第六章基因的重组与转移优秀PPT.ppt

第六章基因的重组与转第六章基因的重组与转移移第一页，本课件共有82页第二页，本课件共有82页一、粘性末端的连接一、粘性末端的连接第一节第一节 DNA片段的体外连接片段的体外连接（一）同一种酶产生的黏性末端的连接（一）同一种酶产生的黏性末端的连接第三页，本课件共有82页第四页，本课件共有82页（二）不同种酶产生的黏性末端的连接（二）不同种酶产生的黏性末端的连接第五页，本课件共有82页二、齐平末端（二、齐平末端（blunt end）的连接）的连接5端与端与3端并列靠近的时间太短，不容易端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。被连接酶连接。1.直接连接直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的率很低，只有粘性末端的1%。55553333-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-53-OH-PP-HO-53第六页，本课件共有82页1972年，斯坦福大学的年，斯坦福大学的P.Labban和和P.Kaiser提出。提出。（1）同聚加尾）同聚加尾 法法 2.人工加尾形成人工加尾形成“粘性末端粘性末端”DNA末端转移酶末端转移酶能在没有模板的情况下能在没有模板的情况下给给DNA的的3-OH端端加上脱氧核苷酸。加上脱氧核苷酸。原理：原理：分别给载体和插入片断加上分别给载体和插入片断加上互补的互补的核苷酸。核苷酸。加尾加尾碱基互补碱基互补第七页，本课件共有82页缺点缺点：优点优点：能把任何能把任何片段连接片段连接起来起来不能把插不能把插入片段再入片段再切下来。切下来。非酶切位点非酶切位点第八页，本课件共有82页用用T4 DNA连接酶连到平端连接酶连到平端DNA上，然后上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。再用酶切，形成一个人工粘性末端。（2）衔接物）衔接物(linker)连接连接 linker用化学合成法合成的一段用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制的特定限制性内切酶识别位点序列的性内切酶识别位点序列的平端双链平端双链。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRI linker：linker的作用的作用第九页，本课件共有82页 第十页，本课件共有82页 第十一页，本课件共有82页缺点：缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段完整的插入片段2）能给载体连接上）能给载体连接上Polylinker:优点：优点：第十二页，本课件共有82页（3）DNA接头接头(adapter)连接法连接法1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。年康内尔大学的吴瑞教授发明。5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5BamHI adapter用用T4DNA连接酶连到连接酶连到DNA分子的两端，分子的两端，直接成为人工粘性末端。直接成为人工粘性末端。adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。切位点序列）。adapter的作用的作用第十三页，本课件共有82页Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5BamHI adapterP-P5p-GATCCCGG-GGCC-CCGG-GGCCCTAG-P55p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5接头自我连接接头自我连接第十四页，本课件共有82页第十五页，本课件共有82页接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与影响与DNA片段的连接。片段的连接。优点：优点：连上后就能用。连上后就能用。缺点：缺点：先用小牛肠先用小牛肠碱性磷酸酶碱性磷酸酶（CIP）处理接头，）处理接头，水解掉其水解掉其5端的磷酸，防止自我连接。