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第二章荧光和化学发光分析法第二章荧光和化学发光分析法第一页，本课件共有60页*第二页，本课件共有60页*Stokes 用分光计观察到：荧光的波长比入射光的波长稍微长些五颜六色雨后路面上水珠油膜呈现第三页，本课件共有60页*基基态态分分子子吸吸收收能能量量(电电能能、热热能能、化化学学能能或或光光能能等等)，电电子子由由基基态态跃跃迁迁到到激激发发态态，当当电电子子由由激激发发态态返返回回基基态态时时，以以发发射射电电磁磁辐辐射射(即光即光)的形式释放能量。的形式释放能量。分子发光：分子发光：分子分子+电能电能化学能化学能光能光能生物活性参生物活性参与化学发光与化学发光 电致发光电致发光化学发光化学发光光致发光光致发光生物发光生物发光荧光荧光磷光磷光第四页，本课件共有60页*分子发光：分子发光：光致发光：光致发光：光第五页，本课件共有60页*2.1 2.1 荧光分析法荧光分析法2.1.1 2.1.1 荧光分析法基本概念荧光分析法基本概念2.1.2 2.1.2 荧光强度及影响因素荧光强度及影响因素2.1.3 2.1.3 仪器装置仪器装置2.1.4 2.1.4 定量分析方法定量分析方法2.1.5 2.1.5 荧光分析测定方法、特点和应用荧光分析测定方法、特点和应用第六页，本课件共有60页*A A 分子的激发态分子的激发态分子激发态和三线激发态分子激发态和三线激发态激发态：激发态：基基态态分分子子吸吸收收能能量量后后，价价层层电电子子跃跃迁迁到到高高能能级级的的分分子子轨轨道道上上称称为为电电子子激激发发态态。是是分分子子的的亚亚稳稳定定状状态态。基态：基态：在正常状态下，分子处于在正常状态下，分子处于最低能级最低能级的分子轨道的分子轨道上称为基态。是分子的上称为基态。是分子的稳定状态稳定状态。2.1.1 2.1.1 荧光分析法基本概念荧光分析法基本概念2.1.1.1 荧光及其产生第七页，本课件共有60页*电子自旋多重度电子自旋多重度 电电子子从从基基态态跃跃迁迁到到激激发发态态，分分子子中中的的电电子子可可以以处处在不同的自旋状态在不同的自旋状态,常用常用电子自旋多重度电子自旋多重度来描述来描述。M=2S+1S是电子的总自旋量子数，各电子自旋量子数的代数和。是电子的总自旋量子数，各电子自旋量子数的代数和。2.1.1.1 荧光及其产生第八页，本课件共有60页*单重态（单重态（M=1）：）：电子自旋都配对的分子的电子态电子自旋都配对的分子的电子态称为单重态，称为单重态，用用“S”表示。表示。三三重重态态（M=3）：分分子子中中的的电电子子对对的的电电子子自自旋旋平平行行的电子态称为三重态，的电子态称为三重态，用用“T”表示。表示。S2 T2 S1 T1 S0(洪特规则洪特规则)M=2S+1M自旋多重度自旋多重度S总自旋量子数总自旋量子数2.1.1.1 荧光及其产生第九页，本课件共有60页*2022/12/3S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫分子荧光和磷光发射过程第十页，本课件共有60页*电电子子处处于于激激发发态态是是不不稳稳定定状状态态，返返回回基基态态时时，通通过过辐辐射跃迁射跃迁(发光发光)和和非辐射跃迁非辐射跃迁(热热)等方式失去能量。等方式失去能量。传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光磷光磷光内转换内转换系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫非辐射跃迁非辐射跃迁延迟荧光延迟荧光外转换外转换返回速度快的途径，发生几率大返回速度快的途径，发生几率大!B B 分子去激发过程及荧光的产生分子去激发过程及荧光的产生2.1.1.1 荧光及其产生第十一页，本课件共有60页*e（1）.振振动动弛弛豫豫：同同一一电电子子能能级级内内以以热热能能量量交交换换形形式式由由高高振振动动能能级级至至低低相相邻邻振振动动能能级级间间的的跃跃迁迁。发发生生振振动时间动时间10-11 10-13 s。1 1、非辐射跃迁、非辐射跃迁2.1.1.1 荧光及其产生第十二页，本课件共有60页*e（2）.内内转转换换：相相同同多多重重度度的的电电子子能能级级中中,相相等等能能级级间间的非辐射能级交换。发生内转换的时间的非辐射能级交换。发生内转换的时间10-12 s。