基因工程操作步骤课件.ppt

1.2 基因工程的基本操作程序1知识回顾：基因工程基本操作的四个步步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用 载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。2一、目的基因的获取1 1目的基因主要是目的基因主要是编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因：如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等。2 2获取目的获取目的基因基因的常用方法：的常用方法：1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成3原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点启动子终止子不编码蛋白质。：编码蛋白质,连续不间断编码区非编码区调控遗传信息表达,上 游有RNA聚合酶结合位点:基因结构4真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区内含子 外显子 启动子终止子编码区上游 编码区下游 编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用,上游有RNA聚合 酶结合位点(启动子)。与RNA聚合酶结合位点基因结构51.从基因文库中获取目的基因1.基因文库的概念:将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。2.基因文库的种类:基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库6基因组DNA文库与cDNA文库某生物体内全部DNA 许多DNA片段受体菌群体限制酶限制酶与运载体连接导入基因组文库cDNA反转录反转录受体菌群体与运载体连接导入cDNA文库某种生物某个时期的mRNA7真核细胞的cDNA的获取编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区DNA聚合酶剪接有关的酶RNA聚合酶mRNA前体mRNA单链DNAcDNA逆转录酶转录剪接逆转录复制启动子启动子终止子基因不含非编码序列。即不含非编码区和内含子8基因组DNA文库与cDNA文库的比较 文库类型文库类型 cDNA文库文库 基因组文库基因组文库 文库大小文库大小基因中启动子（具有启基因中启动子（具有启动作用的动作用的DNA片段）片段）基因中内含子基因中内含子(位于编码位于编码蛋白质序列的非编码蛋白质序列的非编码DNA片段）片段）基因多少基因多少 物种间的基因交流物种间的基因交流小大无有无有某种生物的部分基因 某种生物的全部基因可以部分基因可以9怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因 根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。102.利用PCR技术扩增目的基因1 1概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术。的核酸合成技术。2 2原理：原理：DNADNA复制复制原料：原料：模板模板DNADNA；DNADNA引物；四种脱氧核苷引物；四种脱氧核苷酸；热稳定酸；热稳定DNADNA聚合酶聚合酶多聚酶链式反应体外特定DNA片段3 3前提：前提：已知目的基因的一段核苷酸序列已知目的基因的一段核苷酸序列11PCR技术的操作过程a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。氢键单链DNA双链DNA链d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加_倍一125 5/3 3/G GG GT TC C3 3/5 5/G GA AC CC C5 5/3 3/引物引物G GG G变性复性复性延伸延伸1.目的基因DNA受热变性，解链；2.引物与单链互补结合；3.合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。5 5/3 3/A AG G引物引物13过程：14PCR技术的操作过程PCRPCR反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成指数指数(2(2n n)形式扩增形式扩增15PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制复制PCR技术技术场所场所原理原理条件条件解旋方式解旋方式酶酶特点特点结果结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋变复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、解旋酶、DNA连接酶等16PCR技术扩增过程a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，断裂，形成_ b、复性（55-60）：系统温度降低，引物 与DNA模板结合，形成局部_。c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。氢键单链DNA双链DNA链173.人工合成法 在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化学合成推测推测思考：化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？18人工合成法（真核生物）反转录法目的基因的信使RNA目的基因化学合成法肽链氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成推测推测单链DNA合成19课堂小结目的基因的获取1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成种类基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库20二、基因表达载体的构建 基因工程的核心1 1目的：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2 2基因基因表达载体表达载体的组成：的组成：复制原点复制原点+目的基因目的基因+启动子启动子+终止子终止子+标记基因标记基因21二、基因表达载体的构建核心（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。（2）用_切断目 的基因，使其产生_ _。（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同1.过程:222/1/2023可编辑修改24基因表达载体的构建基因工程的核心 1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。252、基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因它们各自的作用是什么?26启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来273.