端的磷酸，防止自我连接。（以后再用（以后再用T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶加上磷酸。）加上磷酸。）防止自我连接防止自我连接第十六页，本课件共有82页5p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P P-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！5GATCCCGG-OH HO-GGCC5 5CCGG-OHHO-GGCCCTAG5CIP处理处理-OHHO-第十七页，本课件共有82页Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5BamHI adapterP-P 5GATCCCGG-HO-GGCC CCGG-OH-GGCCCTAG55GATCCCGG-OH3 HO-GGCC5缺口缺口缺口缺口HO-OHCIP处理处理T4 ligase虽然有缺口，但仍然能与虽然有缺口，但仍然能与DNADNA片断连接。片断连接。第十八页，本课件共有82页三、三、PCR产物的连接产物的连接1.在引物的在引物的5端设计酶切位点端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；符合载体的多克隆位点；（1）设计原则）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构）带酶切位点的引物的结构3端端1520bp与模板互补；与模板互补；5端端610bp是某个内切酶的识别序列。是某个内切酶的识别序列。（5端多余的端多余的35bp属属保护碱基保护碱基）避免与所扩增的避免与所扩增的DNADNA片断内部酶切位点重复。片断内部酶切位点重复。第十九页，本课件共有82页引物引物1GCAGAATTC互补序列互补序列模板模板EcoRI位点位点5-3GCAGAATTC互补序列互补序列5-33模板模板GCAGAATTC互补序列互补序列 PCR产物产物5-33复性复性延伸延伸模板模板模板模板33第二十页，本课件共有82页GCTAGCCGG互补序列互补序列模板模板BamH I 位点位点-53-5复性复性延伸延伸模板模板模板模板33GCTAGCCGG互补序列互补序列-53-模板模板5GCTAGCCGGPCR产物产物 互补序列互补序列-53-引物引物2第二十一页，本课件共有82页带酶切位点的带酶切位点的PCR产物产物GCAGAATTCPCR产物产物5-3GCTAGCCGGPCR产物产物-53-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位点位点BamHI位点位点AATTCPCR产物产物5-3GCTAGPCR产物产物-53-GCEcoRI BamHI两头各有一个粘性末端！两头各有一个粘性末端！第二十二页，本课件共有82页2.与与T载体直接连接载体直接连接（1）PCR产物两个产物两个3端一般都有一个端一般都有一个ATaq DNA聚合酶的特性：在聚合酶的特性：在DNA双链的双链的3端再加上一个多余的核苷酸（优先端再加上一个多余的核苷酸（优先加加A）。）。（2）T载体的两个载体的两个3端人为地各加一个端人为地各加一个T利用利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加时，被迫在平端载体上添加T！第二十三页，本课件共有82页AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶聚合酶载体载体PCR产物产物TATA第二十四页，本课件共有82页四、四、DNA体外连接应注意的事项体外连接应注意的事项1.插入片断与载体的酶切位点互补插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。尽量避免平端连接。决不能进行非粘性末端连接。决不能进行非粘性末端连接。第二十五页，本课件共有82页EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切）用相同的酶切（2）用同尾酶切）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生都产生GATC4个碱基的粘性末端。