2.1.1.1 荧光及其产生第十三页，本课件共有60页*e（3）.系系间间跨跨越越：不不同同多多重重态态在在有有重重叠叠的的转转动动能能级级间间的的非非辐辐射射跃跃迁迁。电电子子自自旋旋改改变变，跃跃迁迁禁禁阻阻，通通过过自自旋旋-轨轨道耦合等跃迁。道耦合等跃迁。2.1.1.1 荧光及其产生第十四页，本课件共有60页*（4）.外外转转换换：激激发发态态分分子子与与溶溶剂剂或或其其他他分分子子之之间间产产生生相相互互作作用用而而损损失失能能量量回回到到基基态态的的非非辐辐射射跃迁。跃迁。外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。2.1.1.1 荧光及其产生第十五页，本课件共有60页*（1）.荧荧光光发发射射：电电子子由由第第一一激激发发单单重重态态的的最最低低振振动动能能级级基态各振动能级基态各振动能级，发射时间约为发射时间约为10-710-9 s。发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长。发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长。e2 2、辐射跃迁、辐射跃迁2.1.1.1 荧光及其产生第十六页，本课件共有60页*（2）.磷光发射磷光发射：电子由电子由第一激发三重态的最低振动第一激发三重态的最低振动能级能级基态各振动能级基态各振动能级。发光时间：。发光时间：10-410s。eS0 激发态激发态振动弛豫振动弛豫内转换内转换系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T1 S0 2.1.1.1 荧光及其产生第十七页，本课件共有60页*1 1、荧光激发光谱、荧光激发光谱 固固定定荧荧光光测测量量波波长长，改改变变激激发发光光的的波波长长，测测量量不不同同波波长长ex激激发发光光照照射射下下荧荧光光强强度度的的变变化化，记记录录荧荧光光强强度度F F与与激激发发光波长的关系曲线。光波长的关系曲线。2.1.1.2 荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线第十八页，本课件共有60页*2 2、荧光发射光谱荧光发射光谱 固固定定激激发发光光波波长长和和强强度度，记记录录在在不不同同波波长长emem下下所所发发射射的的荧荧光光强强度度所所得得关关系系曲曲线线即即不不同同波长下荧光强度的分布。波长下荧光强度的分布。发射光谱的形状与激发波长无关。发射光谱的形状与激发波长无关。2.1.1.2 荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线第十九页，本课件共有60页*荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系 2.1.1.2 荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线 吸收光谱的形状表明了分子第一激发单重态的振动能级；发射光谱表明分子基态的振动能级结构。基态与激发态两者的振动能级结构相似，激发与去激发组成相反的两个过程。S S0 03 32 21 10 0S S1 13 32 21 10 0第二十页，本课件共有60页*分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件1.具具有有合合适适的的结结构构：通通常常是是含含有有苯苯环环和和稠稠环环的的刚刚性结构的有机分子；性结构的有机分子；2.具有一定的荧光量子产率。具有一定的荧光量子产率。2.1.1.3 荧光效率第二十一页，本课件共有60页*=发射荧光的分子数发射荧光的分子数激发分子总数激发分子总数2.1.1.3 荧光效率荧光量子产率（荧光量子产率（）：）：衡量荧光物质发光能力。衡量荧光物质发光能力。它表示激发分子发射出荧光它表示激发分子发射出荧光(或磷光或磷光)的比例。的比例。第二十二页，本课件共有60页*荧荧光光量量子子产产率率与与激激发发态态能能量量释释放放各各过过程程的的速速率率常常数数有有关关，可可用用各各过过程程的的速速率率常常数数来来表表示示荧荧光光量量子产率：子产率：荧光发射过程的速荧光发射过程的速率常数，取决于分率常数，取决于分子结构。子结构。各各种种非非辐辐射射跃跃迁迁过过程程的的速速率率常常数数之之和和。