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因位于基因的首端,是mRNA结合位点位于基因的末端,终止转录检测目的基因是否导入受体细胞28 三、将目的基因导入受体细胞1 1转化：转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2 2常用的受体细胞：常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。和动植物细胞等。3 3目的基因导入受体细胞的原理：目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。291、目的基因导入植物细胞的方法（1）农杆菌转化法 农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植 物，对大多数单子叶植物没有感染能力。原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。30三、目的基因导入受体细胞构建基因表达载体转入农杆菌植物细胞导入稳定维持和表达过程：311、目的基因导入植物细胞的方法（2）基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞 操作方法：利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um。适用：单子叶植物321、目的基因导入植物细胞的方法（3）花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞 操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞 特点:十分简便经济。例：转基因抗虫棉332、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法程序目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵 新性状动物343、将目的基因导入微生物细胞微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少常用菌：大肠杆菌常用法：Ca2+处理获得感受态细胞过程：CaCa2+2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌感受态感受态 细胞细胞感受态细胞感受态细胞 吸收吸收DNADNA表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合35小结：将目的基因导入受体细胞生物种类生物种类植物细胞植物细胞动物细胞动物细胞微生物细胞微生物细胞常用方法常用方法农杆菌转化法农杆菌转化法显微注射技术显微注射技术CaCa2+2+处理法处理法受体细胞受体细胞体细胞体细胞受精卵受精卵原核细胞原核细胞转化过程转化过程将目的基因插入到将目的基因插入到TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA上上农杆菌农杆菌导入植导入植物细胞物细胞整合到受整合到受体细胞的体细胞的DNADNA表表达达将含有目的基因将含有目的基因的表达载体提纯的表达载体提纯取卵（受精卵）取卵（受精卵）显微注射显微注射受受精卵发育精卵发育获得获得具有新性状的动具有新性状的动物物CaCa2+2+处理细胞处理细胞感受态细胞感受态细胞重组表达载重组表达载体与感受态细体与感受态细胞混合胞混合感受感受态细胞吸收态细胞吸收DNADNA分子分子36 四、目的基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组DNA分子吗？1真正能摄入重组真正能摄入重组DNADNA分子的受体细胞很少。分子的受体细胞很少。2目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？不一定，需要检测不一定，需要检测371、鉴定分子水平的鉴定转基因生物的DNA探针15NN15NN14NN14NN（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因基因探针：放射性同位素等标记的DNA分子方法 DNA分子杂交技术变性变性变性变性381、鉴定分子水平的鉴定变性变性方法 分子杂交技术（2）检测目的基因是否转录出了mRNA探针15NN15NN转基因生物的mRNA14NN14NN391、鉴定分子水平的鉴定提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法抗原-抗体杂交苏云金杆菌苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质 出现杂交带脱分化组织培养402、鉴定个体水平的鉴定抗虫、抗病接种实验，活性比较实验例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。41目的基因的检测与鉴定检测导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法DNA分子杂交表达检测转录检测分子杂交翻译检测抗原抗体杂交分子检测法鉴定抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等个体水平的鉴定42类类型型步骤步骤 检测内容检测内容方法方法结果显示结果显示分分子子检检测测第一第一步步目的基因是否进目的基因是否进入受体细胞入受体细胞DNADNA分子杂交分子杂交（DNADNA和和DNADNA之间）之间）是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带第二第二步步目的基因是否转目的基因是否转录出录出mRNAmRNA分子杂交技术分子杂交技术（DNADNA和和mRNAmRNA之间）之间）是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带第三第三步步目的基因是否翻目的基因是否翻译出蛋白质译出蛋白质抗原抗原抗体杂交抗体杂交是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带个个体体水水平平鉴鉴定定 包括抗虫、抗病的包括抗虫、抗病的接种实验接种实验，以确定是否有抗性以及，以确定是否有抗性以及抗性的程度；抗性的程度；基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。否相同等。v目的基因的表达和检测43课堂练习1、有关基因工程的叙述中，错误的是()A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶A44课堂练习2、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （）A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达C【拓展深化】只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对45课堂练习即时应用(随学随练，轻松夺冠)3(2009年高考浙江卷)下列关于基因工程的叙述，错误的是()A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达D462/1/2023可编辑修改47