个碱基的粘性末端。第二十六页，本课件共有82页2.DNA插入的方向正确插入的方向正确用双酶切用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI第二十七页，本课件共有82页3.插入基因的开放阅读框（插入基因的开放阅读框（ORF）正确）正确（1）DNA定向插入定向插入（2）起始密码）起始密码尤其当尤其当载体上有载体上有ATG起始密码的时候，起始密码的时候，更要注意。更要注意。ATGGAATTC载体载体ATGCGGAATTCT插入片断插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTC T重组重组但移码突变！但移码突变！第二十八页，本课件共有82页4.防止载体自身环化连接防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的载体切口的5磷酸被除去，不能自我连磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。接。但可以与插入片断以单链连接。53载体载体插入片断插入片断第二十九页，本课件共有82页1.载体自身环化连接（能存活）载体自身环化连接（能存活）2.载体之间互相连接（能存活）载体之间互相连接（能存活）3.插入片段互相连接（不能存活）插入片段互相连接（不能存活）4.一个载体与几个插入片段重组（能存活）一个载体与几个插入片段重组（能存活）五、载体和外源五、载体和外源DNA插入片段的连接结果插入片段的连接结果5.几个载体与一个插入片段重组（能存活）几个载体与一个插入片段重组（能存活）第三十页，本课件共有82页第三十一页，本课件共有82页1.目的目的增加受体菌增加受体菌细胞膜的通细胞膜的通透性。透性。第二节第二节 重组体导入细菌细胞重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备一、感受态大肠杆菌的制备第三十二页，本课件共有82页使用丧失了使用丧失了限制体系限制体系的大肠杆菌。如的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。系列的大肠杆菌。2.菌种菌种第三十三页，本课件共有82页第三十四页，本课件共有82页用用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理制备原理第三十五页，本课件共有82页4.制备过程制备过程培养大培养大肠杆菌肠杆菌OD600至至0.3-0.4On ice 5-10 min4离心离心收集菌收集菌用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬4离心离心收集菌收集菌4离心离心收集菌收集菌分装、分装、-70 冻存冻存用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬On ice 30 min用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬第三十六页，本课件共有82页二、重组二、重组DNA导入大肠杆菌导入大肠杆菌（1）转化（）转化（transformation)大肠杆菌捕获大肠杆菌捕获质粒质粒DNA的过程。的过程。（2）转染（）转染（transfection)大肠杆菌捕获大肠杆菌捕获噬菌体噬菌体DNA的过程。的过程。1.外源外源DNA导入细菌的几种方法导入细菌的几种方法（3）转导（）转导（transduction)借助借助噬菌体噬菌体把外源把外源DNA导入细菌的过程。导入细菌的过程。第三十七页，本课件共有82页3.转化方法转化方法 2.转化率转化率简单简单，但转化效率不高（，但转化效率不高（106-108/gDNA）。）。（1 1）热休克法（）热休克法（）热休克法（）热休克法（heat shockheat shock）转化效率高（高于转化效率高（高于109/gDNA）。）。（2 2）电转化法）电转化法）电转化法）电转化法n n转化率是指转化率是指转化率是指转化率是指DNADNA分子转化受体菌获得转化子的效率，有两种表示方式：分子转化受体菌获得转化子的效率，有两种表示方式：分子转化受体菌获得转化子的效率，有两种表示方式：分子转化受体菌获得转化子的效率，有两种表示方式：n n一是以转化子数与用于转化处理的一是以转化子数与用于转化处理的一是以转化子数与用于转化处理的一是以转化子数与用于转化处理的DNADNA分子数或质量的比率表示；分子数或质量的比率表示；分子数或质量的比率表示；分子数或质量的比率表示；n n二是以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示。