取取决决于于分分子子所所处处的的化化学学环环境境，同同时时也也与与化化学学结结构构有有关。关。2.1.1.3 荧光效率第二十三页，本课件共有60页*荧荧光光分分子子与与其其他他分分子子相相互互作作用用引引起起荧荧光光强强度度降降低低甚至荧光消失的现象为甚至荧光消失的现象为荧光猝灭荧光猝灭，又称荧光熄灭。，又称荧光熄灭。（1 1）、）、碰撞猝灭碰撞猝灭-动态猝灭动态猝灭 M*+Q M +Q +热量热量激发态分子激发态分子猝灭剂猝灭剂2.1.1.4 猝灭第二十四页，本课件共有60页*（2 2）、）、生成化合物的猝灭生成化合物的猝灭-静态猝灭静态猝灭 M +Q M Q 基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光的化合基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光的化合物，导致荧光的猝灭。物，导致荧光的猝灭。2.1.1.4 猝灭（3 3）、）、能量转移能量转移 M*+Q M+Q*激发态的分子与猝灭剂作用，能量发生转移，激发态的分子与猝灭剂作用，能量发生转移，猝灭剂被激发。猝灭剂被激发。第二十五页，本课件共有60页*（5 5）、）、自猝灭自猝灭 荧光物质的浓度较大时，激发态分子之间碰撞荧光物质的浓度较大时，激发态分子之间碰撞较多，在碰撞中引起能量损失，产生自熄，使荧光较多，在碰撞中引起能量损失，产生自熄，使荧光强度减小。强度减小。2.1.1.4 猝灭（4 4）、）、氧的猝灭氧的猝灭 氧氧对对溶溶液液荧荧光光产产生生猝猝灭灭作作用用的的原原因因比比较较复复杂杂，可能包含着多种机理。可能包含着多种机理。第二十六页，本课件共有60页*2.1.2 荧光强度及影响因素荧光强度及影响因素2.1.2.1 荧光强度与溶液浓度的关系2.1.2.2 有机物的荧光与其结构的关系2.1.2.3 金属离子螯合物的荧光2.1.2.4 实验条件对荧光强度的影响第二十七页，本课件共有60页*Epsilon（大写，小写），是第五个希腊字母。汉字读音：艾普西龙朗伯-比尔定律P15第二十八页，本课件共有60页*A A 跃迁的类型跃迁的类型 n*max100 平均寿命平均寿命10-510-7 s；*max104 平均寿命平均寿命10-710-8 s *是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型，具有是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型，具有*共轭双键的分子才能发射较强的荧光。共轭双键的分子才能发射较强的荧光。2.1.2.2 有机物的荧光与其结构的关系荧光的产生是分子先经历*或n*激发，然后经振动弛豫或其他非辐射跃迁再发生*或*n 而得到荧光。第二十九页，本课件共有60页*B B 共轭效应共轭效应 产产生生荧荧光光的的有有机机物物质质，都都含含有有共共轭轭双双键键体体系系，共共轭轭体体系系越越大大，荧荧光光量量子子产产率率越越高高，向向长长波波方方向向移移动动。化合物化合物量子产率量子产率F ex（nm）em（nm）苯苯萘萘蒽蒽丁省丁省2052863653902.1.2.2 有机物的荧光与其结构的关系0.110.280.360.52278321404480第三十页，本课件共有60页*C C 分子共平面效应分子共平面效应芴芴 =1联苯联苯 =0.2荧光分子的共平面性增加，则共轭体系大，有荧光分子的共平面性增加，则共轭体系大，有利于利于*跃迁。跃迁。2.1.2.2 有机物的荧光与其结构的关系第三十一页，本课件共有60页*荧光黄荧光黄 =0.92酚酞酚酞 =02.1.2.2 有机物的荧光与其结构的关系第三十二页，本课件共有60页*D D 取代基效应取代基效应1.给电子取代基加强荧光给电子取代基加强荧光-NH2，-NHR，-NR2，-OH，-OR，-CN产生产生 p 共轭共轭2.吸电子取代基减弱荧光吸电子取代基减弱荧光-C=O，-COOH，-NO2摩尔吸光系数小，荧光发射弱，系间跨跃较大，同摩尔吸光系数小，荧光发射弱，系间跨跃较大，同样使荧光减弱。样使荧光减弱。2.1.2.2 有机物的荧光与其结构的关系第三十三页，本课件共有60页*D D 取代基效应取代基效应2.1.2.2 有机物的荧光与其结构的关系A A 跃迁的类型跃迁的类型B B 共轭效应共轭效应C C 分子共平面效应分子共平面效应第三十四页，本课件共有60页*2.1.2.3 金属离子螯合物的荧光（2 2）螯合物中金属离子的发光）螯合物中金属离子的发光（1 1）螯合物中配位体的发光）螯合物中配位体的发光第三十五页，本课件共有60页*2.1.2.3 金属离子螯合物的荧光（1 1）螯合物中配位体的发光）螯合物中配位体的发光 不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大，常会发生荧光。