聚乙二醇葡聚糖葡聚糖聚乙烯醇聚乙烯醇聚丙二醇聚丙二醇聚乙二醇聚乙二醇聚乙烯吡咯烷酮聚乙烯吡咯烷酮高分子电解质高分子电解质/非离子型聚非离子型聚合物合物羧甲基纤维素钠羧甲基纤维素钠聚乙二醇聚乙二醇高分子电解质高分子电解质/高分子电解高分子电解质质葡聚糖硫酸钠葡聚糖硫酸钠羧甲基纤维素钠羧甲基纤维素钠聚合物聚合物/低分子量化合物低分子量化合物葡聚糖葡聚糖丙醇丙醇聚合物聚合物/无机盐无机盐聚乙二醇聚乙二醇磷酸钾磷酸钾硫酸铵硫酸铵本讲稿第六页，共二十一页2 2、双水相系统相图、双水相系统相图双水相区双水相区单相区单相区临界点临界点(critical(critical point)point)：当系线长：当系线长度趋于零时度趋于零时,两相差两相差别消失别消失,任何溶质在任何溶质在两相中的分配系数两相中的分配系数均为均为1 1。如右图。如右图C C点：点：双节线系线本讲稿第七页，共二十一页3、蛋白质双水解萃取的原理、蛋白质双水解萃取的原理 当蛋白质分子进入双水当蛋白质分子进入双水当蛋白质分子进入双水当蛋白质分子进入双水相系统后，由于其表面性质、相系统后，由于其表面性质、相系统后，由于其表面性质、相系统后，由于其表面性质、电荷作用以及各种作用力电荷作用以及各种作用力电荷作用以及各种作用力电荷作用以及各种作用力（疏水键、氢键、离子键等）（疏水键、氢键、离子键等）（疏水键、氢键、离子键等）（疏水键、氢键、离子键等）的存在，使其在两相间按其的存在，使其在两相间按其的存在，使其在两相间按其的存在，使其在两相间按其分配系数进行选择性分配。分配系数进行选择性分配。分配系数进行选择性分配。分配系数进行选择性分配。蛋白质主要分配在上相，菌蛋白质主要分配在上相，菌蛋白质主要分配在上相，菌蛋白质主要分配在上相，菌体碎片在下相或界面上体碎片在下相或界面上体碎片在下相或界面上体碎片在下相或界面上。本讲稿第八页，共二十一页3.1、蛋白质双水相萃取体系常用聚合物蛋白质双水相萃取体系常用聚合物无毒原则无毒原则聚乙二醇聚乙二醇-葡聚糖葡聚糖聚乙二醇聚乙二醇-磷酸盐磷酸盐本讲稿第九页，共二十一页3.23.2、影响蛋白质分配系数的因素、影响蛋白质分配系数的因素在很大的浓度范围内，被在很大的浓度范围内，被分离蛋白质的分配系数与分离蛋白质的分配系数与浓度无关，而与被分离蛋浓度无关，而与被分离蛋白质的性质及选定的双水白质的性质及选定的双水相系统的性质有关相系统的性质有关两相的两相的组成组成温度、温度、pH值等值等两相溶两相溶液的比液的比例例蛋白质的分蛋白质的分子质量、电子质量、电荷、极性荷、极性聚合物的分子质聚合物的分子质量、浓度、极性量、浓度、极性及离子的种类、及离子的种类、浓度、电荷等浓度、电荷等本讲稿第十页，共二十一页4 4、蛋白质双水相萃取过程、蛋白质双水相萃取过程目的产物的萃取PEG循环无机盐的循环主要有三部分构成：主要有三部分构成：匀浆液匀浆液ATPSPEG+PEG+盐盐ATPS上相（产物）上相（产物）上相（上相（PEGPEG、杂蛋白）、杂蛋白）下相（目的产物）下相（目的产物）下相（废物）下相（废物）+盐盐分离器分离器分离器分离器P PE EG G循循环环本讲稿第十一页，共二十一页1）目的产物的萃取）目的产物的萃取 细胞悬浮液经珠磨机破碎细胞后，与细胞悬浮液经珠磨机破碎细胞后，与PEG和无机盐在萃取器中混合，然后进入和无机盐在萃取器中混合，然后进入离心机分相。通过选择合适的双水相组成，离心机分相。通过选择合适的双水相组成，一般使目标蛋白质分配到上相一般使目标蛋白质分配到上相(PEG相相)，而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相到下相(富盐相富盐相)。本讲稿第十二页，共二十一页2）PEG的循环 在在大大规规模模双双水水相相萃萃取取过过程程中中，成成相相材材料料的的回回收收和和循循环环使使用用，不不仅仅可可以以减减少少废废水水处处理理的的费费用用，还还可可以以节节约约化化学学试试剂剂，降降低低成成本本。