二是以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示。二是以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示。二是以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示。n n用每单位质量的用每单位质量的用每单位质量的用每单位质量的DNADNA分子获得的转化子数来表示，难以反映分子大小与转分子获得的转化子数来表示，难以反映分子大小与转分子获得的转化子数来表示，难以反映分子大小与转分子获得的转化子数来表示，难以反映分子大小与转化率之间的关系。化率之间的关系。化率之间的关系。化率之间的关系。第三十八页，本课件共有82页10ng载体载体DNA100 L感受感受态菌态菌On ice混混合，静置合，静置10分钟分钟42C 1分钟分钟加入加入1mL LB培养基培养基37摇摇1小时小时10-100 L转化转化液涂含抗菌素的液涂含抗菌素的平板平板吸附吸附DNA摄入摄入DNA（1）热休克法）热休克法第三十九页，本课件共有82页LB培养受体菌至培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴冰浴15分钟，分钟，2C离心集菌离心集菌冰冷的水重冰冷的水重悬菌体悬菌体2C离心离心集菌集菌冰冷的水重冰冷的水重悬菌体悬菌体2C离心离心收集菌体收集菌体少量冰冷少量冰冷的水重悬的水重悬分装成分装成50-300 L电转仪调为电转仪调为2.5kV,25 F脉冲控制器脉冲控制器200-400 0.5 g质质粒粒DNAOn ice混合混合加入加入1mLSOC培养液培养液37C中速震中速震荡荡60分钟分钟10-100 L转化液涂含转化液涂含抗菌素的平板抗菌素的平板转化转化（2）电转化法）电转化法第四十页，本课件共有82页4.平板培养平板培养基培养细菌基培养细菌10-100 L转化转化液液涂于含抗涂于含抗菌素的平菌素的平板板37过夜过夜第四十一页，本课件共有82页5.影响转化率的因素影响转化率的因素(1)(1)分子质量较小的重组质粒分子质量较小的重组质粒分子质量较小的重组质粒分子质量较小的重组质粒DNADNA分子转化率较高，分子转化率较高，分子转化率较高，分子转化率较高，分子质量分子质量分子质量分子质量较大的重组质粒较大的重组质粒较大的重组质粒较大的重组质粒DNADNA分子转化率较低，对于大于分子转化率较低，对于大于分子转化率较低，对于大于分子转化率较低，对于大于15kb15kb的重组的重组的重组的重组质粒则很难进行转化。质粒则很难进行转化。质粒则很难进行转化。质粒则很难进行转化。(2)(2)组成重组组成重组组成重组组成重组DNADNA分子的载体类型及其构型。分子的载体类型及其构型。分子的载体类型及其构型。分子的载体类型及其构型。与受体细胞亲和与受体细胞亲和与受体细胞亲和与受体细胞亲和性性性性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体，而较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体，而较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体，而较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体，而处于处于处于处于自然双螺旋闭环结构的质粒载体自然双螺旋闭环结构的质粒载体自然双螺旋闭环结构的质粒载体自然双螺旋闭环结构的质粒载体比开环结构、成线性结比开环结构、成线性结比开环结构、成线性结比开环结构、成线性结构的质粒载体有更高的转化率。构的质粒载体有更高的转化率。构的质粒载体有更高的转化率。构的质粒载体有更高的转化率。(3)(3)重组重组重组重组DNADNA分子的浓度和纯度。分子的浓度和纯度。分子的浓度和纯度。分子的浓度和纯度。