如8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属螯合物具有很强的荧光。第三十六页，本课件共有60页*2.1.2.3 金属离子螯合物的荧光 这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的跃迁激发，接着配位体把能量转给金属离子，导致dd 跃迁和ff跃迁，最终发射的是dd跃迁和ff跃迁光谱。（2 2）螯合物中金属离子的发光）螯合物中金属离子的发光第三十七页，本课件共有60页*2 2、溶剂、溶剂3 3、溶液黏度和、溶液黏度和温度温度 4 4、溶液的、溶液的PH值值2.1.2.4 实验条件对荧光强度的影响1 1、激发光源、激发光源第三十八页，本课件共有60页*2.1.2.4 实验条件对荧光强度的影响1 1、激发光源、激发光源激发光强度激发光强度I I0 0大，荧光强度增大，灵敏度增高。大，荧光强度增大，灵敏度增高。2 2、溶剂、溶剂 主主要要表表现现为为溶溶剂剂的的极极性性、氢氢键键、配配位位键键的的形形成成对对化化合物的荧光发生变化。合物的荧光发生变化。*跃跃迁迁类类型型：溶溶剂剂极极性性增增大大，跃跃迁迁能能量量降降低低，发发生红移，生红移，荧光增强荧光增强。氢氢键键、配配位位键键的的形形成成主主要要影影响响荧荧光光分分子子的的存存在在型型体体、电离状态电离状态，荧光强度和形状均发生很大变化。，荧光强度和形状均发生很大变化。第三十九页，本课件共有60页*3 3、溶液黏度和、溶液黏度和温度温度 黏度大，温度低，可减小碰撞引起的荧光熄灭，荧黏度大，温度低，可减小碰撞引起的荧光熄灭，荧光强度增大。光强度增大。温度升高，外转换的几率增加，荧光强度降低。温度升高，外转换的几率增加，荧光强度降低。4 4、溶液的、溶液的PH值值不同不同PH值下，荧光分子存在形式不同。值下，荧光分子存在形式不同。2.1.2.4 实验条件对荧光强度的影响第四十页，本课件共有60页*2.1.3 2.1.3 仪器装置仪器装置Cary Eclipse 荧光分光光度计荧光分光光度计荧光、磷光化学荧光、磷光化学/生物发光生物发光美国瓦里安技术中国有限公司美国瓦里安技术中国有限公司第四十一页，本课件共有60页*一、一、荧光分光光度计结构流程荧光分光光度计结构流程 2.1.3 仪器装置仪器装置光源光源样品池样品池激发激发单色器单色器检测器检测器数据处理数据处理仪器控制仪器控制发射发射单色器单色器组组成成：激激发发光光源源、样样品品池池、双双单单色色器器、检检测测器器、显显示系统。示系统。特殊点：特殊点：两个单色器两个单色器，光源与检测器通常成，光源与检测器通常成直角直角。第四十二页，本课件共有60页*1 1、激发光源激发光源 汞灯、碘钨灯、氙弧灯、激光等。汞灯、碘钨灯、氙弧灯、激光等。2 2、样品池样品池 I0ItIf样品池四面透光。样品池四面透光。2.1.3 仪器装置仪器装置第四十三页，本课件共有60页*4 4、检测器检测器 一般采用硒光电池。一般采用硒光电池。检测器的方向与激发光的方向成直角，以消检测器的方向与激发光的方向成直角，以消除样品池中除样品池中透射光和杂散光的干扰透射光和杂散光的干扰。3 3、单色器单色器 激发单色器：激发单色器：选择激发光波长，选择激发光波长，用以分离出所需用的激发光。用以分离出所需用的激发光。发射单色器：发射单色器：选择荧光发射波长，选择荧光发射波长，用以滤去杂散光、瑞利光、拉用以滤去杂散光、瑞利光、拉曼光和杂质所发射的荧光。曼光和杂质所发射的荧光。2.1.3 仪器装置仪器装置第四十四页，本课件共有60页*二、二、磷光分光光度计结构流程磷光分光光度计结构流程 光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器斩波器（磷光镜）利用荧光和磷光发射寿利用荧光和磷光发射寿命的差别命的差别通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，来测定通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，来测定低温磷光。