PEGPEG回回收收有有两两种种方方法法：一一种种即即前前面面所所述述的的加加入入盐盐使使蛋蛋白白质质转转入入富富盐盐相相来来回回收收PEG PEG，一一种种是是将将PEG PEG 通通过过离离子子交交换换树树脂脂，洗洗脱脱剂剂先先洗洗出出PEGPEG，再再洗洗出出蛋蛋白白质质。现现在在常常用用的的方方法法是是将将第第1 1步步萃萃取取的的PEG PEG 相相或或除去部分蛋白质的除去部分蛋白质的PEGPEG相循环利用相循环利用 。本讲稿第十三页，共二十一页3 3）无机盐的循环）无机盐的循环 一一种种方方法法是是将将含含磷磷酸酸钠钠的的盐盐相相冷冷却却到到6，使使盐盐结结晶晶析析出出，然然后后用用离离心心机机分分离离收收集集；另另一一种种是是用用电电渗渗析析法法、膜膜分分离离法法回回收收盐盐类类或或除除去去PEG 相相的的盐盐。双双水水相相萃萃取取所所用用的的设设备备一一般般都都是是其其他他两两相相体体系系如如水水-有有机机溶溶剂剂体体系系所所通通用用的的设设备备，商商业业化化的的混混合合器器-沉沉淀淀器器系系统统以以及及离离心心分分离离机机已已成成功功应应用用于于双双水水相相萃萃取取。用用磁磁性性分分离离等等新新技技术术也也可可提提高高两两相相分分离离。尽尽管管刚刚开开始始应应用用时时，大大多多数数双双水水相相萃萃取取是是间间歇歇式式的的，但但此此技技术术更更适适合合于于错错流流萃萃取取的的连连续续生生产产，这这样样可可有有效效利利用用空空间间和和时时间间，尤尤其其是是在在与与其其他他分分离离技技术术如凝胶过滤、膜分离等相结合使用时。如凝胶过滤、膜分离等相结合使用时。本讲稿第十四页，共二十一页4.14.1、蛋白质双水相萃取的工艺流程、蛋白质双水相萃取的工艺流程Chart Title in here200320042005200630070120本讲稿第十五页，共二十一页enzymeenzymeenzymeenzymeenzymeEnzymetic reactionEnzymetic reactionsubstratesubstrateproductproduct4.24.2、蛋白质双水相萃取与酶促反应、蛋白质双水相萃取与酶促反应本讲稿第十六页，共二十一页enzymeenzymeenzymeEnzymetic reaction with ATPS本讲稿第十七页，共二十一页5.15.1、蛋白质双水相萃取的优点、蛋白质双水相萃取的优点1234可用于蛋白质的精可用于蛋白质的精制，经过几次连续制，经过几次连续的双水相萃取，得的双水相萃取，得到更高纯度的蛋白到更高纯度的蛋白质。质。两相含水量均很高，两相含水量均很高，与蛋白质有很好的与蛋白质有很好的相容性，且不易使相容性，且不易使蛋白质失活蛋白质失活。所需设备简所需设备简单，且处理单，且处理容量大，利容量大，利于大规模生于大规模生产产。分离纯化后的分离纯化后的蛋白质产物纯蛋白质产物纯度很高，有很度很高，有很大使用价值。大使用价值。本讲稿第十八页，共二十一页5.25.2、蛋白质双水相萃取的缺点、蛋白质双水相萃取的缺点系统中水的含量高，系统中水的含量高，分离后的蛋白质液分离后的蛋白质液浓度低，需要浓缩浓度低，需要浓缩以提高产物的浓度。以提高产物的浓度。分离后的蛋白质分离后的蛋白质液含有高分子聚液含有高分子聚合物和盐类，需合物和盐类，需要将其除去。要将其除去。缺点缺点本讲稿第十九页，共二十一页5.3、双水相萃取技术在工业使用上存在、双水相萃取技术在工业使用上存在的问题和解决方法的问题和解决方法v存在问题存在问题：成相聚合物价格昂贵是阻碍该成相聚合物价格昂贵是阻碍该技术应用于工业生产的主要因素。技术应用于工业生产的主要因素。葡聚糖是医疗上的血浆代用品，价格很高，用粗品代替精制品又会造成葡聚糖相粘度太高，使分离困难。研究应用最多的PEG并不是双水相体系最适和的聚合物，磷酸盐又会带来环境问题。v解决方法解决方法：开发新型廉价的双水相系统是开发新型廉价的双水相系统是该技术应用急需解决的问题。该技术应用急需解决的问题。本讲稿第二十页，共二十一页本讲稿第二十一页，共二十一页