在在在在10ng10ng100u1100u1以下的以下的以下的以下的DNADNA浓度范围内，转化效率与浓度范围内，转化效率与浓度范围内，转化效率与浓度范围内，转化效率与DNADNA分子数成正比关系。分子数成正比关系。分子数成正比关系。分子数成正比关系。第四十二页，本课件共有82页生长状态生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。必须在冰冷的条件下制备。必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。储存感受态菌要在储存感受态菌要在-70以下以下CaCl2处理处理使用感受态菌时必须迅速融化使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。融化后一般不能再次冻存使用。（4）感受态细胞）感受态细胞 （competent cells)第四十三页，本课件共有82页把重组的噬菌体把重组的噬菌体 DNA或或Cosmid质粒质粒DNA包装成具有感染能力的包装成具有感染能力的 噬菌体颗粒。噬菌体颗粒。6.体外包装的噬菌体的转导体外包装的噬菌体的转导（1）体外包装（）体外包装（in vitro packaging）（2）转导（）转导（transduction）通过受体菌细胞表面的通过受体菌细胞表面的 DNA接受器位点接受器位点（receptor site)，使带有外源基因的重组，使带有外源基因的重组体体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。注入受体大肠杆菌进行扩增。第四十四页，本课件共有82页cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在染细菌后，在32下培养细菌时能够保持下培养细菌时能够保持溶源性。溶源性。但当温度升高到但当温度升高到4445时，就会导致时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。（3）cI857基因突变的基因突变的 噬菌体噬菌体 但由于该噬菌体的但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。所以细菌还不裂解。第四十五页，本课件共有82页cI857其它基因其它基因溶源状态（溶源状态（DNA不转录、不翻译）不转录、不翻译）DNA阻遏阻遏蛋白蛋白阻遏阻遏蛋白蛋白4445 DNA转录、翻译合成外壳蛋白转录、翻译合成外壳蛋白32第四十六页，本课件共有82页 噬菌体噬菌体1外壳蛋白基因外壳蛋白基因E发生了无义突变，发生了无义突变，不不能合成头部蛋白能合成头部蛋白，但能合成其它外壳，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。蛋白（尾部蛋白）。在在cI857基因突变的基因突变的 噬菌体的基础上，选噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型择两种外壳蛋白的突变型 噬菌体。噬菌体。（4）互补型噬菌体互补型噬菌体 外壳蛋白基因外壳蛋白基因D发生了无义突变，发生了无义突变，不不能合成头部的包装识别蛋白能合成头部的包装识别蛋白，但能合，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。噬菌体噬菌体2第四十七页，本课件共有82页(5)体体外外包包装装过过程程 第四十八页，本课件共有82页体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每 g DNA能形成能形成106噬菌斑）。噬菌斑）。（6）转导转导 第四十九页，本课件共有82页转化率高的菌株；转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。不育的菌株（不会与其他酵母接合）。第三节第三节 外源基因导入真核细胞外源基因导入真核细胞一、导入酵母细胞一、导入酵母细胞1.菌株选择菌株选择如：如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31第五十页，本课件共有82页（1）利用原生质球进行转化）利用原生质球进行转化2.