低温磷光。第四十五页，本课件共有60页*2 2、定量方法定量方法 1 1、定量依据定量依据 2.1.4 定量分析方法定量分析方法第四十六页，本课件共有60页*1 1、定量依据定量依据 荧荧光光强强度度 If 正正比比于于吸吸收收的的光光强强度度 Ia 和和荧荧光光量子产率量子产率：由朗伯由朗伯-比耳定律得：比耳定律得：荧光强度荧光强度 If：2.1.4 定量分析方法定量分析方法第四十七页，本课件共有60页*对于稀溶液，当对于稀溶液，当 2.303 bC 0.05时：时：If-荧光强度荧光强度I0-入射光强度入射光强度f-荧光量子产率荧光量子产率b-吸收光程吸收光程 -摩尔吸光系数摩尔吸光系数C-物质浓度物质浓度2.1.4 定量分析方法定量分析方法第四十八页，本课件共有60页*2 2、定量方法定量方法 标准曲线法：标准曲线法：FCsFxCx2.1.4 定量分析方法定量分析方法第四十九页，本课件共有60页*A A 无机化合物的荧光分析无机化合物的荧光分析如如MgMg、AlAl、CaCa等，本身不发射荧光，但与有机试剂可形成等，本身不发射荧光，但与有机试剂可形成荧光配合物进行定量测定；荧光配合物进行定量测定；直接法直接法：如：如8-8-羟基喹啉与羟基喹啉与AlAl离子反应生成荧光配合物离子反应生成荧光配合物 安息香，安息香，水杨醛缩邻氨基苯酚，黄酮醇，水杨醛缩邻氨基苯酚，黄酮醇，二苯乙醇酮二苯乙醇酮 2.1.5 荧光分析测定方法、特点和应用荧光分析测定方法、特点和应用第五十页，本课件共有60页*荧光熄灭法第五十一页，本课件共有60页*B B 有机化合物的荧光分析有机化合物的荧光分析本身发射荧光的，如罗丹明本身发射荧光的，如罗丹明B B、荧光素等可直接测定；、荧光素等可直接测定；不发射荧光的物质可经过处理后成为发射荧光的物质进行不发射荧光的物质可经过处理后成为发射荧光的物质进行测定；测定；第五十二页，本课件共有60页*C C：蛋白质的荧光分析：蛋白质的荧光分析1.蛋白质的基本结构，有的氨基酸自身可以发荧光，例如：酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸第五十三页，本课件共有60页*2.荧光胺和氨基反应生成具有荧光的产物3.邻苯二甲醛（OPA）在一定的条件下可与伯胺、多胺生成具有荧光的产物第五十四页，本课件共有60页*D D 核酸检测生命物质核酸检测生命物质常选用一些荧光分子作为探针，通过探针标记分子的荧光变化来常选用一些荧光分子作为探针，通过探针标记分子的荧光变化来研究脱氧核糖酸研究脱氧核糖酸(DNA)(DNA)与小分子及药物的作用机理，从而探讨与小分子及药物的作用机理，从而探讨致病原因及筛选和设计新的高效低毒药物。致病原因及筛选和设计新的高效低毒药物。第五十五页，本课件共有60页化合物对DNA的安全性电泳后点样处abcdpUC19(2686bp)质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，buffer:50mM Tris-HCl/50mM NaCl(Ph 7.4)，化合物2.0uM浓度下的损伤测试（37 1h）a:DNA空白对照 b:巯基乙胺(12.0uM)+DNA c:DNA+2.0uM化合物 d:巯基乙胺+DNA+2.0uM化合物第五十六页，本课件共有60页*分子磷光分析法特点 发光速率慢 寿命比荧光长10-410s 辐射的波长比荧光的长 磷光的发光寿命和辐射强度对重原子及其敏感（使用含碘甲烷的混合溶剂）受温度影响大，低温强度大 第五十七页，本课件共有60页*稠环芳烃和杂环化合物稠环芳烃和杂环化合物 具有较大的致癌性具有较大的致癌性第五十八页，本课件共有60页*DDT等52种农药植物生长激素（0.001mg/mL）血液和尿中的阿司匹林、苯巴比妥可卡因、致幻剂、抗凝剂第五十九页，本课件共有60页*作业作业1.激发态分子去激发的过程有哪些激发态分子去激发的过程有哪些?荧光荧光发射和磷光发射经过哪些过程发射和磷光发射经过哪些过程?为什么磷光为什么磷光发射比荧光发射慢发射比荧光发射慢?2.为什么有的分子能够发射荧光为什么有的分子能够发射荧光,有的不能有的不能?有机物的荧光与其结构的关系是怎样的有机物的荧光与其结构的关系是怎样的?3.根据所学知识，写出根据所学知识，写出2个可能发出荧光的个可能发出荧光的化合物，并阐明为什么有可能发出荧光化合物，并阐明为什么有可能发出荧光第六十页，本课件共有60页