酵母的转化方法酵母的转化方法 酵母酵母原生质体原生质体感受态感受态酶去壁酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因插入外源基因的酵母载体的酵母载体PEG（聚乙二醇）使（聚乙二醇）使细胞壁细胞壁具有通透性，允许具有通透性，允许DNA进入。进入。CaCl2使使细胞膜细胞膜具有通透性，允许具有通透性，允许DNA进入。进入。转化转化第五十一页，本课件共有82页 酵母酵母0.1mol/L LiCl处理处理插入外源基因的酵母载体插入外源基因的酵母载体感受态感受态40%PEG 4000（2）利用）利用Li+盐进行转化盐进行转化第五十二页，本课件共有82页农杆菌介导的农杆菌介导的Ti质粒载体转化法质粒载体转化法DNA直接转移法直接转移法二、导入植物细胞二、导入植物细胞第五十三页，本课件共有82页（1）农杆菌介导的）农杆菌介导的Ti质粒载体转化法质粒载体转化法n n用于植物基因转化操作的受体通常称为用于植物基因转化操作的受体通常称为用于植物基因转化操作的受体通常称为用于植物基因转化操作的受体通常称为外植体外植体外植体外植体；n n一般从以下几个方面选择合适的转化外植体：一般从以下几个方面选择合适的转化外植体：一般从以下几个方面选择合适的转化外植体：一般从以下几个方面选择合适的转化外植体：优先考虑叶片、子叶、胚轴等材料优先考虑叶片、子叶、胚轴等材料优先考虑叶片、子叶、胚轴等材料优先考虑叶片、子叶、胚轴等材料幼年期外植体幼年期外植体转化的外植体易培养，并有较强的再生能力转化的外植体易培养，并有较强的再生能力转化的外植体易培养，并有较强的再生能力转化的外植体易培养，并有较强的再生能力注意易被转化的分生组织感受态细胞所在的部位及注意易被转化的分生组织感受态细胞所在的部位及注意易被转化的分生组织感受态细胞所在的部位及注意易被转化的分生组织感受态细胞所在的部位及其数量。其数量。其数量。其数量。第五十四页，本课件共有82页外植体的农杆菌接种外植体的农杆菌接种n n把农杆菌接种到外植体的把农杆菌接种到外植体的损伤切面损伤切面；n n方法：将切成小块的外植体方法：将切成小块的外植体浸泡浸泡在准备好的在准备好的工程菌液中，浸泡一定时间后，转至无菌工程菌液中，浸泡一定时间后，转至无菌的吸水纸上，吸干外植体非伤口面的菌液，的吸水纸上，吸干外植体非伤口面的菌液，再进行再进行共培养共培养。第五十五页，本课件共有82页n n将接种农杆菌后的外植体培养在将接种农杆菌后的外植体培养在诱导诱导愈伤组愈伤组织织或或不定芽不定芽固体分化培养基固体分化培养基上，随着外植体上，随着外植体的细胞分裂和生长，农杆菌在外植体切口面的细胞分裂和生长，农杆菌在外植体切口面也进行着增殖生长，故该培养过程称之为也进行着增殖生长，故该培养过程称之为农农杆菌与外植体的共培养。杆菌与外植体的共培养。n n在此期间完成农杆菌的附着浸染、在此期间完成农杆菌的附着浸染、T-DNA的的转移及整合。转移及整合。第五十六页，本课件共有82页脱菌培养脱菌培养n n把共培养后的外植体转移到含有抗生素的培把共培养后的外植体转移到含有抗生素的培养基上继续培养生长，达到抑制和杀死农杆养基上继续培养生长，达到抑制和杀死农杆菌。菌。n n头孢霉素头孢霉素n n脱菌培养时间，一般需脱菌培养时间，一般需56次继代培养，甚次继代培养，甚至一直到试管苗形成。至一直到试管苗形成。n n另外，还需将外植体转移至另外，还需将外植体转移至筛选培养基筛选培养基上继续上继续培养，筛选出被转化的细胞，经培养，筛选出被转化的细胞，经再分化培养再分化培养成成再生植株。再生植株。第五十七页，本课件共有82页几种常用的农杆菌几种常用的农杆菌Ti质粒转化方法质粒转化方法n n叶盘转化法叶盘转化法n n植株接种共转化法植株接种共转化法n n植物愈伤组织共培养转化法植物愈伤组织共培养转化法n n原生质体原生质体共培养共培养转化法转化法n n植物悬浮细胞培养转化法植物悬浮细胞培养转化法第五十八页，本课件共有82页叶盘法转化植物细胞Leaf dish transformation由由Horsch等于等于1985年发展起来的一种转化方年发展起来的一种转化方法法第五十九页，本课件共有82页叶盘法操作程序：叶盘法操作程序：叶片表面除菌叶片表面除菌打孔器制备圆形叶片，即打孔器制备圆形叶片，即叶盘叶盘叶盘于农杆菌液浸泡数秒钟叶盘于农杆菌液浸泡数秒钟叶盘平铺培养平皿滤纸培养叶盘平铺培养平皿滤纸培养2天天筛选筛选长芽培养基长芽培养基进行筛选与再生培养进行筛选与再生培养生根培养基生根培养基上诱导幼芽生根上诱导幼芽生根小植株移栽在土壤中小植株移栽在土壤中第六十页，本课件共有82页植物原生质体植物原生质体植物原生质体植物原生质体的再生程序的再生程序的再生程序的再生程序第六十一页，本课件共有82页（2）DNA的直接转移法的直接转移法物理方法物理方法：电穿孔法电穿孔法基因枪法基因枪法显微注射法显微注射法超声波介导转化法超声波介导转化法激光微束穿孔法激光微束穿孔法化学方法化学方法：多聚物介导法多聚物介导法脂质体介导法脂质体介导法生物方法生物方法：花粉管通道法花粉管通道法第六十二页，本课件共有82页原理：细胞生物学研究证明，细胞膜的磷脂双分子层可视为原理：细胞生物学研究证明，细胞膜的磷脂双分子层可视为一种电容，其静膜电位（一种电容，其静膜电位（VmVm）约为）约为l00mVl00mV，导电性很差。当把细，导电性很差。当把细胞置于外加电场中时，会使膜电位升高，双分子层两端电压形成差势，胞置于外加电场中时，会使膜电位升高，双分子层两端电压形成差势，随着外加电场电压升高，细胞膜被压缩变薄，当膜电压升到一定数值随着外加电场电压升高，细胞膜被压缩变薄，当膜电压升到一定数值时，膜被击穿。时，膜被击穿。可逆击穿：击穿小孔可在一定时间内复原。可逆击穿：击穿小孔可在一定时间内复原。不可逆击穿：击穿小孔不可修复，处理细胞成活率低。不可逆击穿：击穿小孔不可修复，处理细胞成活率低。电穿孔法（电穿孔法（electroporation)第六十三页，本课件共有82页植物细胞植物细胞原生质体原生质体纤维素酶和纤维素酶和果胶酶果胶酶DNA混合入电击混合入电击缓冲液缓冲液1-2kV,3-25 F电电击击愈伤组织愈伤组织幼苗幼苗分化分化第六十四页，本课件共有82页又称高速微型子弹射击法又称高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles)DNA1.2 m钨弹头钨弹头吸附吸附特制手枪特制手枪射击植物射击植物装入装入基因枪法（gene gun）第六十五页，本课件共有82页基因枪法的特点：基因枪法的特点：（2）受体广泛。）受体广泛。（3）操作简单。）操作简单。（1）转化效率高。）转化效率高。第六十六页，本课件共有82页 指在显微镜下，将指在显微镜下，将指在显微镜下，将指在显微镜下，将DNADNA由细胞玻璃针直接注入细胞。由细胞玻璃针直接注入细胞。由细胞玻璃针直接注入细胞。由细胞玻璃针直接注入细胞。可以将可以将可以将可以将DNADNA直接注入核内而减少溶酶体对外源直接注入核内而减少溶酶体对外源DNADNA的降解，有助于基因的整合与表达。的降解，有助于基因的整合与表达。适用于多种贴壁生长细胞及悬浮生长细胞，包适用于多种贴壁生长细胞及悬浮生长细胞，包括原代及传代细胞、胚胎细胞等括原代及传代细胞、胚胎细胞等。显微注射法显微注射法(microinjection)第六十七页，本课件共有82页n n超声波介导转化法超声波介导转化法n n利用利用低音强脉冲超声波低音强脉冲超声波的物理作用，可逆性的物理作用，可逆性地击穿细胞膜并形成膜通道，使外源地击穿细胞膜并形成膜通道，使外源DNA进进入细胞。入细胞。n n激光微束穿孔转化法激光微束穿孔转化法第六十八页，本课件共有82页化学法化学法n n多聚物介导法多聚物介导法 多聚物多聚物（如聚乙二醇、多聚赖氨酸、多（如聚乙二醇、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等）和聚鸟氨酸等）和二价阳离子二价阳离子（如（如Mg2+、Ca2+、Mn2+）与）与DNA混合，能在原生质体表面形成混合，能在原生质体表面形成沉淀颗粒沉淀颗粒，通过原生质体的，通过原生质体的内吞噬作用内吞噬作用而被而被吸收进入细胞内。吸收进入细胞内。第六十九页，本课件共有82页脂质体（脂质体（lipofectin）载体法）载体法脂类包埋脂类包埋DNA，通，通过细胞膜过细胞膜进入细胞。进入细胞。第七十页，本课件共有82页n花粉管通道法花粉管通道法 把外源把外源把外源把外源DNADNA涂于授粉涂于授粉涂于授粉涂于授粉的枝头上，使的枝头上，使的枝头上，使的枝头上，使DNADNA沿花沿花沿花沿花粉管通道或传递组织通过粉管通道或传递组织通过粉管通道或传递组织通过粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化还不珠心进入胚囊，转化还不珠心进入胚囊，转化还不珠心进入胚囊，转化还不具有正常细胞壁的卵、合具有正常细胞壁的卵、合子及早期的胚胎细胞。子及早期的胚胎细胞。子及早期的胚胎细胞。子及早期的胚胎细胞。第七十一页，本课件共有82页三、导入哺乳动物细胞三、导入哺乳动物细胞病毒颗粒转染法病毒颗粒转染法磷酸钙转导法磷酸钙转导法聚阳离子聚阳离子-DMSO转染法转染法脂质体介导法脂质体介导法电穿孔法电穿孔法显微注射技术显微注射技术第七十二页，本课件共有82页生物法生物法病毒颗粒转导法病毒颗粒转导法n n带有目的基因的病毒颗粒直接感染受体细胞；带有目的基因的病毒颗粒直接感染受体细胞；然后整合到染色体上。然后整合到染色体上。n n带有目的基因的缺陷载体辅助病毒一起感带有目的基因的缺陷载体辅助病毒一起感染受体细胞，可形成病毒颗粒。染受体细胞，可形成病毒颗粒。n n带有目的基因的带有目的基因的SV40早期转录缺陷载体，早期转录缺陷载体，感染感染COS细胞系。细胞系。第七十三页，本课件共有82页化学法化学法n n磷酸钙转染法磷酸钙转染法n nDEAE-葡聚糖转染法葡聚糖转染法n n聚阳离子聚阳离子-DMSO转染法转染法n n脂质体介导法脂质体介导法第七十四页，本课件共有82页（1）原理：）原理：磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法当当CaCl2CaCl2、DNA和磷酸盐缓冲液缓慢混合时，即有和磷酸盐缓冲液缓慢混合时，即有磷酸钙微细沉淀磷酸钙微细沉淀形成，这些细小颗粒可以吸附在细胞形成，这些细小颗粒可以吸附在细胞形成，这些细小颗粒可以吸附在细胞形成，这些细小颗粒可以吸附在细胞表面，通过细胞膜的内吞作用将表面，通过细胞膜的内吞作用将表面，通过细胞膜的内吞作用将表面，通过细胞膜的内吞作用将DNADNA吸收进入细胞质面吸收进入细胞质面吸收进入细胞质面吸收进入细胞质面后进入细胞核，其详细机制尚不明确。后进入细胞核，其详细机制尚不明确。后进入细胞核，其详细机制尚不明确。后进入细胞核，其详细机制尚不明确。DNADNA多以多以多以多以多拷贝首尾相连多拷贝首尾相连多拷贝首尾相连多拷贝首尾相连的串珠状排列进入细胞，在的串珠状排列进入细胞，在细胞中常以多拷贝形式存在。细胞中常以多拷贝形式存在。依据不同的细胞类型，平皿上最多依据不同的细胞类型，平皿上最多能有能有10%的细胞能吸收的细胞能吸收DNA沉淀。沉淀。第七十五页，本课件共有82页不需要载体。不需要载体。（2）特点：）特点：第七十六页，本课件共有82页n n该方法操作简单，又不需特殊仪器，瞬间转该方法操作简单，又不需特殊仪器，瞬间转移效率最高可达到移效率最高可达到2020，但长期表达效率，但长期表达效率较低，目前已被广泛运用于离体细胞的基较低，目前已被广泛运用于离体细胞的基因转移，是最普遍使用的方法之一。因转移，是最普遍使用的方法之一。第七十七页，本课件共有82页二乙氨乙基（二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡）葡萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。DEAE-葡萄糖传染法葡萄糖传染法葡聚糖葡聚糖葡聚糖葡聚糖+DNA吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNADNA可以进可以进入到细胞核里。入到细胞核里。第七十八页，本课件共有82页DEAE-dextran细胞细胞外源外源DNA预处理预处理摄入摄入DEAE-dextran外源外源DNA细胞细胞混合混合DEAE-dextran对细胞有毒对细胞有毒!第七十九页，本课件共有82页聚阳离子聚阳离子-DMSO-DMSO转染法转染法n n采用聚阳离子poly-brene处理哺乳动物细胞，增加细胞表面对DNA的吸附能力、然后再用25-30DMSO短暂处理细胞，增加膜的通透性，提高对DNA的捕获量。第八十页，本课件共有82页脂质体有商业试剂盒（如脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）。）。脂质体（脂质体（lipofectin）载体法）载体法脂类包埋脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。，通过细胞膜进入细胞。第八十一页，本课件共有82页物理法物理法n n显微注射转基因法显微注射转基因法n n电穿孔电穿孔DNA转移法转移法第八十二页，本课件共有82页